PEMBAHASAN STERILISASI Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus selalu dalam keadaan steril.

Artinya alat dan bahan tersebut harus bebas dari segala mikrobia yang dapat mengganggu atau merusak media yang ingin dibuat. Proses mensterilkan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam mikrobia yang tidak diingankan inilah yang disebut sterilisasi. Pada prinsipnya, sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara, yaitu fisik, mekanik, dan kimia. Dalam percobaan ini digunakan sterilisasi secara fisik dengan pemanasan kering (oven) dan pemanasan basah bertekanan (autoklaf), serta laminair flow dan inkubator. Sterilisasi secara mekanik dengan penyaringan menggunakan millipore filter dan vacuum filter. 1. Autoklaf Alat ini juga termasuk salah satu alat dalam teknik sterilisasi panas. Alat ini menggunakan panas basah bertekanan. Prinsip kerja autoklaf adalah mensterilkan alat dan bahan dengan menggunakan tekanan uap optimum untuk sterilisasi pada tekanan 15 Psi dan suhu 121C. Autoklaf harus ditutup rapat agar tekanan uap optimum. Tekanan uap ini mampu membunuh mikrobia yang ada pada alat dan bahan. Sebelum mensterilkan alat, alat dibungkus dengan menggunakan kertas payung yang bertujuan agar setelah disterilisasi, alat tidak terkontaminasi atau tidak berhubungan langsung dengan udara luar. Cara menggunakan Autoklaf: a. Isi air dalam autoklaf kurang lebih 2 cm dibawah keranjang atau 3-5 liter air. b. Pastikan alat yang akan disterilkan dapat terkena uap dalam autoklaf. c. Tutup rapat autoklaf dan atur lama waktunya, sekitar 20 menit dan tekanan 1 atm. d. Pastikan tabung exhaust terbuka sedangkan tabung drainnya tertutup. e. Setelah uapnya keluar atau terdengar bunyi mendesis, segera tutup tabung exhaustnya. f. Saat alarm berbunyi yang menandakan bahwa sterilisasi telah selesai, jangan langsung membuka tutup autoklaf, tetapi tunggu hingga jarum tekanan menunjukkan angka 0. 3 hal penting yang harus diperhatikan dalam penggunaan autoklaf : 1. Udara yang ada didalam autoklaf harus dikeluarkan sebelum katub ditutup 2. Jangan membebani autoklaf secara berlebihan karena air pada wadahnya akan masuk dan membasahi alat atau bahan yang akan disterilisasi. 3. Pembungkusan dan pengemasan alat-alat yang akan disterilkan harus dilalukan dengan baik dan benar.

Pada sterilisasi dengan autoklaf uap harus bisa menembus seluruh muatan oleh karena itu dibungkus dengan kertas pembungkus, dan alat yang akan disterilkan dalam keadaan lembab, tidak basah langsung terkena air. Dengan demikian kertas pembungkus yang digunakan pun harus cepat kering dalam suhu normal. Lama sterilisasi dengan autoklaf tergantung dari sifat bahan, tipe wadah, dan volume bahan. Untuk bahan-bahan yang tidak dapat ditembus uap seperti minyak atau lemak, autoklaf menjadi tidak efektif. Autoklaf cocok untuk sterilisasi medium. Sterilisasi dengan autoklaf memiliki keuntungan sebagai berikut, efektif untuk sebagian besar mikroorganisme. Cepat sterilisasinya, panas dan tekanan menghemat waktu sterilisasi. Tidak menyebabkan kekeringan atau gosong untuk media cair atau gel, lebih efisien dari pada oven. Sedang kelemahannya adalah bahan atau alat harus dibungkus dengan kertas agar tidak basah, karena kertas yang digunakan akan cepat mongering pada suhu kamar. Harus memperhatikan tekanan agar tidak over pressure sehingga bida meledak. Tidak dapat mensterilkan bahan yang harus selalu kering, dimana mikrobia yang ada didalamnya tidak dapat ditembus oleh uap dan tetap bertahan hidup. Bahan hasil sterilisasi harus dikeringkan lagi sebelum digunakan agar tidak basah dan mudah terkontaminasi. Keuntungan sterilisasi secara fisik dengan pemanasan baik dengan autoklaf ataupun oven adalah suhu yang digunakan dapat diatur, cara kerjanya lebih aseptis, dan lebih efektif dibanding dengan cara sterilisasi yang lain. Kerugiannya jika dibandingkan denga alat-alat sterilisasi lain, sterilisasi secara fisik lebih tidak efisien karena harga dari alat tersebut dan penggunaan listrik yang berlebihan. Sterilisasi dengan cara ini tidak dapat digunakan untuk segala jenis bahan, yaitu untuk bahan yang tidak tahan panas. b. Oven Alat ini merupakan salah satu alat dalam teknik sterilisasi panas. Alat ini menggunakan panas kering. Dalam penggunaannya, alat ini di setting dalam suhu yang tinggi (160 atau 180C). Biasanya digunakan untuk mensterilkan alat-alat gelas. Kerja oven tergantung pada penetrasi panas melalui benda yang disterilkan. Bahan-bahan yang disterilisasi dengan oven adalah benda-benda yang tahan terhadap panas tinggi atau dengan isolasi termik. Lama waktu pemanasan harus disesuaikan. Jika bahan yang harus disterilkan memungkinkan, maka diadakan pemanasan pada suhu sekitar 170oC atau 180oC selama kurang lebih 60 menit. Oven mencapai suhu maksimum 200oC karena itu oven dapat digunakan sebagai pengganti inkubator yang hanya bersuhu 60oC. tetapi inkubator tidak dapat digunakan sebagi oven. Sterilisasi dengan oven memiliki keuntungan yaitu lebih efektif untuk bahan yang harus selalu dalam keadaan kering, dapat mensterilkan bahan tanpa harus membasahi, tidak tergantung tekanan dan dapat mencapai suhu sangat tinggi sekali yaitu 200oC. Sedangkan kelemahannya, panas yang diperlukan tinggi sekali, waktu pemanasan lama, dan biasanya bahan yang tidak tahan panas akan meleleh atau gosong. Tidak efisien, dan media gel atau cair akan kering. Cara menggunakan oven: 1. Oven dinyalakan dan suhunya diatur. Untuk sterilisasi biasanya menggunakan suhu 100-121oC selama 2 jam. Suhu oven dapat diatur sampai dengan 200oC.

2. Kemudian dilanjutkan dengan pengaturan waktu, yang harus disesuaikan dengan berat atau banyaknya muatan yang akan disterilisasi. 3. Penutup oven dibuka dan dimasukkan alat-alat atau bahan-bahan yang akan disterilisasi. Bahan atau alat yang disterilkan harus tahan terhadap suhu yang tinggi. 4. Setelah sterilisasi selesai oven dapat dimatikan, kemudian alat-alat dibiarkan tetap dalam oven selama beberapa waktu hingga suhu menjadi lebih rendah dan alat-alat tersebut dapat dikeluarkan. c. Inkubator Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Inkubator bukan merupakan alat khusus untuk proses sterilisasi akan tetapi lebih umum digunakan untuk tempat inkubasi suatu mikrobia dengan suhu yang konstan (60oC-80oC) yang dapat diatur dan memberikan suhu yang optimum untuk pertumbuhan bakteri atau mirobia. Bakteri atau mikrobia yang akan dibiakkan akan mengalami pertumbuhan yang optimum pada media dengan suhu sekitar 30oC-60oC dengan kebutuhan nutrient yang sesuai pula, inkubasi dilakukan agar mikrobia dapat tumbuh dan berkoloni secara optimum layaknya mikrobia tersebut hidup pada lingkungannya. Oleh karena itu inkubator berfungsi sebagai alat yang membantu untuk membiakkan mikrobia tersebut. Disamping itu inkubator juga dapat digunakan sebagai alat untuk mensterilkan media namun tidak dengan panas tinggi. Cara menggunakan inkubator 1. Inkubator dinyalakan dengan memutar panel power supply kearah hidup. 2. Lalu suhu yang dikehendaki diatur dengan pengatur suhu. 3. Media yang berisi mikroorganisme yang akan diinkubasi atau benda-benda yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam inkubator. 4. Inkubator ditutup dan dilanjutkan dengan pengaturan waktu inkubasi atau sterilisasi yang dikehendaki melalui panel pengatur waktu. d. Laminar air flow Alat ini digunakan dalam teknik sterilisasi radiasi. Alat ini bukan merupakan alat sterilisasi melainkan sebagai tempat kerja yang steril atau tempat melakukan kerja secara aseptis, contohnya pembuatan kultur murni dan mekanisme ultraviolet dalam mematikan mikroorganisme juga tempat untuk inokulasi mikroorganisme. Kita juga dapat bekerja di dalam ruangan ini. Alat ini terletak khusus dalam satu ruang yang disebut ruang steril. Penggunaan alat tersebut adalah untuk mensterilisasikan udara ditempat kerja, sehingga kegiatan yang berkaitan dengan pemindahan dan pengambilan mikroba dapat dilakukan di sekitar laminar air flow. Di dalam laminair flow terdapat Blower yang berfungsi untuk menghembuskan udara dari dalam keluar secara horizontal sehingga udara luar tidak dapat masuk atau mengkontaminasi. Digunakannya angin untuk mencegah udara dari lingkungan masuk ke dalam sistem sehingga memungkinkan kerja yang aseptis karena mikroorganisme kontaminan yang terdapat pada udara lingkungan tidak dapat masuk untuk menyaring udara yang selalu mengarah keluar dan sinar UV dengan panjang gelombang 260 nm.

Lampu ultraviolet sebaiknya dinyalakan terus dan dimatikan saat alat yang disterilisasi hendak digunakan. Lampu ultraviolet sebagai sterilisasi radiasi dapat membunuh mikroorganisme yang dapat pula diawali dengan proses mutasi. Sifat yang berbahaya tersebut mengharuskan penggunaan sinar ultraviolet harus dilakukan secara berhati-hati, dimana ketika sinar ultraviolet digunakan, laminair flow tersebut harus dalam keadaan tertutup untuk mencegah adanya radiasi yang tak terarah. Cara menggunakan Laminar Air Flow: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Hidupkan lampu UV sekitar 5-10 menit, selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah. Nyalakan lampu neon dan blower. Biarkan selama 5 menit. Cuci tangan dan lengan dengan alkohol 70 % Usap permukaan interior Laminar Air Flow dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap. Masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh, karena memperbesar resiko kontaminasi. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke Laminar Air Flow sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja. Setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari Laminar Air Flow.

e. Miliphore filter Millipore filter merupakan alat sterilisasi yang bekerja secara mekanik dengan metode filtrasi. Millipore ini berguna untuk sterilisasi bahan yang tidak tahan panas atau termolabil dan mudah rusak oleh bahan-bahan kimia. Millipore filter ini memiliki membrane filter atau penyaring yang terbuat dari ester selulosa dengan diameter 0,01 1,0 m. Prinsip kerja millipore filter ini yakni millipore filter dihubungkan dengan injeksi yang berfungsi sebagai penginjeksi cairan yang akan disterilisasi untuk melewati filter, dan ujung millipore filter tersebut dapat dihubungkan dengan leher erlenmeyer sebagai wadah dari bahan tidak tahan panas yang telah disterilisasi secara mekanik. Cara menggunakan miliphore filter, 1. Miliphore filter steril diletakkan pada suatu alat penginjeksi, kemudian substrat yang akan disaring diambil dengan alat bantu penginjeksi tersebut seperti alat suntikan. 2. Lalu dimasukkan ke dalam miliphore filter melalui lubang inputnya.

3. Kemudian ujung atau mulut bawahnya dihubungkan diatas tempat penampung larutan misalnya leher dari erlenmeyer. Keuntungan dari miliphore filter adalah efektif dalam menyaring semua bakteri dan dapat digunakan untuk bahan-bahan yang yang akan disterilisasi tidak tahan panas dan mudah rusak oleh bahan-bahan kimia, seperti serum hewan, enzim, vitamin, antibiotik dan lain-lain. Kerugian dari miliphore filter ini adalah mudah tersumbat apabila tersaring bakteri dan bahan-bahan particular yang banyak, karena tipis dan kecilnya pori (0,22m), juga tidak dapat menyaring virus dan mikoplasma. Pemakainnya pun bersifat dispossible atau hanya sekali pakai. f. Vacuum Filter Vaccum filter berfungsi sama dengan miliphore filter yakni untuk mensterilisasi bahan-bahan cair yang bersifat termolabil, namun vaccum filter lebih efektif dari pada miliphore filter karena dalam vaccum filter diperoleh hasil yang lebih steril karena terdapat 2 kali proses penyaringan. Vaccum filter juga dapat digunakan untuk menyaring mikrobia dan tidak mudah tersumbat seperti miliphore filter. Penggunaan vaccum filter lebih efisien dibandingkan dengan miliphore filter. Jika miliphore filter hanya sekali habis pakai, vaccum filter dapat untuk dipakai terus menerus secara berkesinambungan dengan jumlah cairan yang lebih banyak. Hanya saja alat ini lebih mahal dibandingkan filter biasa. Prinsip kerja alat ini yaitu melalui proses filtrasi atau penyaringan, dimana terdapat penggunaan aliran udara yang dihasilkan oleh pompa yang ditempelkan pada lubang pompa, yang nantinya udara tersebut dikeluarkan melalui lubang yang lain. Udara tersebut menekan cairan yang akan difiltrasi pada bagian atas alat tersebut untuk bergerak menuruni badan alat ke bagian bawah (penampung) alat tersebut. Proses penekanan dari udara tersebutlah yang menyebabkan cairan bergerak dan tersaring ke arah bawah atau ke bagian penampung dari vaccum filter tersebut.