abstrak Dalam upaya untuk mengembangkan metode alternatif untuk mengekstrak DNA dari sampel kompleks dengan banyak

meningkatkan sensitivitas dan efisiensi , di sini kami melaporkan bukti -of - konsep kerja untuk ekstraksi DNA baru Metode menggunakan methyltransferase DNA ( Mtase ) dan '' klik '' kimia . Menurut data awal kami , Metode telah meningkatkan metode saat ini dengan ( i ) menggunakan enzim - DNA tertentu, Taq I DNA Mtase , untuk meningkatkan selektivitas , dan dengan ( ii ) menangkap DNA melalui ikatan kovalen ke difungsikan permukaan , memungkinkan berbagai perawatan yang menghasilkan DNA sampel akhir dengan kehilangan minimal dan lebih tinggi kemurnian sedemikian rupa sehingga akan sangat kompatibel dengan analisis hilir . Dengan menggunakan Mtase , yang sangat Spesifik DNA dan enzim yang efisien , dan klik kimia , kami menunjukkan bahwa sesedikit 0,1 fg dari k - DNA (dekat dengan menyalin nomor 1 ) ditangkap pada manik-manik silika ( Si ) - berbasis dengan membentuk ikatan kovalen antara kelompok azida di permukaan dan bagian propargil pada DNA . Metode ini menjanjikan dalam aplikasi serbaguna di mana ekstraksi jumlah menit DNA memainkan peran penting seperti dasar dan penelitian biologi molekuler terapan , bioforensic dan biosekuriti ilmu , dan negara -of - the-art deteksi metode .

Metode ekstraksi DNA yang handal dan sangat efisien telah elemen inti dari berbagai bidang penelitian , termasuk forensik dan diagnostik . Upaya luar biasa untuk mengembangkan metode yang efisien untuk ekstrak , dan dengan demikian mengisolasi , DNA dengan sensitivitas yang tinggi dan selectiv ity dari sampel kompleks dengan cara menghemat waktu telah bertemu dengan sukses . Sebagai contoh, silika ( Si ) 1 resin - based atau membran inte parut ke dalam microchip untuk analisis DNA throughput tinggi telah sangat berhasil dan biasanya digunakan [1] . Namun, seperti DNA telah menjadi pemain penting dalam memberikan petunjuk penting dalam re pencarian , forensik , dan diagnostik , persyaratan DNA sukses metode ekstraksi telah didefinisikan ulang , seperti halnya orang-orang untuk berturut-turut pada quent analisis . Oleh karena itu , metode konvensional untuk ekstraksi DNA dari sampel yang kompleks , yang sebagian besar meliputi proses tahapan

( lisis sel , kerusakan protein - DNA terkait, dan kemudian isolasi DNA menggunakan berbagai kimia seperti etanol curah hujan dan selektif mengikat DNA ke permukaan Si - based atau matriks serat gelas ) , telah ditantang karena kompatibilitas yang lebih rendah dengan hilir analisis [2] . Thatis , themajorityofthecommerciallyavailablemeth ods didasarkan pada '' booming '' kimia [1] , Yang mengandalkan mengikat antara asam nukleat dan Si di hadapan konsentrasi tinggi ofchaotropes suchas6to 8 Mguanidineordetergent.Althoughthese pendekatan terbukti sufficientfor beberapa aplikasi , theyalso suf fer beberapa kekurangan . Pertama , karena pemisahan nonspesifik Mekanisme berdasarkan interaksi ionik , mereka menghasilkan '' tidak begitu sempurna murni '' sampel akhir terkontaminasi dengan lainnya bermuatan negatif polimer seperti polisakarida , yang semakin merumitkan hilir analisis . Kedua , mereka membutuhkan konsentrasi tinggi garam sebagai chaotrope untuk mengganggu biomembranes sampel dan mixupDNAsofdifferentbiologicalorigins.Third , currentcommercial metode yang dirancang terutama untuk mengobati sampel volume yang lebih kecil ( l l untuk ml ) untuk mengakomodasi prosedur throughput tinggi . Idealnya , anewDNAextractionmethodshouldcombineimproved purityandhigheryieldswithbettercompatibilitywithdownstream analisis . Teknik baru harus sangat selektif untuk DNA kepentingan dalam sampel yang kompleks dan mampu mengekstrak DNA dalam Nonin cara merajalela . Selain itu , harus mudah beradaptasi dengan luas berbagai analisis hilir dan untuk sistem high -throughput , membutuhkan efektifitas dari berbagai volume dari beberapa microli ters untuk beberapa liter . Di antara enzim - DNA spesifik , methyltransferases DNA ( Mta ses ) mengkatalisis transfer kelompok metil DNA dari kofaktor

Bahan dan metode Bahan kimia dan pelarut organik , seperti diklorometana ( CH 2 Cl 2 ) Dan dimetilformamida ( DMF ) , yang dibeli dari Sig -

ma - Aldrich ( St Louis , MO , USA ) kecuali disebutkan lain. SAM itu dimodifikasi secara kimia dan dimurnikan menggunakan C18 - kinerja tinggi kromatografi cair ( HPLC ) sebagai campuran diastereo dan karakteristik terized menggunakan spektroskopi massa elektrospray ( ES - MS ) [4] . Oli - The gonucleotides digunakan sebagai substrat standar yang dibeli dari Teknologi DNA Terpadu ( IDT , Coralville , IA , USA ) . Manik-manik Si yang dibeli dari Bangs Laboratory ( Fishers, IN , USA ) . MTaqI , Taq Saya endonuklease ( RTaqI ) , dan Dam ( ) k - DNA yang dibeli dari New England Biolabs ( Ipswich , MA , USA ) . MTaqI juga diekspresikan sebagai poli - Nya dalam bentuk Escherichia coli sistem dan dimurnikan menggunakan biologi molekuler dan biokimia standar teknik . Produk polymerase chain reaction ( PCR ) yang berhubungan dengan yang dibeli dari Invitrogen ( Carlsbad , CA , USA ) . manik-manik dibilas dengan phosphate-buffered saline ( PBS ) dengan mengulangi spin down dan resuspension beberapa kali ( tiga kali di sebagian besar kasus ) . Ketika berputar , kecepatan berputar tidak melebihi 150 RCF untuk mencegah penggumpalan dari manik-manik .

Hasil dan diskusi Tujuan artikel ini adalah untuk melaporkan sebuah studi yang sukses di bukti dari konsep untuk menggunakan DNA Mtase dan '' klik '' kimia untuk lebih berkembang sebagai alternatif yang lebih baik untuk saat ekstraksi DNA meth ods . Untuk membuktikan bahwa platform baru ini akan menyediakan tempat baru untuk daerah penelitian di mana jumlah menit DNA murni bermain impor peran tant , kami pertama kali didirikan protokol umum untuk Mtase Metode dan kemudian menyelidiki metode dengan sampel dalam '' Tidak sesederhana itu '' kondisi . Untuk menentukan protokol umum , planar dan permukaan Si bulat yang pertama dimodifikasi secara kimia seperti yang dijelaskan sebelumnya [9] . Modifikasi Sukses permukaan dengan azida ( N 3 ) Kelompok dikonfirmasi dengan menambahkan propar -

GYL - amina dan pelabelan neon berikutnya (lihat supplemen Gambar militer . 1 dalam bahan tambahan ) . Untuk mengkonfirmasi bahwa klik kimia adalah fungsional dengan molekul DNA , kita kemudian dirancang dua oligonukleotida standar ( 100 nt ) , masing-masing dengan sebuah neon menyelidiki : satu dengan nukleotida bantalan basis dimodifikasi propargil ( Gambar . 1 , Substrat 1 ) dan yang lainnya dengan situs pengakuan MTaqI TCGA ( Gambar . 1 , Substrat 2 ) . Setelah prosedur kimia klik , standar substrat 1 berhasil diisolasi , seperti yang ditunjukkan oleh fluorescently berlabel manik-manik Si . Kemudian substrat 2 diperlakukan dengan MTaqI di Kehadiran 2 - butynyl - SAM [4] pada 65 C selama 2 jam sebelum inkubasi dengan CuSO 4 dalam larutan asam askorbat ( 1 mM ) [5] . Gambar dari mikroskop fluoresensi menunjukkan bahwa substrat 2 ini berhasil terikat pada manik-manik azida - aktif hanya di hadapan kedua MTaqI dan 2 - butynyl - SAM ( Gambar . 2 ) , Sedangkan sampel dengan kofaktor alami SAM tidak menghasilkan manik-manik fluorescing , membuktikan bahwa hanya oligonukleotida dimodifikasi dengan 2 - butynyl - SAM adalah terkait dengan manik-manik . Uji perlindungan pembatasan (lihat Tambahan Gambar . 2 dalam bahan tambahan ) digunakan untuk menyelidiki efisiensi MTaqI dengan serangkaian dimodifikasi secara kimia kofaktor , termasuk 2 - butynyl - SAM , propargil - SAM , dan kofaktor alami SAM , di mana 2 - butynyl - SAM menunjukkan sebaik efisiensi siensi sebagai kofaktor alami SAM . Onceit adalah confirmedthatthe DNAwas enzimatik diubah berhasil terikat pada Si permukaan azida - diaktifkan , kami menggunakan beadsasatemplatefor '' on- manik '' PCR.UsingDam ( ) k - DNA ( linear DNAwith48 , situs pengakuan contains121 502 bp forMTaqI ) ( New

Inggris Biolabs ) , kami melakukan reaksi MTaqI diikuti oleh klik kimia dengan modifikasi azida - manik Si . setiap supernatan dari tahap pencucian menjadi sasaran PCR untuk mendeteksi keberadaan DNA terikat . Kuantifikasi lebih lanjut setelah klik kimia menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa imobilisasi adalah kirakira 90 % selesai ( < kehilangan 10 % dari DNA sampel ) . hasil ini menunjukkan bahwa metode Mtase memberikan alternatif untuk metode saat ini dengan jauh lebih baik yield lebih dari saat ini metode berbasis membran , kelemahan umum yang rendah menghasilkan karena mengikat spesifik . Selain itu, produk PCR dari ukuran yang tepat dan urutan yang diperoleh dari reaksi dari 2 - butynyl - SAM - dimodifikasi k - DNA dengan polimerase yang dipilih , termasuk Taq , Deep Vent , dan PFU DNA polimerase ( Gambar . 3 ). Karena kekhususan tinggi antara DNA dan Mtase , ini Metode ini diharapkan untuk menangkap DNA sekecil 15 bp . Oleh karena itu , setelah menentukan hasil dari pada - manik reaksi PCR , kami inves tigated sensitivitas metode dibandingkan dengan arus kit komersial . The DNA standar serial diencerkan ( 10 ng untuk 0,1 fg dari k - DNA ) diperlakukan dengan MTaqI dan 2 - butynyl SAM pada 60 C seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode . Setelah klik prosedur kimia , manik-manik dengan DNA dibilas sebelum melakukan PCR pada aliquot suspensi manik-manik untuk mengukur Batas deteksi DNA . Metode Mtase menghasilkan produk PCR dari semua manik-manik konsentrasi DNA yang berbeda serendah 0,1 fg ( Gambar . 4 ), kuantifikasi yang selanjutnya dikonfirmasikan menggunakan Agilent Bioanalyzer ( Santa Clara , CA , USA ) . Hasil kami menunjukkan bahwa , dibandingkan dengan kit ekstraksi DNA saat ini tersedia ( paling yang menunjukkan kepekaan dalam hal nanogram DNA ) , yang Metode Mtase memungkinkan deteksi DNA dengan single - digit salinan nomor. Persyaratan lain dari alat tes baru yang sukses harus menjadi ketahanan prosedur dalam berbagai kondisi sampel . Oleh karena itu, kami meneliti efisiensi metode Mtase dalam berbagai konsentrasi pH dan garam . Produk PCR setelah

Mtase dan klik kimia menunjukkan bahwa metode Mtase adalah efektivitas tive pada kisaran pH 4,0 sampai pH 10,0 dan di hadapan nano molar ( nM ) untuk milimolar ( mM ) konsentrasi garam umum seperti Ca 2+ , Mg 2+ , Dan Na + ( Gambar . 5 ). Data awal di atas jelas menunjukkan bahwa Mtase metode adalah alternatif yang lebih baik dengan meningkatkan sensitivitas , jadi kami diuji kemampuannya untuk menangkap DNA kepentingan dengan selektivitas tinggi dari sampel yang kompleks . Untuk menentukan efisiensi , kami mengevaluasi metode Mtase dengan sampel DNA dicampur dengan tanah dan E. coli lisat . Pertama, sampel tanah disusun dengan diketahui jumlah standar k - DNA untuk menunjukkan bahwa bebas - mengambang ing DNA dalam sampel kompleks selektif diekstraksi meskipun kehadiran komponen bersamaan seperti partikel besar , bertemu als , dan biopolimer lain (misalnya , protein yang terkandung dalam tanah ) . sebagai ditunjukkan pada Gambar . 6 A, DNA eksogen bebas dalam sampel adalah SUC cessfully diekstraksi dan mengalami PCR , memberikan diperkuat produk ukuran yang tepat dan urutan . Kedua , kami ekstrak DNA endogen dari berbudaya E. coli sampel di mana bakteri tersebut membran terganggu oleh thaw gratis dan manik pemukulan . Kami con menguat bahwa fungsi metode MTase efektif , seperti yang ditunjukkan oleh produk PCR dari ukuran yang tepat dan urutan ( Gambar . 6 B). Ekstraksi DNA dari sampel kompleks memainkan peran penting dalam bidang penelitian yang beragam . Alternatif ini mungkin menunjukkan meningkatkan sensitivitas dan efisiensi dapat dimanfaatkan untuk lebih luas aplikasi dibandingkan dengan metode saat ini. Ini akan membuka peluang baru untuk mempelajari jumlah salinan yang kompleks atau rendah sam prinsip keuangan , yang metode saat ini tidak mungkin seefisien debapak . Berbeda dengan metode saat ini yang menggunakan baik filtrasi atau

generasi medan paramagnetik , penggunaan DNA Mtase dan sub sequent klik kimia menawarkan keuntungan sehubungan dengan substrat spesifisitas dan kompatibilitas yang lebih luas untuk analisis hilir . Oleh karena itu , keberhasilan ini bukti -of - konsep studi untuk Mtase Metode yang dilaporkan di sini memegang janji dalam berbagai aspek . Saat ini , pengembangan metode baru yang dapat diandalkan untuk mengekstrak DNA dalam berbagai kondisi sangat dibutuhkan di berbagai bidang re pencarian karena keterbatasan metode yang umum digunakan . Limi - ini sultasi termasuk hasil yang relatif miskin pemulihan DNA dan terbatas volume sampel dari sistem filtrasi berbasis membran ( Pure Yield Midiprep dan MagneSil oleh Promega ) dan / atau paramagnetik sistem pemisahan berdasarkan partikel - ( Maxwell 16 oleh Promega dan Agencourt DNAdvance oleh Beckman Coulter Genomics ) . Namun, metode Mtase menyediakan platform baru untuk ekstraksi DNA mengatasi tantangan ini . Pertama , metode Mtase dapat diterapkan untuk berbagai volume sampel dengan meningkatkan konsentrasi yang tion Mtase dan permukaan azida - diaktifkan , sehingga menawarkan lebih alternatif yang efisien untuk sampel biomassa rendah dalam volume yang lebih besar . Kedua , metode Mtase menunjukkan sensitivitas yang tinggi dan selektivitas untuk DNA sebagai rendah sebagai femtogram dari DNA , yang dekat peningkatan seribu kali lipat dalam sensitivitas dibandingkan dengan skr -the menyewa metode umum . Ketiga , metode Mtase dapat dikombinasikan dengan jangkauan yang lebih luas dari analisis hilir karena kemurnian sampel . Optimasi lebih lanjut dari protokol untuk sampel yang berbeda jenis dan pengembangan berbagai format permukaan , seperti mag manik-manik netic dan penggabungan ke permukaan tabung plastik , akan di lipatan berbagai aplikasi dan utilitas pengujian ini