TEKNIK

IDENTIFIKASI ASAM
Dosenpengampu: Venny Patricia s.pd,m.kes

NUKLEAT Kelompok 9:
Azrul Rasyid Kamal
Latifah
Linda Yuliantisari
Siti Nurus sya'adah
 ANALISIS ASAM NUKLEAT
SECARA KUANTITATIF
MENGGUNAKAN
SPEKTROFOTOMETER
adalah cara termudah dan akurat untuk menentukan konsentrasi
DNA, karena basa nitrogen dapat menyerap sinar UV, semakin
tinggi konsentrasi
DNA atau RNA dalam larutan, maka sinar UV akan semakin
menyerap.

P E R A L ATA N
spektrofotometer yang dilengkapi dengan lampu UV
kuvet (tabung kaca atau plastik) transparan UV
(tergantung jenis intsrumen yang digunakan)

larutan asam nukleat yang telah dimurnikan.

 PEMBACAAN : LANGKAH-LANGKAH
dilakukan pada 260 nm yang mana DNA
menyerap cahaya yang siapkan sampel DNA atau RNA hasil
paling kuat, dan nilai yang dihasilkan isolasi
memungkinkan seseorang untuk teteskan pada spektrofometer UV-Vis
memperkirakan nanodrop 2000
konsentrasi larutan. Untuk memastikan
bahwa jumlahnya cukup berguna, maka
membaca
pada 260 nm harus berada dalam
jangkauan linier instrumen (umumnya nilai
absorban
antara 0,1 sampai 1,0).

RUMUS MENGUKUR
KONSENTRASI ASAM Keterangan:
NUKLEAT Å260 = Nilai absorbansi pada λ 260 nm
33 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0
sebanding dengan 33 μg untai tunggal
Keterangan: DNA
Å260 = Nilai absorbansi pada λ 260 nm [ssRNA] = Å260 x 40 x faktor
50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 pengenceran
PERALATAN sebanding dengan 50 μg untai ganda DNA Keterangan:
Å260 = Nilai absorbansi pada λ 260 nm
YANG DI GUNAKAN per mL.
40 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0
UNTUK M ETODE sebanding dengan 40 μg RNA per mL
ABSORBANSI
 ELEKTROFORESIS GEL
AGAROSE
• yaitu metode langkah pengujian sampel DNA secara kualitatif
• suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan
menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.
• Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul
yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel
agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif
 FA K TO R K E C E PATA N LA J U
MIGRASI

• arus listrik (semakin besar arus listrik yang digunakan maka laju migrasi akan semakin
cepat)
• ukuran molekul ( semakin kecil ukuran suatu molekul maka laju migrasinya akan semakin
• cepat)
• bentuk molekul ( molekul yang memiliki rasio axial tinggi memiliki laju migrasi yang lebih
lama daripada molekul berbentuk spherical)
• konsentrasi gel (semakin rendah konsentrasi gel maka laju migrasi semakin cepat karena
gesekan molekulnya berkurang)
• adanya pewarna etidium bromida di gel dapat menyebabkan pengurangan kecepatan laju
migrasi
• komposisi larutan buffer ( larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas
sehingga aliran listrik dan laju migrasi molekul pun meningkat)
 PERSENTASE AGAROSE
 Persentase agarose yang digunakan tergantung dari ukuran
fragmen yang akan diperiksa. Konsentrasi gel agarose dilihat
dari persentase agarose terhadap volume buffer (w/v),
 normalnya konsentrasi gel agarose berada pada range 0,2% -
3%.
 Gel agarose biasa digunakan untuk memisahkan molekul
DNA yang berukuran 100 bp hingga 20 kbp di dalam medan
magnet secara tidak langsung. Semakin rendah konsentrasi
gel agarose, maka semakin cepat migrasi fragmen DNA. Jadi,
jika tujuan kita adalah untuk memisahkan fragmen DNA
berukuran besar, maka perlu dibuat gel agarose dengan
konsentrasi rendah. Sebaliknya, jika fragmen DNA yang
hendak dipisahkan berukuran kecil, maka perlu dibuat gel
agarose dengan konsentrasi tinggi
 ALAT
TUJUAN ELEKTROFORESIS BAHAN
GEL AGAROSE seperangkat alat elektroforesis
power supply
pada hasil isolasi asam mikropipet 0,5-1-0 beserta tipnya
nukleat : untuk identigfikasi kertas parafilm
kemurnian dan perkiraan UV transilluminator isolat atau DNA/RNA produk
konsentrasi DNA atau RNA kaca mata UV PCR
pada prodek PCR : untuk gelas kimia 250 ml DNA maker
identifikasi produk PCR gelas ukur 100 ml larutan buffer TAE 50 x
amplikon labu ukur 100 ml aquadest
labu erlenmeyer 50 ml etidium bromida
pipet volume 10 ml
pipet ukur loading dye 6x (0,25%
bal , kompor listrik, sarung tangan, bromophenol blue; 0,25%
selotip xylene cyalol; 15% ficoll tipe
4000; EDTA 120 mM)

SOP PEMBUATAN GEL

AGAROSE
Buat 250 mL larutan buffer TAE 1x dengan cara mencampurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml Aquadest.
Buat gel agarose 2% dengan cara menimbang 0,5 g gel agarose kemudian larutkan dalam 25 ml buffer TAE 1x
dan didihkan hingga larut sempurna
Siapkan baki elektroforesis, lekatkan selotip di tiap ujung baki elektroforesis. (Pastikan bahwa selotip melekat
kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki).
Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki dengan posisi hampir menyentuh dasar baki.
Periksalah suhu larutan agarose dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun
hingga sekitar 60°C, tuangkan larutan agarose ke dalam baki elektroforesis, biarkan hingga larutan berubah
menjadi gel yang
padat.
Ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
ELEKTROFORE
SIS
 Masukkan baki yang berisi gel agarose ke dalam tangki elektroforesis
yang telah diisi dengan sisa larutan bufer TAE 1x. (Pastikan bahwa gel Setelah proses elektroforesis selesai, gel agarose
agarose terendam seluruhnya dalam TAE). direndam dalam larutan
 Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. Etidium Bromida 0,01% selama 10 menit.
 Pipet sebanyak 6 μL sampel DNA, 6 μL DNA marker, dan 6 μL Kemudian destaining di dalam 150 mL aquadest
aquades (kontrol negatif), kemudian masing-masing tambahkan 1 selama 10 menit.
μLloading dye 6x. Homogenkan di atas kertas parafilm, kemudian letakkan gel agarose yang telah diwarnai oleh
masukkan ke dalam sumuran gel agarose. Etidium Bromida diatas UV transilluminator.
 Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan Nyalakan UV transilluminator, amati pita-pita
bahwa kabel yang tersambungkan ke kutub negatif berada di dekat DNA yang tervisualisasi
sumuran, sedang kabel yang tersambung ke kutub positif berada jauh
dari sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah
sebaliknya).
 Nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga
diperoleh angka 150 volt dan 30 menit.
 Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol
run pada sumber arus
 Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah
habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan
angkatlah baik dari tangki elektroforesis
 ELEKTROFORESIS
GEL
POLIAKRILAMID untuk memisahkan fragmen
DNA kecil, biasanya berukuran kurang dari 100 base pair (bp). Gel ini biasanya menggunakan
akrilamid berkonsentrasi rendah (< 6%) dan mengandung agen denaturing non ionic (urea
6M). Agen denaturing ini berperan untuk mencegah pembentukan formasi struktur
sekunder oligonukleotida sehingga memungkinkan penentuan massa molekuler yang akurat.
(Afiono, 2009)
Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan gel poliakrilamid antar dua lempeng
kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid dapat
berukuran 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan
elektroforesis dengan cara vertikal.
3 KEUNGGULAN
AGAROSE
kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa dalam
500 pasang basa
Sistem ini dapat menampung sampel lebih besar daripada agarosa
DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat digunakan
untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus. (Soedjadi, 2008).

Gen hasil elektroforesis difiksasi dengan larutan asam asetat 10% (b/v) sebanyak dua (2)
kali masing-masing selama 10 menit.
Gel dicuci tiga (3) kali dengan aqua dan masing-masing selama 2 menit, kemudian
direndam
dalam larutan pewarna (AgNO3 0,1% b/v), formaldehid 0,5% (v/v) selama 30 menit.
Setelah gel dicuci kembali dengan aquades sebanyak 2 kali, gel direndam dalam larutan
developing (Na2CO3 3% (b/v), formaldehid 0,5% (v/v), Natrium tiosulfat 0,002 mg/mL)
pada temperature 4oC sampai pita-pita DNA muncul.
Tahap akhir dari pewarnaan adalah fiksasi dengan menggunakan asam asetat 10% (b/v)
dan pencucian kembali dengan aqua dest .
Gel kemudian dikeringkan di antara 2 plastik selofan
Thank you