KROMATOGRAFI

SARAH
PE MB I MB I N G : D R . D I A N W I DYA N IN G R UM , S P. PK
 SEJARAH KROMATOGRAFI

Teknik kromatografi pertama kali dikenalkan pada tanggal

8 Maret 1903 oleh Mikhail Tsweet yang mempresentasikan
suatu kategori baru dalam fenomena adsorbsi dan
aplikasinya dalam analisis biokemikal
Suatu pigmen tanaman dapat terpisahkan dengan jalan
adsorbsi dalam suatu kolom kalsium karbonat menjadi
sebuah kumpulan warna  proses ini disebut dengan
istilah kromatografi
 DEFINISI KROMATOGRAFI

Kromatografi merupakan suatu proses fisik pemisahan dan

penguraian campuran berdasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen campuran tersebut diantara 2 fase yaitu fase
diam dan fase gerak
FASE GERAK : membawa campuran bergerak melalui lapisan atau
kolom yang mengandung fase diam sehingga terjadi kontak dengan
absorben yang selektif pada fase diam
Selama fase gerak melewati fase diam, campuran dapat mengalami salah
satu dari tiga hal berikut :
1. campuran hanya berada pada fase diam tanpa ada migrasi
2. hanya berada pada fase gerak dengan bermigrasi bersama fase gerak
3. beredar diantara dua fase

Komponen/ zat terlarut dengan afinitas tinggi terhadap fase diam akan
berada lebih lama pada fase diam dibandingkan dengan komponen
dengan afinitas rendah terhadap fase diam terpisahnya komponen
dengan afinitas rendah dari komponen berafinitas tinggi terhadap fase
diam
 Pemisahan Komponen
Pemisahan komponen berdasarkan sifat fisika senyawa, antara lain:
1. kelarutan senyawa dalam pelarut
2. interaksi senyawa dengan senyawa lain yang bertindak sebagai fase
diam
3. polaritas senyawa
4. titik didih senyawa
Keberhasilan pemisahan ditentukan oleh :
1. definisi kelarutan
2. jumlah senyawa yang dipisakan
3. ketepatan pemilihan senyawa yang dapat berinteraksi dengan
senyawa yang akan dipisahkan
4. ketepatan pemilihan peralatan pemisahan
 Pemakaian Kromatografi :

1. Analitik:
= Kualitatif  Mengetahui identitas suatu analit
= Kuantitatif  Menentukan kadar analit
2. Preparatif:
= untuk mendapatkan komponen murni
 Kromatografi

Planar Kolom

Kertas Lapis Tipis Gas (GC) Liquid (LC)

 Kromatografi di dalam bentuk tempat

Komatografi Kolom : Kromatografi kolom merupakan

teknik pemisahan di mana tempat stasioner dalam
tabung.

Kromatografi Planar
1. Kromatografi Kertas
2. Kromatografi Lapis Tipis
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi pigmen
tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas
kaca untuk memisahkan komponen
kimia dan bahan lainnya

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa
berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh
tiap-tiap puncak dalam grafik di bawah ini.
Paper Chromatography
Dapat digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen
tinta, pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat
lain
Cairan campuran yang akan dipisahkan diteteskan pada kertas
kromatografi (atau kertas saring) dengan alat penetes
Kromatogram yang terbentuk diletakkan pada bagian bawah dari
kertas pada suatu tampungan yang mengandung zat pelarut yang
sesuai.
Zat pelarut ini merembes keatas kertas dengan prinsip kapilaritas
Gambar Kromatografi Kertas
Kromatografi Lapis Tipis
 Dalam Kromatografi Lapis Tipis, lapisan tipis partikel terdri dari
bahan seperti silika gel yang disebarkan secara merata pada pelat
kaca atau lembaran plastik atau aluminium.
Lapisan adsorben ini dikenal sebagai fase diam.
https://drgpinstitute.files.wordpress.com/2014/12/tlc.png
 KROMATOGRAFI
KOLOM
Fase diam pada kromatografi kolom merupakan silika murni atau
polimer, dapat berikatan secara kimiawi atau melapisi partikel
pendukung
Fase diam pada kromatografi kolom ini dapat ”terbungkus” dalam pipa
atau melapisi bagian dalam dari pipa
Pemberian nama pada teknik ini tergantung dari fase geraknya yang
berupa gas atau cairan, yaitu kromatografi gas (gas
chromatography/GC) jika fase gerak berupa gas dan kromatografi cair
(liquid chromatography/LC) jika fase gerak berupa cairan
 KROMATOGRAFI GAS (GAS
CHROMATOGRAPHY/GC)

Untuk pemeriksaan komponen yang mudah menguap atau komponen

yang dapat dirubah menjadi bentuk uap
Fase gerak berupa gas digunakan untuk melewati cairan yang bercampur
dengan zat terlarut yang mudah menguap, biasanya berupa gas yang
bersifat lembam misalnya nitrogen, helium, hidrogen, argon sebagai gas
pembawa
Retensi komponen pada GC diukur dengan tekanan uap dan mudahnya
zat tersebut menguap, yang tergantung pada interaksi dengan fase diam
Dua tipe fase diam yang biasa digunakan pada GC, yaitu gas-solid
chromatography/GSC dan gas-liquid chromatography/ GLC
 KROMATOGRAFI GAS (GAS
CHROMATOGRAPHY/GC)

Komponen GC terdiri dari lima komponen utama :

1. silinder gas sebagai fase gerak,
2. injektor,
3. sebuah kolom,
4. sebuah detektor dan
5. sebuah komputer untuk tambahan data
Komponen sistem kromatografi gas
G = silinder gas; PR1 dan PR2 = regulator; PG = pengatur
tekanan; NV = katup untuk penyesuaian aliran rerata gas
 Gas-solid chromatography/GSC

absorben berupa benda padat, material yang sama

(seperti alumunium, silika, atau karbon aktif) bekerja
sebagai fase diam sekaligus fase pendukung
Pada GSC pemisahan berlangsung di awal dengan
perbedaan absorbsi pada permukaan fase benda
padat.
Jenis ini merupakan pertama kali dikembangkan,
tetapi jarang digunakan karena penimbunan
polaritas dan cairan yang sulit menguap oleh kolom
 Gas-liquid chromatography/ GLC

cairan non volatil (tidak mudah menguap) terlapis

atau terikat secara kimiawi pada partikel yang
terdapat pada kolom atau terikat langsung di dinding
kolom kapiler.
Pemisahan berlangsung awal dengan perbedaan
kelarutan antara fase gerak berupa gas dan fase diam
berupa cairan.
GLC menggunakan fase cair berupa polimer,
hidrokarbon, fluorokarbon, kristal cair dan lelehan
garam organik yang melapisi material benda padat
 KROMATOGRAFI CAIR
(LIQUID CHROMATOGRAPHY/LC)

Teknik LC menggunakan suhu yang lebih rendah untuk pemisahan dan

memberikan pemisahan yang lebih baik untuk komponen yang labil pada
suhu tertentu.
Lebih mudah untuk memperoleh kembali suatu sampel pada LC
dibanding GC
Sampel dapat dipindahkan dan diproses lebih lanjut atau dianalisis ulang
dalam kondisi yang berbeda
 HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
Metoda baru dikembangkan untuk memisahkan komponen yang
bersifat mirip antara yang satu dengan yang lain
Teknik baru mulai dikembangkan : separasi sampel, identifikasi,
purifikasi dan pengukuran dengan menggunakan teknik yang telah ada
Penambahan komputer dan otomatisasi ditambahkan pada alat HPLC.
Adanya tipe kolom tambahan seperti mikrokolom, kolom afinitas
memberikan kinerja alat dan hasil yang lebih baik pada dekade akhir ini
 Tujuan pemeriksaan dengan HPLC
Untuk penelitian bioteknologi, biokimiawi dalam bidang farmasi
Campuran yang dapat dipisahkan oleh HPLC meliputi molekul-molekul,
senyawa ionik, senyawa yang tidak stabil (jika dipanaskan akan
mengalami peruraian) sebagai contoh asam amino, asam nukleat,
hidrokarbon, karbohidarat, pesticida, steroid, antibiotik dan senyawa
organik. Dengan demikian HPLC digunakan untuk berbagai macam
industri termasuk kosmetik, energi, makanan dan industri lingkungan
HPLC digunakan dalam pengkuran kadar vitamin A, C, D, E, asam folat,
biotin, betain dan asam lemak esensial
HPLC digunakan untuk pemisahan hemoglobin : pemeriksaan HbA1C
(pasien DM), serta dapat juga untuk pemisahan jenis lain hemoglobin
untuk pasien hemoglobinopati atau thalassemia
 Komponen HPLC
5 komponen utama yaitu :
1. pompa/pump,
2. injektor/injector,
3. kolom/column,
4. detector/detector,
5. elusi gradien
1. Pompa (pump)
Komponen sangat penting dalam HPLC.
Persyaratan :
 tekanan maksimum 6000 psi
 bebas getaran/ dilengkapi alat pereda getaran
 terbuat dari bahan kimia yang tahan terhadap fase gerak,
mempunyai ruang pompa Cecil, sehingga volume fase gerak yang
tertahan sedikit
 Menghasilkan kecepatan aliran yang tetap dengan kesalahan 0,5%.
Untuk pemakaian analisis mempunyai keluaran 1-10 ml/menit dan
untuk preparatif mempunyai keluaran 200 nl/menit.
1. Pompa (pump)
Dua tipe pompa yang digunakan,
1. Kinerja konstan (constant pressure) dan
2. Pemindahan konstan (constant displacement)
 Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
pompa reciprocating (menghasilkan suatu aliran yang
berdenyut teratur/ pulsating) dan pompa syringe
(memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi
reservoirnya terbatas)
2. Injektor (injector)
Injektor merupakan bagian alat dimana cuplikan yang
dianalisis dimasukkan ke dalam alat tersebut
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
 Stop-Flow:
 Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi.
 Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
2. Injektor (injector)
 Septum:
 Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair.
 Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor)
dapat menyebabkan penyumbatan.
 Loop Valve:
 Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai
 volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
3. Kolom (Column)

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel atau dari bahan gelas

Kolom dari bahan gelas umumnya tidak tahan terhadap
tekanan, dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga
digunakan temperatur lebih tinggi
Ukuran kolom antara 10-30 cm, berbentuk lurus, diameter 4-
10mm dan ukuran partikel dalam kolom 5-10 μm
Ada dua jenis packing, yaitu partikel porous dan partikel
pellicular
3. Kolom (Column)

Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk
kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100
cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm.
Dewasa ini ada yang 5 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau
lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
 Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pemakaian
kolom :
◦ fase gerak harus sesuai dengan sifat kolom,
◦ menggunakan tekanan maksimum yang diijinkan,
◦ jangan sampai jatuh atau terbentur karena akan
merusak struktur packing kolom,
◦ jangan sampai terbalik megalirkan fase gerak
 Tipe kolom yang digunakan pada HPLC

JENIS KOLOM DIAMETER (MM) VOLUME ALIR OPTIMAL

Standar 4,6 1,25 mL/menit
4,0 1,0 mL/menit

Lubang sempit 3,0 0,6 mL/menit

2,0 200 μL/menit

Lubang mikro/kapiler 1,0 50 μL/menit

0,5 12 μL/menit
0,3 4 μL/menit
4. Detektor (Detector)
untuk mendeteksi komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan
menghitung kadamya (analisis kuantitatif)
Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan yang rendah, kisar
respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa.
Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa
dengan range yang lebih luas.
Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.
Detektor-detektor lainnya antara lain detector fluororesensi, detektor indeks bias,
detektor infra merah dan lain-lain sesuai dengan jenis sampel yang akan dianalisis
5. Elusi Gradien

penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis

kromatografi berlangsung.
Efek dari elusi gradien adalah mempersingkat waktu retensi
dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom.
Keuntungan elusi eradien antara lain waktu total analisis
menjadi berkurang, resolusi persatuan waktu setiap senyawa
dalam campuran bertambah, ketajaman peak bertambah dan
efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
 Prosedur Pemeriksaan HPLC
1. Preparasi sampel
2. Preparasi fase gerak
3. Mencampurkan sampel dengan pelarut
4. Sampel akan menuju ke detektor melalui kolom dan sampel akan
mengalami pemisahan dalam kolom
5. Mendeteksi senyawa yang terlarut dalam pelarut yang keluar dari
kolom oleh detektor
1. Preparasi sampel

Sampel harus jernih, larutan sampel harus disaring dengan

penyaring 0,45-0,5 μ agar tidak ada partikel yang dapat
mengotori kolom maupun menyumbat kapiler penghubung
kolom serta lubang jarum penyuntik.
Sampel juga harus bebas dari partikel padat yang dibebaskan
dengan ultra filtrasi atau dengan pemusingan. Sampel dari bahan
biologis harus dibebaskan dari lemak dan protein karena kedua
senyawa tersebut bermolekul besar, sehingga dapat merusak
kolom
 2. Preparasi fase gerak

Memilih pelarut yang sesuai dengan senyawa yang akan

dipisahkan
Menghilangkan/ membebaskan udara/ gas dari pelarut agar
tidak mempengaruhi pembacaan hasil. Penghilangan gas
dapat dilakukan dengan mengalirkan gas inert (helium) dengan
keluaran yang kecil. Sistem yang lebih lengkap disertai dengan
penyaringan debu dan partikulat.
Mengalirkan pelarut menuju kolom
Memperbesar tekanan aliran pelarut dengan jalan memompa
3. Mencampurkan sampel dengan pelarut

Jarum injeksi diharapkan tidak bocor karena akan

mempengaruhi hasil
Jarum injeksi diharapkan tidak bengkok karena dapat merusak
tempat injeksi
Alat injeksi/ syringe harus bebas kontaminasi, sehingga tiap akan
dipakai harus dibersihkan dengan pelarut tertentu (biasanya
metanol)
Angka yang menunjukkan ukuran harus jelas dibaca sehingga
pengukuran volume dapat tepat
4. pemisahan sampel dalam kolom

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui

kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.
Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak
yang maksimum dari senyawa itu
Mekanisme pemisahan seperti telah dijelaskan sebelumnya
adalah fase gerak mendorong komponen masuk ke dalam
kolom dan packing material menahan komponen di dalam
kolom sehingga terjadi pemisahan
 INTERPRETASI HASIL
Hasil direkam sebagai rangkaian puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap
sinar UV
Sepanjang kondisi kolom terkontrol dengan baik, waktu retensi dapat
digunakan untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, dan
membandingkan senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada
kondisi yang sama
Puncak ini juga dapat digunakan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang
dihasilkan
Alur HPLC dan keluaran berupa kromatogram
Konsentrasi komponen
tR1 & tR2 = waktu retensi yang belum dikoreksi (dari
awal injeksi sampai puncak)
tR1’& tR2’ = waktu yang telah dikoreksi (diperoleh
dari waktu retensi komponen yang tidak ditahan)