MOLECULAR

FLUORESCENCE
SPECTROSCOPY
 DISUSUN OLEH :
1. Denisda Nabhan A. (I0520020)

2. Fretty Lambang W. (I0520035)

3. Kanindra Prahaspati (I0518052)

4. Novan Aldian R. P. (I0520083)

 01 02
Hasil Kuantum dan
03
Prinsip Fluoresensi Intensitas Fluoresensi
Masa Hidup

04
Quenching, pemutihan
05
Transfer Energi
06
Pemulihan Fluoresensi
dan Kejenuhan Resonansi Fluoresensi Setelah Photobleaching
(FRET) (FRAP)

07
Fluorofor Biologis
08 09
Instrumen Fluoresensi Aplikasi
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
A.LUMINESENSI
I. Emisi Foton dari elektronik dalam keadaan
eksitasi.
II. Terdapat dua jenis Lumin, antara
lain :
a. Relaksasi dari eksitasi singlet
b. Relaksasi dari eksitasi triplet
1. PRINSIP
FLUORESENSI
III. Keadaan Singlet dan Triplet
a. Keadaan Dasar : dua elektron per
orbital; elektron memiliki putaran
berlawanan dan berpasangan
b. Keadaan Eksitesi Singlet : Elektron
dalam orbital energi yang lebih tinggi
memiliki putaran yang berlawanan
orientasi
1. PRINSIP
FLUORESENSI
c. Keadaan Eksitasi Triplet : Elektron
valensi tereksitasi bisa secara
spontan membalikkan putarannya
(spin flip). Proses ini disebut
persimpangan antar sistem. Elektron
di kedua orbital sekarang memiliki
orientasi putaran yang sama
1. PRINSIP
FLUORESENSI
B. JENIS DARI EMISI
I. Fluoresensi : Kembali dari eksitasi
singlet ke keadaan dasar tidak
membutuhkan perubahan dalam
orientasi putaran (lebih umum
relaksasi)
1. PRINSIP
FLUORESENSI
II. Phosphoresence : Kembali dari eksitasi
triplet ke keadaan dasar; elektron
membutuhkan pengubahan orientasi
putaran.
III. Tingkat emisi Flouresensi lebih cepat
dari Phosphoresence
1. PRINSIP
FLUORESENSI
C.  POPULASI DARI KEKUATAN ENERGI
I. Rasio dari molekul dalam keadaan
atas dan bawah

k = 1.38 * J/K
ΔE = Tingkat energi pemecahan
1. PRINSIP
FLUORESENSI
D. EKSITASI
I. Cahaya diserap untuk sampel yang
dilarutkan, berlaku hukum Beer-
Lambert
a. Besarnya simbol menggambarkan
peluang absorpsi
b. Panjang gelombang dari simbol Ɛ
bergantung pada spektrum absorpsi
1. PRINSIP
FLUORESENSI
 
b. Panjang gelombang dari simbol Ɛ
bergantung pada spektrum absorpsi:

Ɛ = Koefisien mol absorpsi (1/M cm)

C = Konsentrasi
l = Panjang area
1. PRINSIP
FLUORESENSI
 
II. Prinsip Frank-Condon
Proses penyerapan berlangsung
pada skala waktu ( s) jauh
lebih cepat daripada getaran
molekuler.
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
E.  RELAKSASI NON RADIASI
I. Elektron dinaikkan menjadi tingkat
getaran yang lebih tinggi di S1
daripada vibrasi tingkat dasar.
II. Penonaktifan getaran terjadi melalui
tabrakan antarmolekul.
- Skala waktu s (lebih cepat
daripada fluoresensi).
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
F.  EMISI
I. Molekul berelaksasi dari keadaan
vibrasi terendah menuju vibrasi dasar
(s).
II. Energi dari foton yg terpancarkan lebih
rendah dari energi foton biasanya.
1. PRINSIP
FLUORESENSI
III. Spektrum Emisi
a. Untuk panjang gelombang yang
sudah dieksitasi, transisi emisi
didistribusikan selama terjadinya
perbedan tingkat energi vibrasi.
b. Untuk panjang gelombang eksitasi
tunggal bisa diukur melalui
spectrum emisi fluoresensi.
1. PRINSIP
FLUORESENSI
IV. Stokes Shifts
a. Lampu fluoresensi bergeser merah
(panjang gelombang lebih panjang
dari cahaya eksitasi) relatif terhadap
cahaya yang diserap.
b. konversi internal dapat
mempengaruhi stokes
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
G. ATURAN GAMBAR CERMIN
I. Tingkat vibrasi dalam keadaan eksitasi
dan keadaan dasar adalah serupa.
II. Spektrum absorpsi mencerminkan
tingkat getaran keadaan elektro
tereksitasi.
III. Spektrum emisi mencerminkan tingkat
getaran dari keadaan dasar elektronik.
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
H. KONVERSI INTERNAL VS EMISI
FLUORESENSI
I. Saat energi elektronik meningkat
tingkat energi juga ikut naik.
a. Tumpang tindih antara getaran
tinggi tingkat energi Sn-1 dan
getaran rendah.
1. PRINSIP
FLUORESENSI
 
b. Tumpang tindih ini membuat transisi
antar tingkat sering terjadi
II. Konversi internal : transisi antar tingkat
yang memiliki jumlah yg sama
- Skala waktu detik (lebih cepat
dari proses fluoresensi)
1. PRINSIP
FLUORESENSI
III. Aturan gambar cermin hanya berlaku pada
saat eksitasi S0 ke S1 terjadi.
IV. Deviasi dari aturan cermin dapat dilihat saat
s0 ke s2 atau transisi ke tingkat yg lebih tinggi.
1. PRINSIP
FLUORESENSI
1. PRINSIP
FLUORESENSI
I. PERSIMPANGAN ANTARSISTEM
I. Merujuk pada Persilangan antar system transisi
non-radiasi antara keadaan multiplisitas yang
berbeda.
II. Ini terjadi melalui pembalikan putaran dari electron
tereksitasi yang dihasilkan oleh dua elektron tidak
berpasangan dengan orientasi putaran yang sama,
menghasilkan keadaan triplet.
 1. PRINSIP
FLUORESENSI
III. Transisi antar tingkat yang berbeda
multiplisitas adalah terlarang.
IV. Spin-orbit menurunkan tingkat
"kemurnian" dan membuat semakin
terjadinya persimpangan antarsistem.
V. T1 → S0 transisi juga dilarang →
umur T1 secara signifikan lebih besar
dari umur S1(10-3-102 detik).
 2. HASIL
KUANTUM
DAN MASA
HIDUP
2.HASIL KUANTUM DAN
MASA HIDUP
A.  Hasil kuantum dari fluoresensi dapat
dituliskan:
ɸf =
ɸf =
*jika tidak ada persimpangan hasil ɸf = 1
2.HASIL KUANTUM DAN
MASA HIDUP
 
- Masa hidup radiasi, Tr, berhubungan dengan kr
Tr =
- Masa hidup fluoresensi adalah rata rata dari
waktu yg digunakan molekul untuk melakukan
eksitasi
Tf =
2.HASIL KUANTUM DAN
MASA HIDUP
B. Metode umur hidup fluoresensi
I. Eksitasi pendek diikuti dengan interval
selama fluoresensi yang dihasilkan
diukur sebagai sebuah fungsi waktu.
II. Sediakan tambahan dimensi dari
informasi yg hilang pada pengukuran
spektrum.
2.HASIL KUANTUM DAN
MASA HIDUP
III. Sensitif terhadap biokimia dan
microenvironment, termasuk pH
lingkungan, okigenisasi, dan ikatan
IV. Masa hidup tidak dipengaruhi variasi
dari intensitas eksitasi
V. Kompatibel dengan pengukuran secara
klinis
3. INTENSITAS
FLUORESENSI
 3. INTENSITAS
FLUORESENSI
A.  Intensitas terserap untuk larutan terlarut
- Tingkat penyerapan kecil
- Hukum Beer-Lambert
F(λx,λm) =
Z = Faktor Instrumental ɸ = Hasil Kuantum
Io = Intensitas Cahaya Biasa C = Konsentrasi
Ɛ = Koefisien Molar Ekstasi L = Panjang Area
 3. INTENSITAS
FLUORESENSI
I. Spektrum emisi
-Tahan gelombang memaafkan tetap memindai emisi
-Laporan pada profil spektral fluoresensi
-Memantulkan sinar fluoresensi quantum Φk(lm)
II. Spektrum eksitasi
-Tahan panjang gelombang tetap, deklamasi scan
-Laporan mengenai struktur penyerapan
mencerminkan kepunahan molar koefisien, ε(lx)
 3. INTENSITAS
FLUORESENSI
III. Matriks emisi daya (EEM)
-Komposit
-Representasi yang bagus dari solusi multifluorophore
 4. QUENCHING,
PEMUTIHAN, DAN
KEJENUHAN
 4. QUENCHING, PEMUTIHAN,
DAN KEJENUHAN
A. QUENCHING
-Molekul aktif yang relaks ke tanah melalui jalur nonradiatif
menghindari emisi fluoresensi (getaran, tabrakan, dan
persimpangan antar sistem).
-Molekuler oksigen quenches dengan meningkatkan kemungkinan
persimpangan antar sistem.
-Pelarut kutub seperti air pada umumnya memadamkan fluoresensi
dengan memberikan orientasi ke wilayah lain
 4. QUENCHING, PEMUTIHAN,
DAN KEJENUHAN
B. PEMUTIHAN (PHOTOBLEACHING)
-Didefinisikan sebagai kerusakan ireversibel dari
pembongkaran fluorophore
-Proses Photobleaching bukan masalah besar asalkan
jendela waktu untuk pemutusan sangat singkat
(beberapa ratus mikrodetik)
 4. QUENCHING, PEMUTIHAN,
DAN KEJENUHAN
C. EKSITASI SATURASI
-Tingkat emisi bergantung pada waktu molekul tetap berada
dalam keadaan terus - menerus (The excited state lifetime f)
-Saturasi optik terjadi ketika tingkat ekskreasi melebihi
timbal balik f
 4. QUENCHING, PEMUTIHAN,
DAN KEJENUHAN
-Molekul-molekul yang tetap berada dalam aliran cahaya
untuk jangka waktu yang lama memiliki kemungkinan
yang lebih tinggi dari persimpangan antar negara dan
menjadi bercahaya
 5. TRANSFER
ENERGI
RESONANSI
FLUORESENSI
(FRET)
 5. TRANSFER ENERGI RESONANSI
FLUORESENSI (FRET)
A.Non radiatif energi transfer : proses kuantum mekanik
resonansi antara transisi dikutub
-Efektif antara 10-100 saja
-Spektrum emisi dan pemutusan harus tumpang tindih secara
signifikan
-Transfer Donor non-radiasi pada penerimanya
 5. TRANSFER ENERGI RESONANSI
FLUORESENSI (FRET)
-FRET sangat sensitif terhadap jarak antara donor dan penerima,
oleh karena itu merupakan alat yang sangat berguna untuk
mempelajari dinamika molekuler
 6. PEMULIHAN
FLUORESENSI
SETELAH
PHOTOBLEACHING
(FRAP)
 6. PEMULIHAN FLUORESENSI
SETELAH PHOTOBLEACHING (FRAP)
A. Teknik yang berguna untuk mempelajari sifat transportasi
dalam sel, terutama difusi protein transmembran
-FRAP dapat digunakan untuk memperkirakan makan difusi, dan
fraksi molekul yang mobile/immobile juga dapat digunakan
untuk membedakan antara transportasi aktif dan difusi
 6. PEMULIHAN FLUORESENSI
SETELAH PHOTOBLEACHING (FRAP)
B. Prosedur
-Labeli molekul dengan fluorophore
- Pemutih (Penghancur) Fluorophore adalah daerah yang jelas
dengan laser intensitas tinggi
-Gunakan sinar yang lebih lemah untuk memeriksa inti
fluoresensi sebagai fungsi waktu
7. FLUOROFOR
BIOLOGIS
7. FLUOROFOR BIOLOGIS
A. Endogen Fluorofor
- Asam amino
- Protein struktural
- Enzim dan co-enzim
- Vitamin
- Ipids
- Porphyrins
7. FLUOROFOR BIOLOGIS
B. Eksogen Fluorofor
- Pewarna sianin
- Photosensitive
- Penanda molekul (GFP)
Dan sebagainya
8. INSTRUMEN
FLUORESENSI
8. INSTRUMEN FLUORESENSI
A. Fluorescence adalah metode yang sangat peka (bisa
mengukur analisis konsentrasi 10-8 M)
B. Penting untuk meminimalkan gangguan dari:
-Latar belakang fluoresensi dari pelarut.
-Kebocoran cahaya dalam instrumen
-Penyimpangan cahaya yang tersebar oleh solusi turbid
8. INSTRUMEN FLUORESENSI
C. Instrumen tidak menghasilkan spektra yang ideal :
-Jika keluaran spectral non-seragam dari sumber cahaya
-Efisiensi tergantung panjang gelombang dari detektor dan
unsur optik
8. INSTRUMEN FLUORESENSI
A. Komponen utama untuk fluorescence instrument :
I. Sumber iluminasi :
- Broadband (Lampu Xe)
- Monokromatik (LED, Laser)
II. Pengiriman cahaya ke sampel :
- Lensa/cermin
- Serat optik
8. INSTRUMEN FLUORESENSI
III. Pemisahan panjang gelombang (berpotensi untuk
perangsangan dan emisi) :
- Filter
- Monokromator
- Spektrograf
IV. Detektor :
- PMT
- Kamera CCD
9. APLIKASI
9. APLIKASI
A. Tes Definisi
9. APLIKASI
B. Deteksi Lesi Pre-Kanker Serviks
9. APLIKASI
B. Deteksi Lesi Pre-Kanker Serviks
9. APLIKASI
C. Pendeteksian dengan karsinoma paru-paru pada
kondisi menggunakan sistem penayangan LIFE
9. APLIKASI
- Autofluoresensi meningkatkan kemampuan untuk membatasi
lesi kecil neoplastik
9. APLIKASI
 
D. Pengukuran masa hidup fluoresensi
- Masa hidup autofluoresensi diukur dari jaringan usus besar
di vivo
- Analisis melalui ikatan kembali :
Dua model komponen dengan kerusakan eksponansial
9. APLIKASI
9. APLIKASI
D. Pengukuran masa hidup fluoresensi
- Masa hidup yang digunakan untuk mendeteksi adenomatosa
dari polip non-adenomatous di vivo
τ 1 = 6.03 ns τ 2 = 0.72 ns
Area 1 = 0.42 Area 2 = 0.58
9. APLIKASI
 SEKIAN
TERIMAKASIH