TUGAS JURNAL

Tethered Polymer-Supported Planar Lipid Bilayers for Reconstitution of Integral Membrane Proteins: Silane Polyethyleneglycol-Lipid as a Cushion and Covalent Linker By : Michael L. Wagner and Lukas K. Tamm Department of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908-0736 USA

Disusun Oleh :

Diterjemahkan Oleh : 03101403019 03101403024 Carina Eka Puspita Agung Setiawan

Dosen Pembimbing

: Dr. Ir. H. Hatta Dahlan M.eng

UNIVERSITAS SRIWIJAYA FAKULTAS TEKNIK JURUSAN TEKNIK KIMIA 2013

Ikatan Polimer-Pengaruh dua lapisan lipid planar penunjang untuk Rekonstitusi Integral Protein Membran : silan poli-etilen glikol Lipid sebagai Pelapis dan kovalen Linker Michael L. Wagner dan Lukas K. Tamm Departemen Molekular Pisiologi dan Ilmu Alam Biologikal, Universitas Virginia, Charlottesville, Virginia 22908-0736 USA ABSTRAK Ada hal yang menarik dalam membran penunjang dari bentuk biologisnya dan sebagai fisiologi matriks untuk dipelajari struktur dan fungsi protein membran dan reseptor. Masalah umum dua lapisan lipid protein yang secara langsung dipengaruhi oleh substrat hidrofilik adalah interaksi nonfisiologis protein membran terpisahkan dengan bantuan solid sejauh mereka tidak menyebar pada bidang membran. Untuk mengurangi beberapa masalah ini kami telah mengembangkan polimer pengikat dengan bantuan planar sistem lipid bilayer baru, yang memungkinkan kita untuk menyusun kembali protein membran yang terpisahkan dalam bentuk pergerakan lateral. Kami telah merancang bilayers lipid pada desain baru pelapis polietilenaglikol untuk peningkatan stabilitas, ikatan kovalen dari membran atau substrat kaca. Pembentukan dan morfologi bilayers diikuti oleh total refleksi internal dan mikroskop epifluorescence serta difusi lateral lipid bilayer dan protein tersebut dipantau oleh pemulihan fluoresensi setelah photobleaching. Keseragaman bilayers dengan koefisien difusi lipid lateral yang tinggi (0.8 -1.2 X 10 -8 cm2 / s) diamati ketika konsentrasi polimer sedikit di bawah transisi pembersihan jamur. B5 sitokrom dan annexin V digunakan sebagai pengujian protein pertama dalam sistem ini. Ketika dilarutkan dalam bilayers penunjang pada kuarsa, kedua protein sebagian besar bergerak dengan fraksi kecepatan < 25%. Namun, dua populasi pergerakan lateral protein seluler yang diamati ditunjang bilayers polimer. Sekitar 25% dari b5 sitokrom disebarkan dengan koefisien difusi ~1 X 10-8 cm2/ s dan 50-60% menyebar dengan koefisien difusi ~2 X 10 -10 cm2/s. Demikian pula, sepertiga dari annexin V disebarkan dengan koefisien difusi~3 X 10 -9 cm2 / s, dan dua-pertiga disebarkan dengan difusi koefisien ~4 X 10-10 cm2 / s. Sebuah contoh untuk interaksi protein dengan dasar polimer telah di bahas sebelumnya. PENDAHULUAN Sejak awal (Tamm dan McConnell, 1985), bilayers lipid telah banyak digunakan sebagai model untuk membran selular (McConnell et al, 1986;. Sackmann, 1996).

Membran penunjang, satu lapisan dan dua lapisan telah digunakan dalam studi dasar dan diterapkan dari kumpulan lipid pada permukaan (Kalb et al, 1992;. Wenzl et al, 1994.; Hubbard et al., 1998), struktur membran (Tamm dan Shao, 1998), membran dinamika (Tamm dan Kalb, 1993; Thompson et al., 1993), interaksi lipid-protein (Tamm dan Tatulian, 1997; Silvestro dan Axelsen, 1998), interaksi ligand (Thompson et al, 1997;.. Heyse et al, 1998), sifat elektrokimia membran (Stelzle et al, 1993;. Fromherz et al, 1999), pengembangan membran biosensor berbasis (Cornell et al, 1997;. Stora et al. 1999), dan perangkat pemisahan mikroskopis (van Oudenaarden dan Boxer, 1999). Meskipun bilayers terbatas, monolayers penunjang digunakan untuk mempelajari sifat membran periferprotein, peptida membran dan pengikatan pada reseptor integral protein membran bilayers yang secara langsung dipisahkan pada kaca atau kuarsa dari substrat oleh (10-20 ), lapisan tipis air (Tamm dan Mc Connell, 1985; Johnson et al, 1991). Film ini cukup untuk mendukung mobilitas lateral lipid di kedua lapisan ganda (Tamm, 1988). Banyak reaksi dalam membran tergantung pada gerakan lateral yang sifat fluidanya dinamis pada semua komponen membran. Oleh karena itu, penting untuk pengembangan lebih lanjut pada membran dibantu membran sel pengganti yang harus sepenuhnya mereproduksi mobilitas lateral semua membran komponen, termasuk protein transmembran di sistem ini. Beberapa upaya untuk mencapai tujuan ini telah dibuat dalam beberapa tahun terakhir. Pendekatan umum studi ini adalah untuk memisahkan membran dengan bantuan solid dari polimer (lihat, misalnya, Sackmann, 1996). Seringkali bilayers yang terbentuk pada polimer yang merata banyak cacat, dan pemulihan integral protein membran dan pengukuran difusi lateral yang dari protein ini (yaitu, tes benar-benar penting untuk perbaikan atas sistem yang ada) jarang dicoba. Dalam sebuah studi awal, Spinke dkk. (1992) dengan hidrofilik, metakrilat polimer dengan rantai samping alifatik pada permukaan emas. Hasil bilayers lipid tidak lagi ditandai. Kuhner et al. (1994) yang disiapkan 30-40 m ketebalan Gel polyacrylamide di kaca dan dilapisi dengan monolayers dan bilayers ini menggunakan Teknik Langmuir-Blodgett. Ketika diperiksa oleh mikroskop epifluorescence, bilayers ini menunjukkan beberapa sisa struktur domain. Lipid dan peptida antigen biasanya menyebar dalam bilayers ini. Dalam perpanjangan dari karya ini, mobilitas elektroforesis dibebankan lipid ditentukan dalam monolayers yang didukung pada gel agarosa (Dietrich dan Tampe', 1995). Bilayers tidak terbentuk pada substrat tersebut. Dalam studi lain, bilayers terbentuk pada substrat polivinil yang difungsikan pada gugus amino dietilen untuk reaksi dengan headgroups lipid (Beyer et

al., 1996). Meskipun bilayers homogen dengan koefisien difusi lipid yang tinggi diperoleh di bawah beberapa kondisi, linker hidrofilik jelas terlalu simple untuk mengakomodasi protein membran dalam sistem ini. Gugus amonium yang bereaksi bermuatan positif juga dapat menimbulkan masalah untuk pemulihan fungsional protein membran. Bilayers lipid pada sebuah polyethyleneimine oleh reflectometry neutron menemukan bahwa ketebalan, kekasaran permukaan, dan cakupan polimer, lapisan lipid bergantung kuat pada metode persiapan. Misalnya, polimer itu <170 tebal ketika bilayers yang terserap ke polimer hanya 40-50 tebal ketika polimer ditambahkan setelah pengendapan lapisan ganda lipid. Elender et al. (1996) mampu menghasilkan bilayers seragam dari dimyristoylphosphatidylcholine dan 20 mol% kolesterol pada 600-800 nm dekstran. Difusi lateral yang koefisien dan fraksi mobile dari lipid yang tinggi dalam sistem ini sangat tidak stabil dalam adanya kolesterol. Sebuah polimer untuk mendukung protein yang mengandung bilayers lipid harus memenuhi persyaratan sebagai berikut: harus sangat hidrofilik dan harus berinteraksi dengan baik pada membran lipid atau dengan protein membran; untuk ketahanan dalam aplikasi praktis, juga harus secara kimia terkait dengan bilayer di satu ujung dan ke substrat padat (Kuarsa atau kaca) di ujung lain dan tidak boleh terlibat dalam interaksi fisik yang luas baik dengan permukaan. Polietilenaglikol (PEG), kovalen terkait dengan substrat dan bilayers, kemungkinan untuk memenuhi kriteria tersebut. PEG dikenal untuk mencegah adsorpsi protein nonspesifik pada permukaan (Prime dan Whitsides, 1991; Jin et al, 1995;.. Du et al, 1997). Untuk alasan ini telah banyak digunakan dalam melapisi permukaan perangkat biomedis. Selain itu, PEG tidak menyerap ke permukaan bilayer lipid (Arnold et al., 1990) dan liposom dari interaksi yang tidak diinginkan dengan biomaterial dalam sistem pengiriman obat (Woodle dan Lasic, 1992). Demikian pula, kami berharap bahwa PEG berinteraksi hanya minimal dengan kaca atau permukaan kuarsa. Misalnya, PEG tidak larut bisa ditransfer dari sub fase bawah lipid yang terkompresi monolayer (Ariga et al., 1995). Kami lebih menggambarkan pemulihan dan percobaan difusi lateral dari dua protein yang mewakili dua struktur yang berbeda kelas dalam protein membran. Kondisi dieksplorasi yang memproduksi ikatan polimer yang dibantu bilayers dengan mobilitas lateral yang tinggi menajdi konstituen lemak dan protein. BAHAN DAN METODE Bahan

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1-palmitoil- 2-oleoil-sn-glisero-3[phospho-rac-(1-gliserol)] (POPG), 1,2-dioleoylsn- glisero-3-fosfokolin (DOPC), dan N-[poli (etilen glikol) 2000] -1,2-dimyristoyl-sn-glisero-3-phosphoethanolamine phosphoethanolamine (NBD-eggPE) dan (PEG2000- DMPE) yang dibeli dari Avanti Lipid Polar (Alabaster, AL). N-(7 Nitrobenz-2-Oxa-1 ,3-diazol-4-il)fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) berasal dari Probe Molekuler (Eugene, OR), dan Octyl-glucoside (-OG) adalah dari Sigma (St Louis, MO). Slide Kuarsa (37 mm X 25 mm X 1 mm) yang dibeli dari Quartz Ilmiah (Fairport Harbor, OH). DMPE-PEGtriethoxysilane (DPS) adalah custom-disintesis oleh Shearwater Polimer (Huntsville, AL). 1H-NMR spektra DPS dalam DMSO-d6 menegaskan struktur yang benar dari molekul ini. sitokrom b5 diungkapkan dalam Escherichia coli dan dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Ladokhin et al., 1991), dan hadiah dari Dr Peter Holloway (University of Virginia, Charlottesville, VA). Rekombinan manusia fluorescein-berlabel Annexin V dibeli dari Alexis Biokimia (San Diego, CA) dan digunakan sebagai pendonor. Substrat dan monolayers Quartz dan kaca mikroskop dibersihkan dengan merebus pertama dalam 10% larutan Contrad 70 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) dan sonicating dalam deterjen selama 10 menit, diikuti oleh ekstensif dengan air dsuling ganda dan kemurnian metanol yang tinggi. Kaca mikroskop kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 70 C dan disimpan dalam wadah bebas debu sampai digunakan. Segera sebelum digunakan, kaca mikroskop dibersihkan dalam pembersih argon plasma (Harrick Scientific Corp, New York) pada pengaturan tinggi selama 10 menit. Monolayers lipid menyebar dari 10 solusi mM lipid dalam heksan / etanol (9:1) atau kloroform (monolayers mengandung PEG lipid) di nearzero tekanan permukaan pada antarmuka udara-air dari Langmuir-Blodgett palung (Model 611, Nima Technologies, Coventry, Inggris). Subphase adalah 10 mM Tris-asam asetat (pH 5,0) dibuat dari air suling ganda. Pelarut dibiarkan menguap selama 20 menit sebelum monolayers dikompresi. Tingkat kompresi 25 cm2/min digunakan untuk merekam permukaan tekanan isoterm. Monolayers dipindahkan ke kaca mikroskop kuarsa pada tekanan 32 mN / m. Hal ini dilakukan dengan terlebih dahulu membentuk monolayer pada 0 tekanan dan mengompresi sampai 32 mN / m. Plasma kaca mikroskop dibersihkan dengan cepat (200 mm / min) direndam melalui monolayer dan ke dalam palung. lipid tidak

dipindahkan pada langkah ini sebagai tekanan permukaan yang hampir tidak berubah. Kaca slide mikroskop ditarik dari subphase pada tingkat 5 mm / menit sementara tekanan permukaan 32 mN / m dipertahankan dengan sirkuit umpan balik secara elektronik. Sebuah monolayer tunggal dibentuk pada langkah ini di permukaan, seperti diverifikasi oleh transfer ~01:01 rasio. Bila diperlukan, ikatan molekul DPS ke permukaan oleh pengeringan slide kaca mikroskop dilapisi dalam desikator pada suhu kamar semalam dan kemudian steril dalam 70 C oven selama 40 menit. Slide kaca mikroskop panas yang ditransfer ke desikator, diizinkan untuk menyeimbangkan pada suhu kamar dan biasanya digunakan pada hari yang sama. X-ray fotoelektron spektroskopi X-ray fotoelektron spektroskopi (XPS) spektrum monolayers penunjang dan permukaan kuarsa murni direkam pada PHI 560 ESCA / sam sistem (Perkin Elmer-, Norwalk, CT), menggunakan Mg K1,2 sebagai sumber sinar-x. Resolusinya adalah 1 eV di scan full-range dan 0,2 eV di scan pada substruktur puncak C1s. Sampel DPS atau PEG2000- DMPE disiapkan dan steril seperti dijelaskan di atas. Permukaan yang kemudian dibilas dengan metanol untuk menghapus semua lemak tidak kovalen yang terikat ke permukaan. Komponen Gaussian puncak C1s yang dipasang menggunakan software IGOR (Wavemetrics, Portland, OR). Gelembung tipis Lipid yang dicampur dalam proporsi yang sesuai dari larutan stok di kloroform, dikeringkan di bawah tabung kaca dengan aliran nitrogen, lalu kering di bawah vakum selama 1 jam, dan terhidrasi dengan penambahan HEPES penyangga (5 HEPES mM, pH 7,4, mengandung 150 mM NaCl) untuk mendinginkan konsentrasi lipid. Hasil suspensi lipid yang penuh karena vortex, dicairkan lima kali, dan diekstrusi sembilan kali melalui dua polikarbonat membran ukuran pori 100 nm menggunakan jarum suntik jenis ekstruder (Avestin, Ottawa, ON, Canada). Dua lapisan penunjang Monolayers penunjang yang kering (dengan atau tanpa polimer) berkumpul di refleksi internal total fluoresensi tertutup mikroskop (TIRFM) pengukuran sel (Tamm, 1993). Bilayers penunjang dibentuk dengan penambahan 1,1 ml dari 100 gelembung lipid. Kinetika pembentukan bilayer diikuti dalam banyak kasus oleh TIRFM. Setelah 2 jam dari equilibrium di suhu kamar, kelebihan buih tidak dibuang keluar dari sel pengukur dengan 5 volume buffer. Mikrograf epifluorescence diambil pada Zeiss

Axiovert 35 mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY), menggunakan 40. Bilayers stabil untuk setidaknya 24 jam dan kadang-kadang lebih lama. Bilayers penunjang mengandung protein membran terpisahkan sitokrom b5 identik, kecuali proteoliposomes dibentuk kembali bukan digunakan lipid murni. Jumlah refleksi internal mikroskop fluoresensi dan pemulihan fluoresensi setelah photobleaching Laser mikroskop fluoresensi yang digunakan untuk TIRFM dan fluoresensi pemulihan setelah photobleaching (FRAP) eksperimennya telah dijelaskan secara rinci di tempat lain (Kalb et al., 1990, 1992) dan dijelaskan di sini hanya sedikit. Untuk TIRFM, sinar dari laser ion argon (Innova 300-4 atau Innova 300-8, koheren, Palo Alto, CA) yang beroperasi pada 488 nm difokuskan dan diarahkan melalui prisma kuarsa trapesium ke permukaan yang lebih rendah dari geser kuarsa yang membentuk bagian atas sel pengukuran eksperimental. internal tercermin pada antarmuka kuarsa. penyangga pada sudut datang 72 dari normal (sudut kritis adalah 65 ). Sebuah daerah elips,<250 m X 65 m, diterangi. Fluoresensi dihasilkan dari eksitasi oleh gelombang cepat berlalu dr ingatan, yang menembus ~ 90 nm (1 / e) ke tahap penyangga sekitar, dikumpulkan melalui 40 X Air Tujuan perendaman pada Axiovert 35. Prisma tetap yang dilumasi dan optik digabungkan ke slide untuk memungkinkan translokasi sederhana dari mengukur sel di panggung mikroskop. Fluoresensi tercatat dari bagian tengah elips dengan tabung photomultiplier. Percobaan FRAP dilakukan pada sampel yang sama pada mikroskop yang sama karena pemutihan pola garis-garis paralel, yang dibentuk oleh pencitraan Ronchi berkuasa dalam bidang gambar, dan pengukuran fluoresensi terpadu pemulihan dari ~100 m2 dengan tabung photomultiplier (Smith dan McConnell, 1978). Kurva pemulihan fluoresensi yang cocok untuk persamaan :

di mana =2 / p, D L adalah koefisien difusi lateral, p adalah stripe periode, dan F 0 dan F adalah intensitas fluoresensi setelah photobleaching. Dalam pola photobleaching, fraksi ponsel sebagai persentase didefinisikan sebagai :

Dimana Fpre adalah intensitas fluoresensi sebelum dorongan pemutih.

Pelabelan dan pemulihan dari b5 sitokrom B5 sitokrom diberi label dengan fluorescein seperti yang dijelaskan sebelumnya (Kalb dan Tamm, 1992). Secara singkat, 50 G FITC direaksikan dengan 1 mg protein di 50 mM penyangga karbonat (pH 9,2) yang mengandung 150 mM NaCl dan 100 mM -OG, selama 2 jam pada suhu kamar. FITC bereaksi telah dihapus oleh Kromatografi kolom Sephadex G-25 dengan Tris-OG penyangga (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 100 mM?-OG). Hasil fluorescein / Rasio protein adalah 3:1 (mol / mol) sebagaimana ditentukan oleh spektroskopi absorbansi (Koefisien kepunahan molar 73.000 pada 494 nm digunakan untuk fluorescein) dan uji protein Biorad. Untuk pemulihan ke proteoliposomes, konsentrasi yang diinginkan b5 sitokrom dalam 0,5 ml Tris-OG penyangga ditambahkan ke 150 Mol POPC yang telah dikeringkan pada dasar sebuah tabung uji. Setelah pencampuran menyeluruh, solusi didialisis terhadap buffer yang sama tanpa deterjen selama 18 jam dengan dua perubahan penyangga. Para proteoliposomes yang dihasilkan dimuat ke 10%, 30%, 45% gradien sukrosa terputus dan disentrifugasi selama 90 menit pada 45.000 rpm rotor SW55Ti. Sebuah kumpulan neon tunggal dikumpulkan pada 0/10 antarmuka, dan rasio lipid / protein ditentukan, dengan menggunakan Bradford uji protein dan dimodifikasi Ames (1966) assay fosfat untuk memperkirakan konsentrasi lipid. Mengikat Annexin V untuk bilayers penunjang Bilayers asimetris terdiri dari POPC dengan atau tanpa DPS di lapisan dalam dan POPC: POPG (9:1) di lapisan luar yang disusun dalam EDTA yang mengandung penyangga (10 HEPES mM, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Untuk menghilangkan buih teradsorpsi berlebih, bilayers yang pertama dicuci dengan 10 volume buffer yang mengandung EDTA diikuti oleh 3 volume dari buffer yang sama yang mengandung 1 mM CaCl2 bukan EDTA. Fluorescein-berlabel Annexin V (56 pmol) dalam 1 ml mengandung Ca2 buffer disuntikkan ke sel sampel, dan pengikatan annexin V adalah diikuti oleh TIRFM. Sel itu kemudian dicuci dengan 10 volume dari Ca2 mengandung buffer untuk menghilangkan protein terikat. HASIL Sebuah molekul polimer lipid baru untuk mengikat lipid bilayers ke substrat padat hidrofilik Bilayers lipid yang didukung pada substrat silikat biasanya dilumasi oleh lapisan tipis air pada urutan ~ 10 tebal. Untuk mengakomodasi protein membran terpisahkan

dengan domain hidrofilik pada kedua sisi bilayer, kami merancang molekul polimer lipid baru yang kami harapkan akan meningkatkan jarak antara substrat dan bilayer dengan bilayer tetap stabil terikat dengan zat padat (Gambar 1). Molekul ini terdiri dari dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), polietilenaglikol (PEG), dan kelompok triethoxysilane untuk kovalen hubungan ke silanols pada permukaan substrat silikat. PEG bagian tersebut mengandung rata-rata, 77 sub unit, dan menurut spesifikasi pabrik, itu cukup monodisperse. Kami memilih PEG sebagai polimer karena sifat polimer hampir ideal dalam air ("theta" pelarut) dan interaksi dengan protein diabaikan. Kami menyebut molekul ini DPS. Untuk memperkirakan sifat polimer DPS pada permukaan, pertama kita hitung sesuai dengan teori de Gennes kemudian di subtitusi pada jarak polimer rata-rata antara situs graft dan panjang perpanjangan polimer sebagai fungsi dari mol fraksi DPS dalam monolayer lipid (de Gennes, 1987). Jarak rata-rata antara situs graft, D, hanya diberikan dengan akar kuadrat dari daerah, A, dari molekul lipid tunggal (70 A 2 untuk POPC dan DMPE di negara cairan) dan mol yang fraksi, f, DPS di membran:

radius polimer sub unit N panjang adalah :

Pada D > RF, panjang perpanjangan L, dari polimer atas permukaan sama dengan RF. Bentuk rata-rata polimer bola berjari-jari RF. Jamur Individu polimer melekat pada permukaan di setiap situs okulasi. Dalam rezim ini, polimer diasumsikan berinteraksi baik dengan permukaan atau dengan tetangga terdekat. Namun, ketika D < RF, polimer akan berinteraksi lateral dan akan memanjang lebih jauh dari permukaan. Sebuah polimer padat terbentuk pada permukaan di bawah kondisi ini. Setelah 'skala hukum de Gennes, panjang perpanjangan polimer dalam Rezim diberikan oleh :

Untuk polimer dari 77 unit 3,5 , kita menghitung R F = 47,5 . sifat yang diharapkan secara teoritis D dan L sebagai fungsi dari fraksi mol DPS di monolayer diplotkan pada Gambar. 2. Berdasarkan hitungan ini (ideal) transisi pengotor diperkirakan terjadi pada 3,1 mol% DPS (Gambar 2). Mendekati transisi ini tebal lapisan polimer di permukaan

diharapkan ~48 . lapisan ganda polimer yang didukung pada Gambar. 1 A ditarik sekitar dengan skala. Tekanan Isoterm daerah DPS di POPC Untuk menguji eksperimental interaksi polimer pada membran permukaan, molekul DPS termasuk dalam monolayers dari POPC pada fraksi mol yang berbeda pada suatu Langmuir palung, dan tekanan-daerah isoterm dicatat (Gambar 3). Sebagai fraksi mol DPS di monolayer meningkat, ekspansi besar monolayer muncul di permukaan tekanan di bawah 12 mN / m, menunjukkan suatu daerah meningkat per molekul. Gambar. 3 juga menunjukkan bahwa transisi antara cairan diperluas dan fase cair terkondensasi terjadi pada ~12 mN / m. Transisi ini dapat diamati pada konsentrasi DPS serendah 0,5 mol%. Oleh karena itu, DPS molekul berinteraksi jauh lebih rendah pada tekanan permukaan rendah yang diperkirakan oleh teori deGennes. Dibandingkan dengan bilayers, kepadatan lipid rendah dalam monolayers pada tekanan permukaan rendah memungkinkan rantai PEG menyebar di antarmuka udara-air. Sedikit perbedaan antara isoterm yang berbeda konsentrasi DPS diamati pada tekanan permukaan di atas 20 mN / m. Kurangnya interaksi ini tekanan permukaan lebih tinggi menunjukkan bahwa tekanan antara polimer berdekatan dengan tolakan antara rantai alifatik kental lipid pada monolayer. Kompresi dan diulang siklus ekspansi direproduksi isoterm yang sama, menunjukkan reversibilitas dan keseimbangan monolayers ini (Data tidak ditampilkan).

GAMBAR 1. Desain dari ikatan polimer didukung bilayer lipid. (A) Polimer yang didukung bilayers lipid dirancang untuk ruang ganda lipid dari substrat padat pendukung untuk memungkinkan pemulihan integral protein membran dengan meminimalkan interaksi dari protein dengan substrat dan polimer. Untuk membuat sistem fisik yang kuat, polimer linear kovalen melekat pada kedua ujungnya ke substrat

dan lipid membran masing-masing. (B) Struktur kimia linker antara silan dan DMPE di DPS. (C) Struktur lipid polimer, DPS, dengan kelompok silan untuk ikatan kovalen silikat. PEG, polietilenglikol dari 77 sub unit.

GAMBAR 2 prediksi Teoritis untuk parameter struktural DPS pada permukaan. Jarak rata-rata antara situs uap dan ekstensi panjang polimer dihitung sebagai fungsi dari kerapatan situs graft menurut teori de Gennes polimer bermuatan pada permukaan. Lihat teks untuk rincian. RF, radius Flory. Sebuah transisi dari jamur diperkirakan terjadi pada 3,1 mol% DPS.

GAMBAR 3 Tekanan-daerah isoterm pada 21 C peningkatan fraksi mol DPS di monolayers dari POPC pada palung Langmuir. Isoterm yang direkam (dari kiri ke kanan) dengan 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, dan 10,0% mol DPS. Polimer yang didukung bilayers lipid planar

Untuk membangun polimer yang didukung planar lipid bilayers, lipid monolayers terdiri dari POPC dan DPS pertama kali disimpan ke kuarsa dengan perendaman vertikal mikroskop kuarsa slide melalui monolayers yang dikompresi sampai 32 mN / m pada palung Langmuir. Mol fraksi DPS yang bervariasi antara 1% dan 10%. Rasio perpindahan Lipid (Area dihapus dari daerah antarmuka udara-air / permukaan substrat) secara rutin ditentukan dan ditemukan mendekati 100%, sama sekali konsentrasi DPS. Polimer-didukung planar bilayers kemudian diselesaikan dengan menggabungkan unilamelar POPC vesikel ke monolayer didukung (Kalb et al., 1992). Gambar. 4 menunjukkan mikrograf fluoresensi polimer- bilayers lipid didukung diambil pada waktu yang berbeda selama pembentukan bilayers dengan konsentrasi yang berbeda DPS. Dalam percobaan ini, dalam DPS yang mengandung monolayer diberi label dengan 2 mol% NBD-eggPE. Beberapa menarik rincian struktural yang unik untuk ini pendukung polimer bilayers diamati dalam proses percobaan ini. Pada saat-saat awal, ketika bilayers masih lengkap, lubang serta dua jenis cacat yang stripe sering diamati. Cacat ini "sembuh" dalam waktu sekitar 30 menit sebagai penyebaran lipid dan fluoresensi menjadi seragam di seluruh bidang pandang. Vertikal bergaris pola adalah karena reologi dan pembasahan perilaku polimer karena mereka tidak pernah diamati pada didukung bilayers tanpa polimer dan karena mereka selalu berorientasi sejajar dengan arah lapisan monolayer pada palung Langmuir. Sebagai konsentrasi DPS meningkat sampai 5% mol, garis-garis vertikal menjadi sempit dan kurang menonjol, sampai mereka tidak lagi lateral diselesaikan dengan mikroskop epifluorescence konvensional. Pada sangat tinggi konsentrasi DPS, misalnya, 10% mol DPS seperti ditunjukkan pada Gambar. 5 A, pola yang kompleks muncul yang berlangsung untuk waktu yang lama kali (hari). Pola-pola ini, yang hanya bisa diamati dengan baik atas transisi mushroom-to-brush polimer, mengungkapkan struktur domain di bilayers pada padat PEG. Penafsiran kami bahwa tekstur ini merupakan lipid domain dengan kapasitas partisi yang berbeda dari NBDeggPE didukung oleh photobleaching percobaan yang disajikan pada Gambar. 5 B. Dalam eksperimen ini, pola garis adalah dicitrakan ke bilayer, dan fluorophores tanpa kondom adalah photolyzed oleh pulsa singkat sinar laser. Pola stripe bertahan hingga 1 jam setelah penghapusan masker pemutih dan mengungkapkan kontras yang lebih baik antara gelap dan terang domain lipid. Jelas, NBD-eggPE bergerak bebas oleh difusi lateral yang melalui domain cerah terhubung tapi tidak partisi ke dalam gelap domain photobleached. Ketika monolayers luar diberi label dengan 2 mol% NBD-eggPE, seragam dan hampir bebas cacat

fluoresensi diamati pada konsentrasi DPS hingga 10 mol% (Gambar 5 C). Fluoresensi di daerah photobleached pulih benar-benar di 3 mol% dan hampir sepenuhnya pada 10 mol% 1 menit setelah photobleaching. Untuk menunjukkan kontinuitas lateral dan untuk menyelidiki fluiddynamic struktur bilayers lipid polimer yang didukung, kami mengukur koefisien difusi lateral dan fraksi ponsel dari lipid oleh FRAP. Gambar. 6 menunjukkan dua parameter diplot sebagai fungsi dari konsentrasi DPS. Itu dalam DPS yang mengandung monolayer diberi label dengan 2 mol% NBD-eggPE dalam percobaan ini. Dalam DPS rendah dan tinggi rezim konsentrasi, koefisien difusi lateral yang yang tinggi (1-1,5 X 10-8 cm2 / s), yaitu, sebanding dengan yang sebelumnya diukur dalam bilayers yang langsung didukung pada silikat substrat (Tamm, 1988;. Kalb et al, 1992). Itu fraksi ponsel juga tinggi (70-80%) sampai dengan ~4 mol% DPS, namun turun menjadi ~50% dalam transisi relatif tajam di atas 4% mol DPS. Di dalam dan dekat dengan transisi ini wilayah lipid koefisien difusi lateral yang sedikit menurun menjadi ~0,7 X 10-8 cm2 / s. Karena semua pemulihan FRAP kurva yang cocok untuk eksponensial tunggal (sesuai dengan yang menyebarkan spesies tunggal), adalah mungkin bahwa diukur koefisien difusi rendah di wilayah transisi sebenarnya merupakan dua proses difusi yang belum terselesaikan yang mungkin diharapkan sistem dua komponen. Semakin lambat Komponen menjadi benar-benar bergerak pada skala waktu ini FRAP eksperimen tertentu hanya di atas 6% mol DPS. Pada ambang batas yang sama, kita mulai melihat domain yang disajikan pada Gambar. 5. Hilangnya fraksi ponsel berkorelasi cukup baik dengan transisi jamur-to-sikat dari polimer pendukung seperti yang diperkirakan oleh de Gennes Teori scaling (Gambar 2). Namun, koefisien difusi lipid melaporkan transisi yang lebih luas dari yang diperkirakan oleh ideal dua negara transisi, mungkin karena mereka lebih sensitif terhadap perubahan halus dalam polimer yang mendasari. Difusi lateral lipid dalam monolayer luar hanya diukur pada 3 dan 10 mol% DPS, yaitu, kondisi gambar yang ditampilkan pada Gambar. 5 C. Koefisien difusi lateral yang yang mendekati 1? 10? 8 cm2 / s pada kedua konsentrasi DPS, tapi fraksi ponsel menurun dari 68,0? 1,1-52,8? 4.7 ketika konsentrasi DPS meningkat 3 sampai 10 mol%. Tabel 1 membandingkan sifat difusi lipid dalam monolayer luar dengan orang-orang dari dalam monolayer pada dukungan yang berbeda. Koefisien difusi lateral yang dan fraksinya mobile dari monolayers luar erat cocok mereka dari monolayer batin bagi masing-masing polimer Kondisi yang diperiksa dalam hal ini. Hasil Gambar. 4, 5, dan 6 dan Tabel 1 menunjukkan bahwa konsentrasi polimer tepat di bawah transisi mushroon -to-brush memegang paling

menjanjikan untuk pemulihan membran terpisahkan protein menjadi polimer didukung bilayers lipid. Oleh karena itu, kami memilih 3 mol% DPS untuk eksperimen lebih lanjut untuk menguji pengaruh tethering kovalen dari polimer substrat dan pemulihan protein membran menjadi sembuh (ditambatkan) dan diawetkan (sebagian ditambatkan) polimer bilayers lipid didukung.

GAMBAR 4 mikrograf epifluorescence polimer-didukung bilayers lipid selama pembentukan bilayer. Pada monolayer dalam menghadapi substrat padat diberi label dengan 2 mol% NBD-eggPE. Konsentrasi DPS di monolayer batin 1.0 mol% (A), 2,5 mol% (B), dan 5,0 mol% (C). Berbagai jenis cacat terlihat untuk "menyembuhkan" di polymersupported bilayers (lihat teks untuk lebih detail). Profil intensitas fluoresensi sepanjang garis yang ditandai akan ditunjukkan dalam A. Penerangan lapangan tidak seragam karena Gaussian profil balok dan pola interferensi disebabkan oleh benda outof-focus di jalur sinar laser koheren. Diameter dari lingkaran diamati daerah 150 m.

GAMBAR 5 mikrograf epifluorescence polimer-didukung bilayers lipid mengandung 10 atau 3 mol% DPS. (A) dalam menangani monolayer substrat padat diberi label dengan 2 mol% NBD-eggPE. (B) Sebuah urutan gambar dari daerah yang berbeda yang sama seperti pada A, sebelum dan 2, 5, dan 60 menit setelah pola garis photobleached dalam membran. penelitian ini meningkatkan perbedaan yang kontras antara domain membran cepat dan lambat dalam menyebarkan NBD-eggPE di bilayers lipid yang didukung oleh polimer padat sikat. (C) monolayer luar menghadap kompartemen berair besar ditandai dengan 2 mol% NBD-eggPE. distribusi fluoresensi seragam dalam sampel tersebut (lihat Gambar legenda. 4 untuk efek yang disebabkan oleh laser yang iluminasi). Fluoresensi memiliki disetimbangkan sepenuhnya (3 mol%) atau hampir sepenuhnya (10 mol%) 1 menit setelah satu garis Pola itu photobleached ke dalam membran (mikrograf kedua dan sebagainya dalam seri ini). Diameter dari daerah yang diamati melingkar 150 m.

GAMBAR 6 difusi lateral probe lipid NBD-eggPE di DPSsupported Bilayers POPC sebagai fungsi konsentrasi DPS. Lateral koefisien difusi dan fraksi mobile menjalani transisi dekat diprediksi jamur-menuju-sikat transisi. Monolayer dalam menghadapi substrat padat diberi label dengan 2 mol% NBD-eggPE. Setiap titik data merupakan rata-rata 15-20 pengukuran dari tiga berbeda bilayers. Ikatan polimer yang didukung bilayers lipid planar Ikatan kovalen dari molekul DPS dengan menyembuhkan silan bagian ke silanols gratis slide kuarsa diperiksa melalui XPS. Sebuah DPS monolayer murni dipindahkan ke kuarsa seperti dijelaskan di atas, sembuh pada 70 C selama 40 menit, dan dianalisis dengan XPS (Gambar 7). Spektrum dari permukaan kuarsa bersih, monolayer PEG2000-DMPE (PEG lipid tanpa linker silan), dan DPS monolayer diawetkan juga ditampilkan untuk perbandingan. Dalam eksperimen ini setiap noncovalently molekul terkait dihapus dengan seksama membilas permukaan dengan metanol sebelum XPS spektrum yang direkam. Spektra menunjukkan energi elektron yang dilepaskan dari beberapa kerang (seperti yang ditugaskan) dari berbagai elemen yang hadir pada permukaan setiap sampel. kuarsa murni dan sampel PEG2000-DMPE menunjukkan oksigen yang kuat puncak, sedangkan puncak karbon mendominasi spektrum sampel DPS. Karena spektra fotoelektron didominasi oleh unsur-unsur yang hadir di bagian paling permukaan sampel, kami menyimpulkan bahwa dalam kontras dengan DPS sembuh, PEG2000-DMPE tidak mengikat kuarsa. DPS diawetkan sampel menunjukkan sebuah karbon / oksigen rasio menengah, menunjukkan bahwa bahkan tanpa DPS menyembuhkan sebagian bereaksi dengan permukaan. The C1s puncak yang muncul dari valensi karbon elektron dapat lebih energi dianalisis untuk berbagai

kovalen obligasi yang bentuk karbon dalam sampel (Gambar 7, inset). Puncak ini menampilkan komponen utama dengan energi yang mengikat dari 286,0 eV, yaitu, sangat mirip dengan nilai karbon dilaporkan sebelumnya untuk PEG (Thomas dan O'Malley, 1979). Komponen utama lainnya di 287,8 eV adalah karakteristik untuk kelompok ester karbon dalam DMPE. Sebuah rasio 2.3:1 ditentukan dari area di bawah puncak PEG dari C1s dan O1s (286,5 dan 533,3 eV), masing-masing, setelah kalibrasi dengan faktor sensitivitas yang sesuai. Rasio ini sangat dekat dengan Rasio 2:1 dilaporkan sebelumnya untuk permukaan padat PEG (Thomas dan O'Malley, 1979). Ditambatkan bilayers lipid polimer didukung terdiri dari POPC dan 3 mol% DPS dalam leaflet dalam dan 2 mol% NBD-eggPE di leaflet luar dibuat seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Mereka tampak seragam dengan epifluorescence mikroskop, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5 C untuk sesuai diawetkan polimer didukung bilayers. difusi lateral eksperimen menghasilkan koefisien difusi lateral yang dari (0,89 0,08) X 10-8 cm2/s dan fraksi mobile 66,5? 1,4%, yaitu, tidak jauh berbeda dengan nilainilai diukur dalam sesuai diawetkan DPS didukung bilayers (Tabel 1). Rekonstitusi dan difusi lateral b5 sitokrom B5 sitokrom adalah protein dua domain dengan bulat kecil domain (Mr=11.000) dan peptida hidrofobik (Mr = 4200) yang menembus jauh ke dalam lapisan ganda lipid. Kami memilih protein ini sebagai pertama uji integral protein membran kami untuk arsitektur yang relatif sederhana dan ketersediaan siap. Fluorescein-berlabel b5 sitokrom dilarutkan ke bilayers didukung pada lipid / protein rasio 40:1 oleh fusi dari proteoliposomes (L / P 20:1) ke monolayers didukung (lihat Bahan dan Metode). seragam neon bilayers diperoleh pada kuarsa, pada DPS bantal, dan ditambatkan DPS bantal (Gambar 8 A, gambar pertama dari kiri). Kami mengukur mobilitas lateral b 5 sitokrom oleh FRAP dalam semua tiga sistem dan diperiksa mikrograf epifluorescence dengan pola garis photobleached untuk waktu yang lama waktu untuk mendeteksi lebih lambat komponen menyebar. Sebuah contoh dari kurva FRAP dari b5 sitokrom dalam ditambatkan polimer yang didukung bilayer ditunjukkan pada Gambar. 8 B. 27 persen dari b5 sitokrom dilarutkan disebarkan dengan koefisien difusi lateral 1.4 X 10 -8 cm2 / s. Lima puluh sampai enam puluh persen fluoresensi pulih lebih skala waktu ~ 10 menit, seperti terbukti dari hilangnya lambat garis-garis dikelantang ditunjukkan pada Gambar. 8 A. koefisien difusi lateral komponen ini lebih lambat diperkirakan dari mikrograf ini menjadi ~2 X 10 -10 cm2 / s. Sisanya 10-20% b5 sitokrom itu bergerak, bahkan pada skala

waktu. Fraksi kecil ini bisa disebabkan protein agregat atau protein yang bergerak di cacat terlihat kecil dalam bilayer. Berbeda dengan sitokrom b 5 di bilayers polimer yang didukung, sitokrom b5 di bilayers yang langsung didukung pada kuarsa menunjukkan sebagian ponsel yang lebih kecil (20%) yang lebih cepat komponen (Gambar 8 B, garis putus-putus), dan sisanya 80% dari sitokrom b5 adalah lateral bergerak pada waktu 1030 menit- skala. Koefisien difusi lateral dan fraksi ponsel rata-rata dari percobaan lebih b5 sitokrom dalam tiga jenis bilayers didukung tercantum pada Tabel 2. Data yang sama juga diperoleh pada konsentrasi protein yang dua atau lima kali lebih kecil. Difusi lateral yang koefisien dan fraksi mobile 2 mol% NBD-eggPE yang termasuk dalam monolayer luar tidak terpengaruh atau hanya sedikit berkurang dengan adanya berlabel sitokrom b5 yang dilarutkan pada lipid / protein rasio 83:1 (Tabel 1).

Binding dan lateral difusi annexin V Sebagai contoh protein multihelical yang mengikat dan kemungkinan menembus bilayers lipid untuk beberapa derajat dalam Ca2+ tergantung, kami meneliti morfologi bilayer dan perilaku difusi annexin V di bermuatan negatif . bilayers pada dukungan yang berbeda. Fluorescein-berlabel Annexin V terikat dari solusi untuk preformed asimetris POPC / POPC: POPG (9:1) bilayers pada kuarsa murni, DPS / kuarsa, dan ditambatkan DPS / kuarsa di hadapan 1 Mm Ca 2. Konsentrasi menjenuhkan dari 56 nM annexin V adalah digunakan dalam semua tiga kasus. Distribusi fluoresensi adalah homogen untuk Annexin V terikat ketiga jenis bilayers didukung (Gbr. 9 A). Seperti diamati dengan sitokrom b5, percobaan FRAP menunjukkan dua komponen membran-terikat annexin V dengan mobilitas lateral yang berbeda. komponen cepat diamati (Gambar 9 B dan Tabel 2), yang berhubungan dengan 21%, 45%, dan 33% dari terikat annexin V pada kuarsa yang didukung, DPS-didukung, dan ditambatkan bilayers DPS-didukung, masing-masing. Lateral koefisien difusi komponen ini berkisar dari 1.6

X 10-9 sampai 3,0 X 10-9 cm2 / s, yaitu, mereka sekitar tiga sampai enam kali lebih lambat dari komponen lebih cepat dari sitokrom b5 (Tabel 2). Seperti b5 sitokrom, lebih lambat Komponen menyebarkan diamati dengan annexin V (Gambar 9 A). Fluoresensi pulih sepenuhnya setelah 5-10 menit, menghasilkan koefisien difusi ~4 X10-10 cm2 / s, yaitu, sekitar dua kali lebih cepat sebagai komponen lambat dari sitokrom b 5 (Tabel 2). Tidak ada komponen bergerak yang diamati untuk Annexin V pada ditambatkan polimer yang didukung bilayers, sedangkan 70-80% dari annexin V adalah bergerak di bilayers kuarsa yang didukung.

GAMBAR 7 X-ray spektra fotoelektron menunjukkan tethering kovalen dari DPS molekul ke permukaan kuarsa. Spektrum dari depan ke belakang diperoleh dengan sampel disembuhkan DPS, sampel diawetkan DPS, sampel dari PEG2000-DMPE, dan murni permukaan kuarsa, masing-masing. Sampel dengan monolayers dicuci dengan metanol untuk menghapus noncovalently terikat lipid polimer. Puncak dari KLL dan elektron valensi kerang dari elemen yang berbeda ditugaskan sebagai ditandai. Inset menunjukkan analisis puncak C1s dengan fit sampai tiga Gaussian komponen (2 1.3 x 10-4). Itu Komponen utama di 286,0 eV diberikan untuk PEG, dan terbesar kedua komponen pada 287,8 eV ditugaskan untuk kelompok ester karbon lipid.

GAMBAR 8 difusi lateral b5 sitokrom dalam ditambatkan DPS didukung lipid bilayer. (A) mikrograf epifluorescence (diameter 150 M) menunjukkan distribusi fluoresceinberlabel b5 sitokrom dilarutkan dalam ditambatkan DPS didukung POPC bilayer sebelum dan 30 detik, 5 menit, dan 10 menit setelah pola garis periodik telah diputihkan ke membran. Penelitian ini mengungkapkan perlahan (~2 X 10
-10

cm2/ s) komponen

menyebar b5 dari sitokrom. DPS konsentrasi dalam batin, substrat terpajan monolayer adalah 3 mol%, dan rasio lipid / protein 40:1. (B) FRAP eksperimen lapisan ganda yang sama seperti pada A, menunjukkan cepat (1.4 X 10
-8

cm2 / s) Komponen difusi b5

sitokrom. Garis padat adalah eksponensial tunggal cocok dengan data eksperimen. Garis putus-putus ditampilkan untuk perbandingan dan menunjukkan satu eksponensial fit dari eksperimen FRAP dilakukan pada b 5 sitokrom yang dilarutkan ke dalam lipid bilayer kuarsa yang didukung tanpa bantal polimer. Komponen lebih lambat menyebar tidak diamati (bergerak) di bawah kondisi ini. PEMBAHASAN Kami telah menghasilkan ditambatkan lipid polimer baru yang didukung sistem bilayer yang meningkatkan fraksi mobile beberapa protein membran ketika terintegrasi

atau terikat didukung bilayers lipid. Sebuah bantal PEG dengan ujung linier polimer kovalen terkait dengan dukungan yang solid hidrofilik dan membran, masing-masing, terbukti berhasil. Seragam bilayers neon menunjukkan hampir tak terbatas difusi lipid di kedua selebaran bilayer diperoleh atas bantal kepadatan polimer moderat. Dua protein tes, b5 sitokrom dan annexin V, ditahan hampir penuh lateralis mobilitas ketika terikat atau dimasukkan ke dalam polimer yang didukung bilayers. Kedua protein dipamerkan dua komponen lateral yang difusi pada lembut mendukung dengan terbatas dan komponen dibatasi sebagian. Ketika langsung didukung pada kuarsa atau kaca, komponen difusi lambat dari kedua protein benar-benar bergerak, menunjukkan kemampuan bantal PEG untuk melepaskan protein dari dukungan yang solid. B 5 sitokrom dan annexin V diperkirakan untuk memasukkan ke bilayers lipid dengan modus yang berbeda interaksi. Sitokrom b5 memiliki hidrofobik tunggal heliks peptida yang menembus jauh ke dalam lapisan ganda lipid (Holloway dan Buchheit, 1990; Ladokhin dan Holloway, 1991, 1995). Apakah itu benar-benar meliputi seluruh ketebalan lapisan ganda lipid masih suatu hal perdebatan, meskipun data terbaru mendukung transbilayer sebuah Orientasi (Verge `res et al., 1995). Dalam kasus apapun, kami amati ~ 25% dari b5 sitokrom menyebar dengan lateral koefisien difusi ~1.3 X 10 -8 cm2 / s pada ditambatkan bantal polimer (Tabel 2). Hal ini secepat lipid diri dalam sistem yang sama (Gambar 6 dan Tabel 1) dan khas terbatas difusi protein dalam lipid bilayer. Lima puluh sampai enam puluh persen b5 sitokrom berdifusi dengan koefisien difusi lateral ~2 X 10
-10

cm2 / s pada polimer. Penjelasan paling sederhana

untuk 60 - Koefisien difusi lateral yang lebih rendah 70 kali lipat dari populasi ini mobilitas lateral yang terbatas adalah bahwa molekul ini kolam renang berinteraksi lemah dengan jaringan polimer yang mendasarinya. Pengukuran difusi massal seperti yang digunakan dalam penelitian ini tidak bisa memberikan detail tentang interaksi molekul individu dengan polimer. Ada kemungkinan bahwa molekul dalam hal ini lebih perlahan-lahan penduduk menyebarkan transiently memasang dan melepas dari polimer. Hasil bersih dari eksperimen FRAP di skenario seperti itu bisa jadi koefisien difusi pada urutan 10- 10 cm2 / s, seperti yang diamati. Percobaan tunggal-molekul akan diperlukan untuk mendeteksi gerakan homogen di bilayers didukung (Schu tz et al., 1997). Menariknya, banyak protein membran integral dalam membran sel berdifusi dengan tingkat lambat serupa, dan mobilitas lateral yang mereka dianggap dibatasi oleh interaksi dengan mendasari dipolimerisasi jaringan sitoskeleton (Edidin et al.,1994, Saxton dan Jacobson, 1997). Evans dan Sackmann (1988) memperpanjang Saffmann-

Delbru persamaan ck untuk difusi lateral protein membran dengan situasi di mana gesekan antara protein dan menengah mandi (Polimer dalam kasus kami) tidak dapat diabaikan dibandingkan dengan tarik kental dalam lapisan ganda lipid. Dalam kondisi seperti mereka menemukan

dimana DL adalah koefisien difusi lateral, m dan w adalah para microviscosities dari membran dan mandi solusi, masing-masing, R adalah jari-jari partikel menyebar (diperkirakan sebagai silinder), dw adalah ketebalan pelumas yang film berair, dan K
0,1

adalah fungsi Bessel dari jenis kedua. Istilah pertama dalam kurung dalam Pers. 6 menggambarkan penghubung antara partikel menyebar dan mandi yang solusi, dan kedua istilah yang sesuai dengan klasik Saffman-Delbru ck hukum logaritmik. Ketika kopling menjadi faktor dominan ( 1) menentukan difusi, kita dapat memperkirakan tarik kental yang diberikan oleh Film polimer pada protein dari pendekatan yang

Menggunakan radius 6 untuk helix b5 sitokrom, kami menghitung koefisien gesekan w / dw 1,80 X 10-7 dyn s/cm3 untuk interaksi protein dengan polimer Film. Dengan asumsi lebih lanjut bahwa film polimer adalah 50 tebal ( Atau > Radius Flory), kita memperoleh microviscosity dari 9 Ketenangan dalam film polimer. Ini adalah sekitar sembilan kali lebih besar dari microviscosity bahwa pengalaman protein dalam lapisan ganda lipid sendiri (Vaz et al., 1984). The "microviscosity" ditentukan menggunakan protein sebagai probe dalam waktu yang relatif padat polimer kemungkinan untuk skala dengan ukuran probe (protein), ketebalan film, dan kepadatan polimer. Hal itu tidak boleh dianggap universal "Materi konstanta" untuk sistem ini. Annexin V adalah molekul berbentuk disk yang terdiri dari empat domain dari lima heliks masing-masing yang disusun di sekitar pseudofourfold sumbu simetri (Huber dkk., 1990). Itu protein mengikat bilayers bermuatan negatif di Ca
2+

- tergantung dengan berorientasi paralel

disk-nya ke permukaan membran. Hal ini juga memiliki kemampuan untuk mengkristal

dalam kisi dua dimensi pada permukaan membran (Voges et al, 1994;. Reviakine et al, 1998).. Di antara yang diusulkan fungsi annexin V dan anggota lain dari annexin keluarga keterlibatan mereka dalam fusi membran Ca2- dipicu eksositosis, perdagangan vesikular, dan saluran ionformasi (Seaton, 1996). Fungsi ini menunjukkan bahwa interaksi annexins dengan bilayers lipid mungkin lebih intim daripada murni elektrostatik. Misalnya, annexin V menginduksi saluran Ca
2-

selektif dalam bilayers

lipid (Berendes et al., 1993) dan secara signifikan mengurangi difusi lateral pid dalam bilayers lipid buatan (Gilmanshin et al, 1994.; Ce'zanne et al., 1999). Bukti terbaru dari situs-diarahkan spin-label, photoaffinity pelabelan, dan Triton X-114 partisi menunjukkan bahwa dalam kondisi agak asam annexins V dan XII menembus bilayers lipid sepenuhnya dalam mengikat Reaksi yang melibatkan konformasi sepenuhnya reversibel perubahan (Langen et al, 1998;. ISA et al, 2000.). Mengenai b5 sitokrom, kami menemukan difusi dua komponen annexin V di ditambatkan bilayers polimer yang didukung. Namun, komponen cepat (~33%) lebih lambat (~3 X 10-9 cm2 / s, Tabel 2) dibandingkan b5 sitokrom. Koefisien difusi ini mirip dengan yang dari lipid diri dalam 10 mol% POPG bilayer dengan terikat annexin IV (Gilmanshin et al., 1994) dan mencerminkan perubahan umum dalam sifat-sifat dinamis dari lapisan ganda lipid di hadapan annexins. Itu komponen lebih lambat (60-70%) adalah serupa dengan sitokrom b5 (~4 X 10-10 cm2/ s) dan disebabkan oleh polimer. Komponen ini bergerak dalam ketiadaan polimer. Yang terbatas mobilitas annexin V bisa dipastikan disebabkan oleh kecenderungan untuk diri-asosiasi lateral pada permukaan membran. Kristalisasi pada bilayers keras yang didukung mungkin lebih lengkap daripada yang di soft-didukung bilayers. Atau, mungkin sebagian annexin menembus bilayer secara Ca 2 tergantung reversibel. Menggunakan pendekatan yang sama seperti di atas untuk b5 sitokrom, kami menghitung koefisien gesek 5,6 X 10-5 dyn s/cm3 dan microviscosity sebuah dari 0,28 Ketenangan. Nilai-nilai ini jauh lebih rendah daripada nilai-nilai yang sesuai b 5 sitokrom, yang konsisten dengan gagasan bahwa annexin V berinteraksi lemah dengan lapisan polimer tetapi tidak signifikan menembus itu. Struktur PEG dicangkokkan ke monolayers lipid memiliki telah dipelajari sebelumnya pada antarmuka udara-air Langmuir sebuah palung atau monolayers didukung dengan x-ray dan neutron reflectometry, serta dengan termodinamika dan microfluorescence teknik (Baekmark et al, 1995;. Kuhl et al. 1994, 1998; Majewski et al, 1997, 1998a,.. Rex et al, 1998). Geometri dan tujuan dari penelitian sebelumnya pada dasarnya berbeda dari orangorang yang hadir bekerja. Fokus utama dari studi sebelumnya pada perilaku rantai PEG

dicangkokkan yang menghadapi larutan jauh dari substrat. Sebaliknya, di pekerjaan ini kami telah mempelajari polimer yang terjepit antara dukungan solid dan membran cairan. Beberapa hasil penting muncul dari penelitian sebelumnya pada polimer dicangkokkan yang juga mungkin relevan untuk terjepit polimer ditambatkan. Transisi antara "jamur" dan "sikat" negara polimer jelas terungkap dalam sistem monolayer. Sebagai contoh, panjang ekstensi dari polimer atas permukaan meningkat setelah pergi dari 4,5% (jamur) sampai 9% (sikat) PEG2000-DSPE dari 40 sampai 70 bila diukur dengan alat kekuatan permukaan (Kuhl et al., 1994) atau 45-60 bila diukur dengan neutron reflectometry (Kuhl et al., 1998). PEG2000-DSPE memiliki 45 unit monomer dan akibatnya Flory kecil radius (35 ) dari molekul DPS kami. Oleh karena itu, bahkan bawah transisi jamur-to-sikat polimer ini muncul menjadi sedikit lebih luas daripada yang diantisipasi dari sederhana de Gennes-Flory prediksi. Hasil ini setuju dengan temuan bahwa rantai PEG mulai berinteraksi dengan satu sama lain sudah pada kepadatan permukaan yang relatif rendah, yang dapat dilihat dalam Langmuir isoterm tekanan-daerah yang sebelumnya diterbitkan untuk PEG2000-DSPE oleh beberapa penulis (Baekmark et al, 1995;.. Majewski et al, 1997, 1998a) dan direproduksi di sini untuk DSP (Gambar 3). Dalam hal ini konteks, menarik untuk dicatat bahwa kami mengamati transisi lateral difusi lipid sekitar 4-5% mol DPS (Gambar 6). Meskipun tidak langsung terdeteksi oleh perilaku fluida dinamis dari lapisan ganda lipid dicangkokkan, ini mungkin eksperimental pertama bukti adanya transisi jamur-to-kuas tipis, terjepit film polimer. Sebuah properti menarik dan berguna, untuk aplikasi praktis, dari bilayers DSP yang didukung adalah bahwa mereka tampaknya "Menyembuhkan" cacat kecil lebih mudah daripada bilayers lipid yang langsung didukung pada kuarsa atau kaca (Gambar 4). Surat edaran cacat seperti yang terlihat pada Gambar. 4 mikrograf A (pertama dari kiri) kadang-kadang diamati pada bilayers silikat yang didukung (Lihat, misalnya, Tamm dan McConnell, 1985). Namun, mereka tampaknya lebih permanen pada mendukung hidrofilik keras, di mana mereka biasanya tidak hilang begitu mereka terbentuk. Semakin kecil cacat garis vertikal Gambar. 4, A dan B, tidak diamati pada bilayers silikat yang didukung, tetapi mereka muncul untuk menyembuhkan cukup baik dalam bilayers PEG yang didukung dalam kondisi pH netral. Sebuah rendah penyembuhan pH-diinduksi bilayers didukung melalui mekanis diinduksi goresan pada permukaan kaca telah dijelaskan dalam beberapa detail (Cremer dan Boxer, 1999; Cremer et al, 1999).. Kami tidak sepenuhnya memahami mekanisme (s) dari proses penyembuhan (es) di sistem bilayer polimer yang didukung kami. Ada

kemungkinan bahwa polimer ketidaksempurnaan topeng pada substrat padat dan sehingga memberikan permukaan yang lebih halus dan lebih dinamis untuk vesikel menyebar. Cacat line dan hilangnya mereka lambat mungkin juga bisa disebabkan oleh pengeringan dan parsial pengeringan polimer selama deposisi Langmuir-Blodgett dari monolayer dalam dan berikutnya (lambat) rehidrasi polimer selama vesikel menyebar. Apa pun mekanisme, kemampuan penyembuhan semua diamati cacat terbesar tampaknya tepat di bawah jamur-to-sikat transisi, yang merupakan alasan utama mengapa kami memilih 3 mol%. DPS sebagai konsentrasi polimer yang optimal kami. Bila didukung PEG di wilayah sikat (10 mol% DPS), bilayer mensegregasikan lateral ke mikroskopis tapi terhubung lipid domain (Gambar 5, A dan B). Sangat mungkin bahwa domain ini mencerminkan mendasari heterogenitas lateral polimer sikat. Domain yang bergarisgaris, dengan garis-garis berorientasi tegak lurus terhadap arah pelapisan LangmuirBlodgett. Meskipun fraksi seluler (dan koefisien difusi) hampir sama ketika monolayers dalam atau luar pada 10 mol% DPS diberi label (Tabel 1), distribusi fluoresensi dalam monolayer luar adalah lebih seragam daripada di monolayer dalam (Gambar 5, A dan C). Ini bisa menunjukkan ketidakcocokan antara domain lipid dari dalam dan luar monolayers. Atau, vesikel penyebaran dapat mengisi sudah ada sebelumnya lubang atau cacat pada monolayer batin. Bahkan jika struktur yang terlihat pada Gambar. 5, A dan B, bertahan selama lebih dari satu jam, mereka masih bisa kinetis terperangkap, daripada struktur keseimbangan. Pekerjaan lebih lanjut diperlukan untuk memilahmilah berbagai kemungkinan-kemungkinan. Namun, karena fokus penelitian ini adalah untuk menemukan yang terbaik dan paling seragam kondisi bilayer membran protein untuk pemulihan, kami tidak mencoba untuk lebih mencirikan bilayers pada polimer kuas. Sebagai kesimpulan, kami telah menunjukkan bahwa PEG-lipid yang kovalen ditambatkan ke permukaan substrat silikat pada konsentrasi yang tepat membentuk bantal yang layak untuk didukung bilayers lipid dengan pesanan jangka panjang dan jangka panjang stabilitas. Yang paling penting, bantal ini mendukung penuh lateralis difusi dua protein membran yang tidak bebas untuk berdifusi ketika terikat atau dimasukkan ke dalam gelas-atau quartzsupported bilayers. Namun, fraksi yang signifikan dari protein membran menunjukkan difusi lateral yang dibatasi, mungkin karena viscous coupling mereka ke polimer mendukung. Koefisien difusi terbatas berada di urutan 10
-10

cm2 / s dan mirip dengan yang diukur selama bertahun- protein

membran integral dalam sel. The kental kopling protein dengan polimer PEG demikian

dapat menyerupai viscous coupling protein membran yang mendasari sitoskeleton dalam sel. Kami belum tahu apakah kami desain polimer yang didukung bilayers dapat digeneralisasi untuk dengan pemulihan fungsional protein membran lainnya dan reseptor dengan domain hidrofilik yang lebih besar. Perbaikan lebih lanjut metode mungkin diperlukan untuk mencapai hal ini umum Tujuan. Struktur bilayers polimer yang didukung juga perlu diselidiki pada resolusi yang lebih tinggi dengan tepat teknik. Ini akan menjadi upaya layak usaha dan melengkapi morfologi dan cairan karakterisasi dinamis bilayers dengan dan tanpa protein yang telah kami sajikan dalam pekerjaan ini. Kami percayabahwa pendekatan baru kami untuk membran protein pemulihan menjadi polimer yang didukung bilayers merupakan langkah lebih lanjut arah setia meniru permukaan sel di bawah terkontrol kondisi pada mendukung buatan.

GAMBAR 9 difusi lateral annexin V dalam ditambatkan DPS didukung lipid bilayer. (A) mikrograf epifluorescence (diameter 150? M) menunjukkan distribusi fluoresceinberlabel Annexin V terikat dari 56 nM solusi di hadapan 1 mM Ca2 ke ditambatkan

asimetris DPS didukung POPC / POPC: POPG (9:1) bilayer sebelum dan 30 detik, 1 menit, dan 5 menit setelah pola garis periodik telah diputihkan ke membran. Penelitian ini mengungkapkan perlahan menyebar (~4 X 10
-10

cm2 / s) komponen Annexin V.

DPS konsentrasi di bagian dalam, substrat terpajan monolayer adalah 3% mol. (B) percobaan FRAP lapisan ganda yang sama seperti pada A, menunjukkan relatif cepat (4 x 10- 9 cm2 / s) komponen difusi annexin V. Garis padat adalah satu eksponensial cocok dengan data eksperimen. Itu garis putus-putus ditampilkan untuk perbandingan dan menunjukkan satu eksponensial cocok percobaan FRAP dilakukan pada annexin V yang terikat ke quartzsupported lipid bilayer tanpa bantal polimer. Semakin lambat Komponen menyebarkan tidak diamati (bergerak) di bawah kondisi ini. Kami berterima kasih kepada Dr Peter Holloway untuk hadiah jenis b 5 sitokrom, Catherine Dukes bantuan dengan percobaan XPS, dan anggota Tamm yang laboratorium untuk berbagai diskusi membantu.