TUGAS MEMBRAN

Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes

OLEH
Karsten Seifert, Klaus Fendler, and Ernst Bamberg

Diterjemahkan Oleh
HASANAH OKTAVIA PANE SEPTIANA ENI$ %&' )OSEN PE$*I$*IN+ !" "# ! #

!" "# ! ((

)'& Ir& H& $& Hatta )ahlan, $& Eng

-a.ultas Te.ni. /urusan Te.ni. Kimia 0ni1ersitas Sri2i3aya 4 "!

Transportasi Pengisi Melal i !on Pemin"ahan Protein Mem#ran pa"a S pporte" Soli" Mem#ran $SSM%&
A*ST'AK Sebuah metode baru untu. penyelidi.an ion protein membran pemindahan disa3i.an& Protein membran yang mengandung 5ragmen atau 1esi.el yang teradsorpsi .e membran pendu.ung yang solid& $embran padat didu.ung terdiri dari monolayer lipid pada emas menguap atau emas substrat .aca yang dilapisi dengan mer.aptan dirantai pan3ang 6CH!6 CH4 7mSH, m 8 "(, "97& Spesi5i. .ondu.tansi dan .apasitansi spesi5i. dari membran pendu.ung padat sebanding dengan membran lipid hitam& Namun, membran didu.ung padat memili.i .euntungan dari stabilitas me.ani. 3auh lebih tinggi& A.ti1itas listri. dari bacteriorhodopsin, Na, K:ATPase, H, K:ATPase, dan Ca:ATPase pada membran pendu.ung padat diu.ur dan dibanding.an dengan sinyal yang diperoleh pada .on1ensional disiap.an membran lipid hitam& Hal ini menun3u..an bah2a .edua metode menghasil.an hasil yang sama& $embran didu.ung padat .arena itu merupa.an metode alternati5 untu. meneliti si5at listri. ion protein transmembran pemindahan& Pengantar& Adsorpsi 5ragmen membran atau 1esi.el yang mengandung ion pemindahan protein membran lipid hitam membran 6*;$7 telah diguna.an untu. mempela3ari biaya translo.asi en<im o5these 6misalnya, bacteriorhodopsin 6#, =7, Na, K:ATPase 6""7, Ca:ATPase 6"#77& Kondu.tansi spesi5i. rendah dan .apasitansi spesi5i. yang tinggi *;$ mengarah .e arus .apasiti5 transien setelah a.ti1asi pompa ion& Analisis arus ini telah memberi.an in5ormasi mengenai biaya transportasi selama 'ea.si parsial yang berbeda dari berbagai protein membrane 6#, (, =, "", "4, "#, "=, 497& Keuntungan dari *;$ adalah .ondu.tansi spesi5i. rendah dan yang .apasitansi spesi5i. yang tinggi& rendah .ondu.tansi penting .arena dari .ebisingan latar bela.ang tinggi ter.ait dengan sampel .ondu.tansi tinggi& tinggi tertentu .apasitansi menghasil.an sinyal besar dalam pengu.uran arus 6#7& Ke.urangan utama adalah .etida.stabilan me.anis dan permu.aan .ecil6 & " cm47& Seperti yang ditun3u..an baru:baru ini oleh -lorin dan +aub 6"!7, membran padat pendu.ung 6SS$7 mempertahan.an .apasitansi spesi5i. yang tinggi dan rendah .ondu.tansi tertentu tetapi pada saat yang sama 2a.tu memili.i permu.aan yang besar 6> ,4( cm47 dan me.ani. stabilitas dibanding.an dengan *;$& $engguna.an perang.at ini, biaya transportasi di pompa ion dapat dipela3ari dalam ling.ungan sebanding dengan *;$&

BAHAN DAN METODE Bahan 'imia )iguna.an -os5atidil.olin )iphytanoyl 6PC, sinteti., A1anti ;ipid Polar, Inc, Pelham, A;7, phosphatidylserine 6PS, ota. sapi, A1anti Polar ;ipid, Inc7, dan octadecyl amina 6.emurnian ?=@, 'iedel:)eHaen A+, Seel<e:Hanno1er, /erman7& $onolayers dibuat dari PC dan octadecyl amina 6A B ", berat C2t7 atau PC dan PS 6#B", 1ol C 1ol, PC C PS7 bai. ",(@ dalam n:de.ana& ;arutan lipid dibuat seperti yang di3elas.an di *amberg et al, "?9? 6#7&Semua bahan .imia lainnya dibeli di .elas analitis& )i.urung ATP, yang photolabile, analog a.ti5 ATP diguna.an untu. percobaan dengan ATPase yang berbeda, dibuat dengan metode yang di3elas.an oleh -endler et al&, "?=( 6""7 dan ramah disedia.an oleh E& +rell 6$PI bulu *iophysi., -ran.5urt C $&, /erman7& Purple membran 6P$7 5ragmen mengandung bacteriorhodopsin 6*'7 disiap.an sesuai dengan Stoec.enius dan Kunau, "?A= 6!(7 dan Oesterhelt dan Stoec.enius, "?9# 64=7& P$ suspensi memili.i densitas opti. O) (A= nm : ",A 6.onsentrasi protein A(A Dg&ml :"7&7& Sebuah 5ragmen P$ .has memili.i diameter se.itar ,(, um dan .etebalan :#&= nm 6"9, !A7& -ragmen membran yang mengandung Na, K:ATPase 6.onsentrasi protein 4:! mg ml :", a.ti1itas ATPase 4 mmol Pi Dg&ml:" protein&min:"7 dari babi gin3al disiap.an seperti yang di3elas.an oleh /orgensen, "?9# 64 , 4"7& H, K:ATPase mengandung 1esi.el 6.onsentrasi protein " mgml:"ATPase .egiatan "&9 <imol Pi mg :" protein min:"7 dari perut babi disiap.an seperti yang di3elas.an oleh ;3ungstrom et al&, "?=# 64(7 dan Saccomani et al&, "?99 6!47& Vesi.el yang mengandung Ca:ATPase 6protein .onsentrasi "" mg ml :", a.ti1itas ATPase ,= C Smol Pi:mg:Eprotein min:"7 dari reti.ulum sar.oplasma dari .elinci otot rang.a dibuat menurut Hasselbach dan $a.inose, "?A! 6"(7& The ATPase mengandung 5ragmen membran dan 1esi.el memili.i .has diameter : " >#& Elektro"a emas Pelat .aca 69 F 4( mm47 yang dibersih.an, di.ering.an, diba2a .e suasana o5dichlorodimethyl silan untu. A deti. , dan .emudian disimpan selama A menit pada " ! G C untu. memung.in.an silan untu. berea.si dengan permu.aan .aca& Tersilanisasi .aca piring .emudian tercampur dengan lapisan emas& Sputtering dila.u.an dalam atmos5ir argon ( :9 H "
:!

:!

nm 6"A, !!7& Ketebalan dari 5ragmen adalah nm

torr, dengan menggerutu saat ini !(:#(& "

:!

A dan menggerutu hasil ,4: ,# nm

C s tanpa pendinginan substrat& Ketebalan lapisan emas tersebut yang tera.hir adalah (

sampai "

nm& Prosedur silani<ation membuat hidro5obi. permu.aan .aca dan

mening.at.an stabilitas lapisan emas dalam ele.trolit& Kami mengguna.an mas.er untu. mendapat.an daerah yang sudah ditentu.an bai. tertutup emas pada du.ungan .acaB a meling.ar dis. dengan garis yang menghubung.an tipis 6+ambar " A7 -ilm:5ilm emas baru disimpan diin.ubasi dalam larutan mer.aptan selama A 3am pada ! C& Kami mengguna.an larutan " m$ he.sadesil mer.aptan 6C,A:mer.aptan, -lu.a, Neu: 0lm, /erman7 atau octadecyl mer.aptan 6C"=:mer.aptan, Aldrich, Steinheim, /erman7 dalam etanol& setelah mer.aptan in.ubasi, permu.aan dibilas dengan etanol dan .emudian di.ering.an& Pada tahap ini ele.troda dapat disimpan bebas debu selama beberapa hari tanpa .ehilangan .ualitas yang signi5i.an&

+A$*A' " E.sperimental setup& 6A7 stru.tur $acroscopical dari mer.aptan diperla.u.an ele.troda emas& AgB menghubung.an .a2at pera., -B mengisi ting.at, +B du.ungan .aca, sayaB isolasi coatingI $auB mer.aptan diperla.u.an permu.aan emas& 6*7 0mum e.sperimental setup& CB cu1ette, CEB .ontra ele.troda, EB 5ragmen membran yang mengandung larutan ele.trolitI JB 3endela .uarsa, SB membran pendu.ung yang solid& 6C7 mi.ros.opi. stru.tur SS$ dalam .asus 5ragmen membran teradsorpsi mengandung Na, K: ATPase& +B .aca tersilanisasi, AuB lapisan emas, $B mer.aptan monolayer, ;B monolayer

lipid, $5B 5ragmen membran& 6)7 ;istri. rang.aian e.ui1alen& "P 6t7 adalah arus pompa tergantung 2a.t dihasil.an oleh protein& I 6t7 adalah arus tergantung 2a.tu yangdiu.ur dalam sir.uit luar& SS$ ini ditandai dengan spesi5i. .apasitansi Cp, Cm dan oleh conductances spesi5i. +P, +m dari 5ragmen membran dan SS$, masing:masing& Lipi" (oating "an SSM Permu.aan emas o5an 2ilayah O-A 8 ,4( cm4 dilapisi dengan " $al o5an larutan lipid yang tepat sementara piring .aca diperla.u.an hori<ontal& Selama prosedur ini ele.troda ter.ena udara& In.ubasi 2a.tu adalah antara 4 dan ! menit& Kemudian ele.troda dilapisi emas lipid adalah diba2a .e ele.trolit diisi te5lon cu1ette seperti ditun3u..an pada +ambar& " *& Posisi 1erti.al dari ele.troda emas men3amin lari .elebihan solusi lipid dan pembentu.an monolayer& The dilapisi lipid ele.troda emas terhubung .e noise penguat arus rendah 6gainB " A:"
=

V C A7 melalui AgCAgCl: atau platini<ed Pt:ele.troda& Output sinyal dari penguat arus

disaring 6risetimeB " $s:" ims7, dire.am dengan osilos.op penyimpanan digital, disimpan, dan dianalisis dengan .omputer pribadi& ) *ette set p "an pen(aha+aan The te5lon cu1ette 6+ambar " *7 memili.i 1olume >4& ml& suhu di3aga pada 4" G C melalui termostat 6'CS, $+%:;auda, ;auda C Konigsho5en, /erman7& Sebuah 3endela .uarsa memung.in.an le2atnya terlihat dan sinar 0V& 0ntu. percobaan dengan mengguna.an pencahayaan *' stasioner, halogen 6H+; "4 V 4( %, Philips, Eindho1en, *elanda7 atau tinggi Te.anan Hg:lampu 6H*O 4 %C4I Osram, +ermany7diguna.an& Itu bandpass spe.tral dibatasi oleh perlindungan panas 6K+!I Schott, $ain<, +ermany7dan 5ilter cut:o55 6 SS$ adalah # m%Ccm4 66#?( K L K 9 #?( nm, Schott7& radiasi tersebut pada permu.aan nm7&7& Irradiances rendah diperoleh dengan 5ilter

.epadatan netral 6 &":9 @I Transmisi Schott7& Si,at SSM Seperti di3elas.an dalam *ahan dan $etode, lapisan lipid dibentu. pada mer.aptan permu.aan emas diperla.u.an pada du.ungan .aca& Hal ini dicapai dengan .ombinasi dua metode yang berbeda dari pera.itan monolayer pada padat mendu.ung& Telah terbu.ti bah2a mer.aptan monolayers mera.it spontan pada permu.aan emas bersih dari solusi dari mer.aptan al.il dalam etanol& $ole.ul:mole.ul mer.aptan mung.in

teri.at .o1alen .e permu.aan dan membangun padat stru.tur .ristal dua dimensi dengan al.il:rantai miring .e permu.aan normal ! 6", 4, !, 4#, #47& Pembentu.an monolayers lipid pada .aca planar al.yllated permu.aan 6#"7& Al.ylsilanes dirantai pan3ang diguna.an untu. memperoleh permu.aan .aca hidro5obi. dan lipid monolayer Pembentu.an di3elas.an oleh intera.si antara para al.ylchains hidro5obi. dari silan dan mole.ul lipid& 0ntu. pengu.uran listri. di3elas.an di sini, logam permu.aan yang diperlu.an& Permu.aan emas yang bersih hidro5ili. 6!#7& Permu.aan emas dibuat hidro5obi. oleh al.yllation dengan mer.aptan dirantai pan3ang dalam etanol& )alam cara yang sama seperti monolayers lipid mera.it al.yllated permu.aan .aca 6#"7, .ita mengasumsi.an bah2a monolayer adalah terbentu. pada mer.aptan permu.aan dilapisi emas dengan spontan sel5: assembly& -lorin dan +aub dibenar.an asumsi ini setida.nya untu. sebagian besar darilapisan 5il lipid 6"!7& SS$S pretreated C"=:mer.aptan yang diamati lebih stabil daripada pretreated C"A: mercaptan& /adi, dalam semua percobaan yang dilapor.an di sini, C"=:mercaptan pretreated SS$S diguna.an& 0ntu. memasti.an persiapan yang benar dari ele.troda dan pengembangan SS$S, .ondu.tansi listri. mere.a dan .apasitansi listri. dicatat& ;apisan emas men3abat sebagai satu ele.troda& Sebagai ele.troda .ontra AgCAgCl: atau platini<ed Pt:ele.troda yang diguna.an& )engan tida. adanya tegangan e.sternal, sisanya arus diamati menun3u..an adanya potensi yang mele.at& Potensi tersebut diper.ira.an "( :4( .e $V dengan mene.an sisanya saat ini dengan e.sternal potensial& Potensi yang mele.at 3atuh di bai. mer.aptan dan lapisan lipid tapi rupanya tida. merusa. mere.a& 0ntu. *;$ .on1ensional dibangun dari PC dan octadecyl amina, .ondu.tansi listri. spesi5i. dan .apasitansi listri. spesi5i. diper.ira.an +m 8 (& nSCcm4 dan Cm 8 ( n-Ccm4, masing:masing& Ini Nilai:nilai yang diperoleh dengan mengamati arus stasioner mengi.uti lang.ah tegangan dan obser1asi tersebut yang persegi pan3ang Tanggapan saat ini .e tegangan yang segitiga masing:masing& Seperti yang ditun3u..an oleh -lorin dan +aub 6"!7, salah satu memperoleh conductances sebanding dan .apasitansi dengan SS$& )engan $ueller:'udin *;$ hidup .ali se.itar tiga sampai enam 3am yang .has& Apalagi setelah penambahan protein yang mengandung 5ragmen membran, 1esi.el, iono5or atau uncouplers *;$ dapat men3adi tida. stabil& Pera2atan harus diambil untu. menghindari gangguan me.ani., yang dapat merusa. *;$& Sebuah SS$ .has stabil untu. setida.nya 4 3am& selama 2a.tu ini, .ondu.tansi listri. adalah sebanding dengan .ondu.tansi *;$ dan

tetap .onstan& Kami mela.u.an e.sperimen dengan bacteriorhodopsin mengandung P$ 5ragmen yang berlangsung lebih dari #= 3am tanpa signi5i.an perubahan .ualitas sinyal& 0ntu. .ali lebih besar dari 4 3am, .ondu.tansi mening.at dua atau tiga perintah besarnya& /i.a potensial ele.troda yang mele.at di.ompensasi.an, SS$ menun3u..an perila.u yang sama seperti tanpa .ompensasi& +angguan me.anis, yang biasanya menghancur.an sebuah *;$, tida. mempengaruhi SS$& Photoarte,a(t )engan tida. adanya protein atau di.urung ATP, cahaya diindu.si sinyal yang diamati dengan SS$& )alam beri.ut,sinyal:sinyal ini disebut sebagai photoarte5acts& bentu. dan besarnya arte5a. ini adalah 1ariabel bah.an di ba2ah .ondisi .onstan& Seperti yang diharap.an, arte5a. yang terutama besar untu. cahaya 0V& )i hadapan sang.ar ATP, arte5a. yang lebih besar daripada dalam .etiadaan& Selain itu, arte5a. tergantung pada .omposisi ele.trolit dan pada tegangan e.sternal dan 3auh lebih besar dibanding.an dengan yang diperoleh dengan *;$& Arte5a. terdistorsi protein yang dihasil.an sinyal listri. untu. .ali lebih pende. dari ( ms 3i.a laser eFcimer diguna.an untu. e.sitasi& )alam percobaan dye: laser, arte5a. yang .ecil dan hanya yang pertama, .ita sinyal yang terdistorsi& $ung.in ada setida.nya empat sumber .emung.inan arte5a.B yang photoe55ect pada permu.aan emas yang mengi.uti o5photons penyerapan di permu.aan logam, pemisahan muatan dalam mole.ul ATP sang.ar terleta. di permu.aan lapisan lipid, proton rilis dari sang.ar ATP selama photolytic pembelahan 697, dan pemisahan muatan dalam mole.ul lipid atau mer.aptan setelah penyerapan 5oton& Tergantung pada .ondisi e.sperimental semua e5e. ini dapat ber.ontribusi lebih atau .urang untu. photoarte5act yang dan membuatnya 1ariabel& -a.ta bah2a arte5a. adalah lebih besar daripada dalam .asus tersebut yang *;$, mung.in .arena photoe55ect setelah penyerapan 5oton di permu.aan emas& Sin+al-sin+al listrik +ang "ihasilkan oleh ion protein pemin"ahan Setelah .ara.terisasi listri. dari SS$, suspense protein yang mengandung 5ragmen membran atau 1esi.el ditambah.an .e .u1et ba2ah pengadu.an& dalam .ebanya.an .asus, ! menit setelah penambahan suspensi, adsorpsi 5ragmen atau 1esi.el untu. SS$ selesai& Penghentian proses adsorpsi ditun3u..an oleh a.hir pening.atan diindu.si cahaya sinyal listri.& 0ntu. *;$ dengan .ondu.tansi cu.up rendah, sementara arus dapat diamati .eti.a ion teradsorpsi pompa dia.ti5.an 6#, " , 4!7, yaitu, *;$ diguna.an sebagai ele.troda .apasiti5& /i.a .ondu.tansi dari SS$ adalah sebanding dengan o5a *;$, 5enomena listri. serupa diharap.an&

*a(teriorho"opsin *' adalah pompa proton cahaya:dri1en ditemu.an di P$ yang archaebacterium Halobacterium halobium& )alam cahaya:disesuai.an bentu. mengandung semua:trans retina sebagai .romo5or& Setelah e.sitasi cahaya, *' mele2ati photocycle, .embali .e .eadaan dasar melalui serang.aian intermediet, dan dengan demi.ian translocates proton melalui P$ 6!A7& ( Dl dari sonicated 6! s7 suspensi cahaya:disesuai.an P$ 6O) (A= nm 8 ",A7 di H4 ditambah.an .e .u1et tersebut&

+A$*A' 4 bacteriorhodopsin& ;ight:diindu.si .epadatan arus transien di hadapan bacteriorhodopsin mengandung membran ungu di ba2ah pencahayaan stasioner& Tanda panah mengindi.asi.an s2itching dan dari cahaya& /e3a. dicatat dalam .etiadaan 6:-CCP7 dari dan setelah Selain itu 6M -CCP7 dari "#Dm dari -CCP pemba2a proton& .ondisiB SS$ terbentu. dari PC M octadecyl amina, " m$ NaCl, " m$ Na:CitrateCHCI, pH 8 A, !& Cahaya arus listri. indu.si transien diamati seperti yang ditun3u..an pada +ambar& 4 dan !& The arah arus sesuai dengan translo.asi proton terhadap SS$& Kepadatan arus I nai. .e nilai punca.nya I0 dan .emudian meluruh dengan rela.sasi .ara.teristi. 2a.tu .e nilai stasioner yang tergantung pada .ondu.ti1itas SS$& Kepadatan arus punca. I dari >A :4 nACcm4 yang diperoleh& The spesi5i. SS$ tersebut yang .ondu.tansi diperoleh dengan metode tegangan langsung pada .ondisi ini adalah ",9 nSCcm4& /e3a. .edua 6label

+A$*A' ! bacteriorhodopsin& )ye laser .ilat diindu.si .epadatan arus transien& Inset menun3u..an a2al sinyal dari Percobaan yang sama dengan resolusi 2a.tu yang lebih tinggi& Kenai.an tersebut yang sinyal *' terdistorsi oleh photoarte5act tersebut& Sinyal adalah rata: rata dari "4= temba.an tunggal dengan penundaan Nt 8 ( s antara dua temba.an& Kondisi seperti pada +ambar& 4&

+A$*A' # bacteriorhodopsin& Tinda.an spe.trum *' 6di ba2ah cahaya stasioner7 menun3u..an normalisasi a2al .erapatan arus Io C I ,maF sebagai 5ungsi dari pan3ang gelombang & +aris padat me2a.ili normalisasi penyerapan O C OmaF, dari *'& Kondisi seperti pada +ambar& 4& PM -CCPP7 pada +ambar& 4 menun3u..an sinyal dari percobaan yang sama #( menit setelah penambahan "# D$ dari -CCP pemba2a proton& Arus stasioner mening.at diamati menurut 4 .ali lipat .ondu.tansi spesi5i. lebih tinggi 6!( nSCcm47& 0ntu. menun3u..an bah2a sinyal cahaya:induced setelah penambahan P$ suspensi mencermin.an a.ti1itas listri. dari *', sempit 5ilter gangguan pita yang diguna.an untu. memperoleh spe.trum a.si sinyal o5the& Hasilnya ditun3u..an pada +ambar& #& Spe.trum tinda.an dibanding.an dengan spe.trum penyerapan *'& Kedua .ur1a dinormalisasi untu. mere.a nilai ma.simal& +ambar& (

menun3u..an 2a.tu rela.sasi dari .epadatan arus sebagai 5ungsi dari intensitas cahaya timbal bali.& pada rendah

+A$*A' ( bacteriorhodopsin& %a.tu timbal bali. :" rela.sasi dari .epadatan arus a2al *' nilai stasioner sebagai 5ungsi dari intensitas cahaya 6di ba2ah pencahayaan stasioner7& +aris padat adalah coco. untu. 5ungsi saturasi digambar.an dalam te.s& 0ntu. : 8 ",= s adalah e.strapolasi 2a.tu rela.sasi T untu. menghilang intensitas cahaya& Kondisi seperti pada +ambar& 4& intensitas, 3enuh 2a.tu .onstan pada 8 6",= M ,!7 s& untu. membu.ti.an .orespondensi antara sinyal listri. dalam 5ragmen o5P$ .ehadiran dan photocycle o5bacteriorhodopsin cepat .ineti.a sinyal listri. dipela3ari& +ambar& ! menun3u..an nm (9 pulsa dye laser diindu.si sinyal listri. setelah penambahan P$ ba2ah .ondisi yang sama seperti pada +ambar& 4 .ecuali bah2a suhu "? G C& ATPase& Tiga perbedaan tipe P ATPase diselidi.iB Na, K:ATPase dari babi gin3al, Ca:ATPase dari sar.oplasma reti.ulum dari otot rang.a .elinci, dan H, K:ATPase dari babi mu.osa lambung& Na, K:ATPase mempertahan.an NaM : KM dan ion: gradien pada sel he2an& )engan adanya $g4M:ion untu. setiap dihidrolisis ATP:mole.ul tiga NaM:ion yang ditrans5er .e luar dan dua ion KM:diang.ut .e dalam sel sehingga en<im mengang.ut satu positi5 netcharge .eluar dari sel& Ini telah ditun3u..an sebelumnya bah2a sinyal listri. dari Na, K:ATPase pada *;$ sesuai dengan lang.ah:lang.ah NaM:dependent Na rea.si si.lus 6(, "4, 497& Hal ini dapat .arena itu 3uga diamati dalam adanya K M& Ca:ATPase dari reti.ulum sar.oplasma ber5ungsi untu. o5muscles rela.sasi& Setelah .ontra.si otot untu. setiap mole.ul ATP dihidrolisis dua Ca4M : ion di.eluar.an dari sitoplasma .e lumen dari reti.ulum sar.oplasma untu. menurun.an sitoplasma Ca4M : .onsentrasi& -ungsi tersebut yang H, K: ATPase dari sel parietal mu.osa lambung adalah se.resi asam di perut dan pemeliharaan

ting.at pH rendah dari " terhadap proton gradien dari se.itar A unit pH& 0ntu. setiap dihidrolisis ATP mole.ul, HM:ion dise.resi.an dan KM :ion ditrans5er .e dalam sel parietal& Stoi.iometri adalah "B" atau 4B 4& Oleh .arena itu, dalam .ondisi 5isiologis, H, K:ATPase adalah electrosilent& Namun, di ba2ah KM : .ondisi bebas, rea.si parsial electrogenic transportasi proton yang diamati 6"?7& 0ntu. menga.ti5.an pompa ion ini, .onsentrasi cepat melompat dari ATP diprodu.si oleh photoly<ing di.urung ATP dengan lampu .ilat 0V laser 6" ", "47& $emperoleh listri. sinyal dengan .epadatan arus punca. se.itar " nACcm4 ditun3u..an pada +ambar& A& )alam semua tiga .asus sinyal yang diperoleh sesuai dengan translo.asi muatan positi5 terhadap SS$& +ambar& A, A dan *, menun3u..an ;aser -lash sinyal diindu.si dalam .ehadiran Na, K:ATPase 5ragmen membran yang mengandung sebelum dan sesudah inhibisi dengan inhibitor spesi5i. strophantidin 64( $7& Setelah

hambatan, hanya arte5a. tetap& Alasan untu. arah yang berla2anan peninggalan sebelum dan sesudah inhibisi tida. di.etahui& )iindu.si sinyal cahaya di hadapan Ca:dan H, K:ATPase mengandung 1esi.el ditun3u..an pada +ambar& A, C dan ), masing:masing& H, K:ATPase bisa dihambat dengan inhibitor spesi5i. SCH4= = 6" , $7& )alam semua tiga .asus gratis ATP 6",A m$7 dite.an dan 1anadate 6" m$7 menghambat sinyal listri. dan hanya sebuah arte5a. tetap mirip dengan yang ditun3u..an pada +ambar& A *&

+A$*A' A ATPase& 6A7 Cahaya diindu.si .epadatan arus transien setelah penambahan 5ragmen membran yang mengandung Na, K:ATPase dari pig .odney& KondisiB SS$ terbentu. dari PC M actadecyl amina, "! mm NaCl, $gCl4 !mm, 4( m$ imida<ole C HCl, pH 8 A&4#, " mm di.urung ATP& 6*7 Kondisi yang sama seperti di A tetapi 4( mm strophantidin ditambah.an& 6C7 Cahaya diindu.si .epadatan arus transien setelah

penambahan 1esi.el yang mengandung Ca:ATPase dari reti.ulum sar.oplasma otot rang.a .elinci& KondisiB SS$ terbentu. dari PC M octadecyl amina, " m$ CaCl4, " m$ $gCl4, " m$ E+TA, " m$ )TT, 4 m$ $ES C T'IS, pH 8 A&4!,# A$ A4! "=9&4= $$ sang.ar ATP& 6)7 Cahaya diindu.si .epadatan arus transien setelah penambahan 1esi.el yang mengandung H, K:ATPase dari perut babi& KondisiB SS$ terbentu. dari PC M PS, ( m$ imida<ol, ! m$ $gCl4, " m$ )TT, 4( $$ E+TA C T'IS, pH 8 A&4!, 4A mm di.urung ATP& ;epas.an ting.at o5ATP dari sang.ar ATP dalam semua .asusB 8 #:=@& PEMBAHASAN ;KS telah terbu.ti men3adi alat yang serbaguna dan sensiti5 untu. meneliti si5at listri. dari ion pompa& Karena mere.a .ondu.tansi dan spesi5i. rendah .apasitansi spesi5i. yang tinggi, mere.a dapat diguna.an sebagai .apasiti5 ele.troda untu. penda5taran pompa arus dihasil.an oleh protein yang mengandung 5ragmen membran atau 1esi.el yang teradsorpsi .e *;$& *erbagai pompa ion diin1estigasi SS$ $etode& Arus yang dihasil.an oleh protein pada SS$ dianalisis dan dibanding.an dengan hasil yang diperoleh dari percobaan analog pada ;KS& $onolayers ;ipid dan bilayers pada substrat padat telah diprodu.si di masa lalu oleh berbagai te.ni. 64A, ! , !", !9, !=, !?, #!7& Namun, bila didu.ung oleh permu.aan logam, beberapa persiapan ini memili.i .ondu.tansi relati5 tinggi yang membuat mere.a tida. coco. untu. penyelidi.an si5at listri. dari membran protein 6misalnya 6!?, #!7B +Q " nSCcm47& 'endahnya .ondu.tansi diperlu.an .arena hanya sebagian dari *;$ atau permu.aan SS$ ditutupi dengan membran teradsorpsi 5ragmen atau 1esi.el& Permu.aan ditemu.an bertinda. sebagai hambatan shunt 3i.a terlalu rendah yang menyebab.an masalah latar bela.ang yang tinggi saat ini& Sinyal:sinyal listri. yang dihasil.an oleh ion pemindahan protein membran teradsorpsi .e SS$ yang mirip dengan sinyal yang diperoleh dengan *;$ dalam .ondisi yang sebanding& Hal ini memberi.an bu.ti bah2a .ondu.tansi dari Sampel SS$ cu.up rendah untu. memung.in.an penggunaan SS$ dengan cara yang sama sebagai *;$ .on1ensional sebagai .apasiti5 ele.troda& )alam re5erensi "! itu menun3u..an bah2a spesi5i. .ondu.tansi SS$ yang coco. dengan nilai:nilai diu.ur untu. *;$, mes.ipun me.anisme mela.u.an tetap tida. ter3elas.an& Selain .ondu.tansi spesi5i. rendah, spesi5i. yang tinggi .apasitansi membran lipid tersebut yang diperlu.an& )iu.ur a2al saat Io sebanding dengan C$I 6Cm M Cp7 6#7& Oleh .arena itu, Cm .apasitansi spesi5i. lipid membran harus dari urutan besarnya Cp .apasitansi spesi5i. dari protein mengandung teradsorpsi

5ragmen membran, untu. memberi.an .apasiti5 besar arus& The spesi5i. Cp .apasitansi listri. dari 5ragmen membran adalah ", -Ccm4& Nilai untu. ;KS .apasitansi spesi5i. adalah &(, -Ccm4& $es.ipun .apasitansi spesi5i. disiap.an SS$S hanya seperlima dari nilai yang diu.ur untu. bilayer, Nilai ini cu.up untu. memasti.an .apasiti5 besar arus setelah a.ti1asi biaya pemindahan membran protein& Pen3elasan untu. .apasitansi diturun.an dari SS$ mung.in bah2a hanya bagian dari 5ilm lipid pada du.ungan yang solid cu.up tipis untu. memberi.an .ontribusi yang besar untu. .apasitansi& Interpretasi ini di.on5irmasi.an dengan hasil yang disa3i.an oleh -lorin dan +aub mengguna.an Permu.aan plasmon mi.ros.op 6"!7& Kelemahan dari setup SS$ adalah .epe.aan terhadap cahaya& Terutama pada pan3ang gelombang pende., radiasi berintera.si dengan permu.aan emas dan mengarah .e listri. photoinduced saat ini& Kontrol percobaan untu. membeda.an protein sinyal yang dihasil.an dari indu.si arte5a. cahaya Oleh .arena itu penting& Setelah penambahan P$ suspensi 6+ambar 4 dan !7, sinyal identi. dengan o5P$ teradsorpsi .e *;$ 6=, " , "=7 diperoleh& Sinyal:sinyal yang berbeda dari photoarte5act dire.am sebelum penambahan P$& )i ba2ah stasioner penerangan 6+ambar 47 sinyal se.itar tiga perintah besarnya lebih besar dari arte5a.& Sinyal yang ditun3u..an pada +ambar& ! dapat di3elas.an oleh pen3umlahan empat e.sponensial& $engguna.an prosedur 5it SP;$O) 64?7, .ami memperoleh .ali pembusu.an " 8 #& s, 4 8 (4 Apa.ah, ! 8 "9! s, dan # 8 #,! ms& Nilai:nilai sebanding dengan nilai: nilai yang diperoleh pada *;$ atau gel 6A, ?, 44, # 7B l 8 ",4, .ami, 4 8 ( , .ita, ! 8 4 , s,

dan # 8 # ms& Itu Perbedaan ditemu.an untu. .omponen pertama antara SS$ dan pengu.uran *;$ ini mung.in .arena superposisi nai. *':sinyal dan photoarte5act yang dalam .asus metode SS$ 6lihat inset +ambar& !7& Tinda.an spe.trum *' 6+ambar #7 pada SS$ yang setu3u dengan spe.trum a.si *;$ a& Hal ini memberi.an bu.ti bah2a arus indu.si cahaya di hadapan P$ suspensi memang .arena a.ti1itas pompa *'& $enurut stru.tur mi.ros.opis yang diusul.an SS$ ini 6+ambar " C7 .ami saran.an rang.aian e.i1alen identi. itu o5a *;$ .on1ensional& 'ang.aian ini ditun3u..an pada +ambar& " )& tergantung 2a.tu pompa saat Ip dari protein membran terdistorsi oleh rang.aian e.ui1alen di3elas.an oleh .ondu.ti1itas spesi5i. +m, +P, dan .apasitansi spesi5i. Cm, Cp o5the SS$ dan terpasang 5ragmen membran, masing:masing& Sebuah e.spresi untu. 2a.tu arus listri. tergantung saya diu.ur dalam sir.uit luar dapat diperoleh dengan analisis rang.aian& Itu Hasil 6lihat re5erensi #7 untu. penerangan stasioner setelah beralih pada sumber cahaya .onstan&

0ntu. Io adalah .erapatan arus a2al, I adalah .erapatan arus stasioner dan adalah 2a.tu peluruhan .epadatan arus .e nilai stasioner nya& Ini 2a.tu peluruhan tergantung pada intensitas cahaya sesuai dengan /B

dimana pompa saat Ip, diberi.an olehB

dan /"C4 dan V R adalah .onstanta& Analisis .etergantungan intensitas 2a.tu rela.sasi cahaya disebab.an .epadatan arus ba2ah cahaya stasioner menghasil.an 2a.tu sistem 0ntu. yang menggambar.an pema.aian .apasitansi membran senya2a 6#7& Hal ini diberi.an sebagai batas intensitas nol Pers& 4B

0ntu. *;$, 8

,4 s yang ditemu.an& )alam .asus P$ teradsorpsi .e SS$ .ami ,!7 s seperti ditun3u..an pada +ambar& (& )engan
Cm,

memperoleh yaitu 8 6",= S

mempertimbang.an bah2a SS$ memili.i .apasitansi spesi5i. rendah 6Cm, SS$ "C( &
*;$ *;$

7 dengan memperhati.an *;$ dan setida.nya sebanding .ondu.tansi spesi5i. 6+ m, SS$ +m, 7 .ita menyimpul.an bah2a shunt .ondu.ti1itas + P,
SS$

harus lebih .ecil dibanding.an

dengan *;$& Ini mung.in dapat dita5sir.an sebagai adsorpsi .uat 5ragmen untu. SS$& 0ntu. menyelidi.i pompa ion ATP:dri1en, .onsentrasi Percobaan melompat dila.u.an dengan melepas.an ATP dari sang.ar ATP& +ambar& A, A, C, dan ), menun3u..an cahaya diindu.si sinyal di hadapan o5caged ATP dan Na, K:, Ca:dan H, K:ATPase, masing:masing& +e3ola. de.at dengan t 8 adalah photoarte5acts& Setelah pembusu.an o5these arte5a. untu. .ali lebih besar dari (:" ms, sinyal yang diamati tergantung pada .ehadiran protein dan di.urung ATP& Sinyal dapat dihambat oleh inhibitor spesi5i. dan hanya photoarte5act seperti sebelumnya penambahan protein tetap& Hal ini memberi.an bu.ti .uat bah2a diperoleh Sinyal merupa.an pompa arus o5the ATPase diselidi.i& Kami diciri.an per3alanan 2a.tu pompa arus mengguna.an program SP;$O) agar sesuai dengan 3umlah tiga e.sponensial pada data 64?7& )alam .asus Na, K:ATPase dari gin3al babi data yang ditun3u..an pada +ambar& A A dapat di3elas.an oleh .onstanta 2a.tu timbal bali. sebagai beri.utB l:" 8 9?s:", 4:l 8 ""s:", dan !:"8 "s:"&0nder .ondisi serupa A4 s:", "# s:", dan ! s:" diperoleh untu. *;$

6"47& )ua yang pertama .ali .onstanta T, dan T4 sebelumnya telah ditugas.an a.ti1itas protein o5the pompa& *ah.an, pengu.uran pada SS$ dan *;$ menghasil.an hasil yang sama untu. .onstanta ini& Hal ini berla.u 3uga dalam .asus Ca:dan H, K:ATPase yang mengandung 1esi.el& 0ntu. sinyal dari Na, K:ATPase diu.ur pada *;$ T! dita5sir.an sebagai 2a.tu .onstan setara sir.uit yang diberi.an oleh .omponen + m, Cm, +P, dan Cp melalui Persamaan& # dan memili.i nilai se.itar ,4 hingga ,! s& )ari percobaan dengan Na, K:ATPase membran yang mengandung 5ragmen pada SS$, .ita memperoleh ! 8 " s untu. sistem 2a.tu, yaitu, seperti dalam .asus *', 2a.tu sistem untu. SS$ lebih besar dari 2a.tu sistem untu. *;$& Ini lagi dapat dita5sir.an sebagai adsorpsi .uat dari 5ragmen membran untu. SS$& 'ES!MPULAN Hasil ini menun3u..an bah2a si5at listri. dari SS$ dan *;$ sebanding& Perila.u ion pompa yang ter.andung dalam 5ragmen membran terserap atau 1esi.el mirip seperti dalam sistem *;$& Oleh .arena itu .ita harus mengusul.an stru.tur sand2ich:seperti mi.ros.opis 6+ambar " C, di sini dalam .asus membran teradsorpsi 5ragmen yang mengandung Na, K: ATPase7 menggabung.an model untu. *;$ dan monolayer mer.aptan seperti yang diusul.an dalam 6#, (, "", "47 dan 6", 4, !, 4#, #47, masing:masing& A.ibatnya rang.aian e.i1alen seperti ditun3u..an pada +ambar& " ) identi. dengan penyiapan *;$ 6#, (, "", "47 disaran.an& Hal ini menun3u..an bah2a SS$ dapat diguna.an untu. melihat si5at transportasi protein membran dalam banya. hal yang sama seperti yang ditun3u..an untu. *;$& Keuntungan dari SS$ atas *;$ adalah stabilitas me.ani. menyebab.an .etida.pe.aan terhadap getaran e.sternal dan tida. berlangsung lama& Hal ini terutama penting untu. e.sperimen di mana pengadu.an cepat atau pertu.aran cepat dari ele.trolit yang diingin.an& $es.ipun .esamaan yang .uat dari SS$ dan perbedaan *;$ antara .edua metode tetap tida. dapat di3elas.an& $e.anisme mela.u.an dengan SS$ belum dipahami& Hal ini penting untu. memper3elas proses bertanggung 3a2ab atas arte5a. cahaya, mengurangi .apasitansi spesi5i. dan potensial ele.troda dan apa.ah mere.a dapat di.urangi atau dihindari&