RESUME JURNAL METODE PEMISAHAN Paper-Chromatographic Separation of Chlorophylls and Carotenoids from Marine Algae

Kromatografi kertas adalah kromatografi yang menggunakan kertas selulosa murni yang mempunyai afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lainnya. Kromatografi kertas digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Prinsip Kromatografi kertas adalah pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna (Day,2002). Metode pemisahan kromatografi kertas digunakan untuk pemisahan parsial pigmen kloroplas yang umumnya berasal dari tumbuhan tingkat tinggi dan ganggang dari kelas Chlorophyceae. Pigmen utama kloroplas adalah klorofil a dan b, dengan beta-karoten dan lutein sebagai karotenoid utama. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui komposisi pigmen dari alga planktonik yang terdapat di perairan laut lepas Sydney, sampel ditemukan dari kelas Chlorophyta, Bacillariophyceae, Dinophyceae, Chrysophyta, dan tumbuhan yang diharapkan ditemukannya klorofil a, b, dan c bersama dengan berbagai karotenoid. Modifikasi metode dua dimensi telah memungkinkan studi tentang komposisi pigmen dari beragam kelompok alga yang akan dilakukan karena mampu menghasilkan pemisahan sempurna dari campuran klorofil a, b dan c, karoten, xanthophylls lutein, violaxanthin, neoxanthin, fucoxanthin, peridinin dan astaxanthin, serta sejumlah pigmen xantofil yang terjadi dalam jumlah relatif kecil.

I.

MATERIAL Alga merupakan istilah yang berasal dari bahasa latin, yaitu algor yang berarti

dingin. Ganggang laut adalah tanaman tingkat rendah yang tidak memiliki perbedaan susunan kerangka seperti akar, batang, dan daun sehingga tergolong dalam thallophyta. Bentuk thallus ganggang laut bermacammacam, ada yang bulat seperti
1

tabung, kantung, rambut, dan sebagainya (Duddington, 1971). Alga laut terdiri dari empat kelas, yaitu Chlorophyceae, Bacillariophyceae, Dinophyceae, dan

Chrysophyceae. Dalam penelitian yang dilakukan, bahan uji yang digunakan ialah tiga alga dari kelas Chlorophyceae (Dunaliella tertiolecta) Butcher, Chlorella stigmatophora Butcher, dan Tetraselmis suecica (Kylin) Butcher), tiga alga dari kelas Bacillariophyceae (Phaeodactylum tricornutum Bohlen, Nitzschia closterium (Ehr.) dan Skeletonema costatum (Grev.)), satu alga dari kelas Dinophyceae (Gymnodium sp.) dan dua alga dari kelas Chrysophyceae (Isochrysis galbana Parke dan Sphaleromantis sp.), ekstrak dari campuran Phaedactylum, Dunaliella, dan

Isochrysis dan organisme lain yang telah diisolasi dari campuran sampel plankton yang diambil dari air laut pesisir Sydney. Sebelum dianalisis, alga yang telah dipanen dibersihkan dengan sentrifugasi. Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Pada persiapan sampel, sentrifugasi bertujuan untuk menghilangkan sebagaian besar bakteri yang dapat mengganggu pengamatan secara mikroskopik. Untuk sampel berupa campuran plankton yang diambil dari pesisir Sydney ditambahkan nitrat dan fosfat. untuk menghentikan pertumbuhan dari fitoplankton yang terdapat dalam air laut (McCarthy, 1980). Sekurang-kurangnya 35L air laut dibutuhkan untuk memperoleh pigmen yang cukup untuk dianalisis secara kromatografi.

II.

METODE 1. Preparasi ekstrak pigmen Semua reagen dan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi

adalah bahan kimia A.R. dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Selama proses ekstraksi seluruh tabung yang berisi pigmen disimpan dalam tempat gelap. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi dengan jumlah dan volume yang besar digunakan
2

5000g air laut untuk dilakukan sentrifugasi kontinu. Sel-sel yang mengendap (antara 0,1 dan 0,5 ml) dikemas basah dan diekstraksi beberapa kali selama 1-2 menit dengan volume kecil (5-10 ml.) aseton 90%, sampai residu tidak berwarna. Campuran ekstrak aseton dicampur dengan volume yang sama dari dietil eter dalam corong pisah, dan dicuci dengan setidaknya 5 vol. dari 10% (b/v) NaCl. Digunakan dietil eter sebagai pengganti light petroleum dalam tahap pemurnian, karena klorofil c tidak larut dalam pelarut sebelumnya. Eter memisahkan pigmen secara kuantitatif dari aseton dan pengotor yang larut air. Setelah beberapa kali dicuci dengan NaCl, lapisan eter yang mengandung pigmen dikumpulkan, disentrifugasi sebentar untuk menghilangkan tetesan atau droplet air tersuspensi, dan dipindahkan ke cawan petri dan diuapkan sampai kering. Metode ini terbukti lebih efektif daripada pengeringan menggunakan vakum, atau dengan menggunakan natrium sulfat anhidrat, yang diadsorpsi oleh pigmen. Residu pigmen kemudian dilarutkan kembali dengan sedikit dietil eter dan kadang-kadang penambahan aseton diperlukan untuk memfasilitasi larutan. Sebelum dilakukan kromatografi, sisa tetesan air dihilangkan dengan setrifugasi, karena untuk menghasilkan resolusi yang baik dari pigmen pada kromatogram dibutuhkan ekstrak yang benar-benar kering. Setiap spesies alga memiliki tingkat ekstraksi pigmen yang berbeda. Diatom dan -flagelata, sangat resisten, pertama kali tersuspensi dalam air (1-3 menit untuk diatom dan 30 menit untuk -flagelata). Hal ini menyebabkan sel mengembang, dan ekstraksi menjadi sedikit lebih sulit. Ketika sampel plankton dari air laut didiamkan semalam dalam aseton 90%, selalu ada beberapa kerusakan (sekitar 5-10%) dari klorofil menjadi feofitin, sel-sel tersuspensi dalam air selama sekitar 30 menit sebelum dilakukan ekstraksi dengan aseton, dan 98% pigmen dihasilkan dari metode ini. Jika residu kemudian dibiarkan semalam dalam aseton, hanya diperoleh sedikit (kurang dari 2% dari jumlah total) bahan diserap pada 665 m. Kromatogram yang diperoleh dari ekstrak dengan treatment air, bebas dari komponen feofitin, kecuali ketika sejumlah besar sel mengalami dekomposisi yang dapat terlihat secara

mikroskopik sebelum ekstraksi. Dalam kasus ini feofitin dapat terlihat dalam sampel plankton yang asli.

2. Kromatografi Analisis pigmen alga dilakukan dengan metode kromatografi kertas menaik dua dimensi karena pigmen alga merupakan campuran yang kompleks sehingga nilai Rf yang dihasilkan sangat dekat atau tumpang tindih, oleh karena itu kromatografi kertas menaik dua dimensi akan memberikan hasil yang lebih baik. Cara kerja kromatografi kertas menaik dua dimensi, diawali dengan kromatografi kertas menaik satu dimensi dengan 1 totolan dielusi menaik hingga tanda batas atas kemudian kertas kromatografi dibalik 90o dan dimasukkan ke dalam chamber lalu dielusi kembali dengan cara menaik sampai tanda batas atas (Ghatak, 2011). Proses elusi menaik dua dimensi dilakukan pada suhu kamar (18oC 23oC) dalam gelap karena ciri khas pigmen yang tidak stabil terhadap cahaya, pH, suhu, oksigen dan pelarut alkohol sehingga intensitas cahaya yang tinggi dan waktu iradiasi cahaya yang lama dapat menyebabkan degradasi klorofil. Klorofil yang terdegradasi akan membentuk produk degradasi seperti feofitin dan feoforbid, sementara karotenoid akan membentuk cisisomer sebagai produk degradasi akibat proses stereoisomerisasi karena faktor suhu, dan cahaya (Fretes, dkk., 2012). Fase diam yang digunakan adalah kertas kromatografi whatman 3MM dipotong persegi dengan ukuran 22cm, lalu awal penotolan mengandung ekstrak sekitar 20-30g pigmen. Fase diam dibentuk silinder dan ujungnya dijepit bersama serta diletakkan di dalam chamber yang berbentuk toples silinder. Sebelumnya chamber digunakan, harus dijenuhkan terlebih dahulu dengan tujuan untuk memperoleh homogenitas atmosferik dalam bejana, dengan demikian akan meminimalkan penguapan pelarut dari lempeng KLT selama pengembangan (Gandjar dan Rohman, 2012). 3. Pelarut Diuji pelarut metanol, etanol, propan-l-ol, propan-2-ol, butan-l-ol dan isopentanol dalam konsentrasi sampai 4% (v/v) dalam light petroleum, titik didih 604

80, dan 4% propan-l-ol dalam light petroleum memberikan resolusi terbaik untuk karoten, klorofil dan feofitin a, b dan c. Hal ini dicapai dengan menggunakan kloroform sebagai pelarut kedua, 30% (v/v) kloroform dalam light petroleum, titik didih 60-80. Kromatogram dikembangkan selama sekitar 30 menit di setiap pelarut dan dibiarkan kering dalam gelap untuk beberapa menit setelah masing-masing terelusi. Untuk pengukuran kuantitatif, bagian dari pigmen ekstrak dikromatografi dan spot-spot yang sesuai terhadap fraksi pigmen karotenoid dielusi dengan etil eter. Proses ekstraksi memerlukan jenis larutan pengekstrak yang sesuai dengan sifat pigmennya. Karotenoid termasuk senyawa yang larut dalam lemak dan pelarut lemak (Gross, 1991). Pelarut yang biasa digunakan untuk mengekstrak lemak adalah golongan alkohol, aseton, asetonitril, eter, halocarbon, hidrokarbon, atau campuran dari pelarut-pelarut tersebut yang mudah menguap dan memiliki titik didih yang rendah. Pelarut-pelarut ini diharapkan memiliki daya larut yang baik terhadap karotenoid. Tingkat kepolaran pelarut juga berpengaruh terhadap daya larut. Jumlah pelarut yang digunakan cukup banyak agar diperoleh senyawa karotenoid semaksimal mungkin (Wanasundara,2002). Hal ini terjadi karena semakin besar volume pelarut yang ditambahkan maka semakin besar kemampuan pelarut untuk melarutkan bahan sehingga semakin banyak komponen bahan yang dapat dipisahkan oleh pelarut (Suryandari ,1981). Sementara spot-spot yang sesuai terhadap fraksi pigmen klorofil dielusi dengan aseton. Klorofil memiliki kemudahan terekstrak dengan pelarut organik seperti aseton, alkohol, metanol, etil asetat, piridin dan dimetilformamid. Klorofil yang masih memiliki gugus fitol memiliki daya larut terhadap air yang rendah. Aseton memiliki tingkat kepolaran yang lebih mendekati kepolaran klorofil dibandingkan air sebagai larutan pengekstrak, maka klorofil lebih mudah terekstrak dengan menggunakan aseton (Fennema, 1996). Klorofil di dalam daun berikatan dengan lipoprotein. Dengan menggunakan pelarut ekstrak alkohol dan aseton akan menyebabkan terjadinya denaturasi protein
5

yang mengikat klorofil sehingga klorofil dapat lepas dari ikatan dengan protein dan ikut terekstrak dalam pelarut (Putri,dkk.) Keberadaan eluat dibaca dalam Unicam SP. 500 spektrofotometer dan hasilnya dinyatakan sebagai mg. pigmen/ g. wt kering. sel. 4. Identifikasi pigmen Pigmen dikarakterisasi setelah elusi dari kromatogram dengan penyerapan spektra. Dalam Tabel 1 menunjukkan bahwa absorpsi maxima yang diperoleh dari pigmen yang diuji. Dalam semua kasus, dihasilkan data yang serupa dengan data yang dipublikasikan sebagai contoh pada mikroorganisme Isochrysis galbana mengandung pigmen diatoxanthin, diadinoxanthin, fucoxanthin dan neofucoxanthins dimana serapan maxima dari percobaan memiliki kesamaan pada data yang dipublikasikan (pustaka). Astaxanthin ditemukan pada Nannochioris atomus diesterifikasi dan diindikasi dengan kromatografi dan spektrofotometri sama dengan esterifikasi Astaxanthin dari telur dari Artemia salina. Selain itu, esterifikasi Astaxanthin dari kedua sumber, epiphasic ketika larutan pigmen dalam light petroleum dikocok dengan 90% metanol. Fraksi pigmen diidentifikasi lebih lanjut oleh co chromatografi dengan sampel otentik dalam dua pelarut sistem (4 % propanl-ol dalam light petroleum dan 30 % kloroform dalam light petroleum). Pigmen dari dua organisme yang diidentifikasi sebelumnya digunakan sebagai standar. Dunaliella tertiolecta yang pelajari oleh Gilchrist & Hijau (1960) digunakan sebagai standar klorofil a dan b, karoten, lutein, violaxanthin dan neoxanthin, dan Nitzschia Closterium dianalisis oleh Regangan et al. (1944) digunakan sebagai standar klorofil c, karoten, diatoxanthin, diadinoxanthin, fucoxanthin dan neofucoxanthins. Sejak tidak adanya kultur dinoflagellata tidak diperoleh data yang otentik terhadap dinoxanthin atau peridinin, dan dalam kedua kasus identifikasi sementara terhenti hanya pada absorpsi data. Dalam kasus lain cochromatography pigmen standar dengan fraksi pigmen yang sesuai dari organisme uji sebelumnya menghasilkan spot tunggal pada kromatogram pada kedua sistem pelarut.

III.

HASIL 1. Pemisahan pigmen Kromatografi kertas dua dimensi digunakan untuk memaksimalkan

pemisahan senyawa dengan nilai Rf berdekatan. Pada tahap elusi pertama, diperoleh bercak yang saling tumpang tindih. Kemudian kertas diputar 90o dan dilakukan elusi kedua. Diperoleh bercak tunggal yang memisah dengan baik. Hal itu menunjukkan hasil pemisahan dengan kromatografi kertas dua dimensi memiliki kemurnian tinggi (Ghatak, 2011). Kromatogram yang diperoleh dari Chlorophyceae, Bacillariophyceae, Dinophyceae dan Chrysophyceae menunjukkan beberapa bercak setelah dilakukan elusi. Klorofil dan karoten menunjukkan pemisahan yang baik pada semua sampel dan dalam kultur uni-alga, xanthophyll juga memberikan resolusi yang baik. Namun, ketika ekstrak dari organisme yang berbeda dicampur dan dilakukan uji kromatografi bersama, terjadi tumpang tindih bercak dari zona xanthophyll. Resolusi pemisahan pigmen yang baik diperoleh pada sampel air laut. 2. Produk Dekomposisi Nilai Rf untuk Pheophytin a, b dan c ditunjukkan pada Tabel 2 (tercantum dalam jurnal). Rf Pheophytin a, b dan c pada Kromatofragi satu dimensi masingmasing : 0.87, 0.70 dan 0.00, sedangkan Rf Pheophytin a, b dan c pada Kromatografi dua dimensi masing-masing : 0.96, 0.89 dan 0.00. Nilai Rf ini menyatakan hasil pengembangan Pheophytin dengan fase geraknya, dimana Rf satu dimensi lebih kecil dari dua dimensi. Rf Pheophytin a lebih besar dari Pheophytin b, yang menunjukkan bahwa Pheophytin a lebih terikat kuat dalam fase geraknya. Sedangkan Pheophytin c tidak memiliki nilai Rf baik pada dimensi pertama ataupun dimensi kedua, hal ini menunjukkan bahwa Pheophytin c tidak terelusi besama fase gerak yang digunakan pada kromatografi ini. Pheophytin a selalu ada dalam ekstrak kultur tua dan dalam sampel plankton yang mengandung banyak dekomposisi material. Pheophytin b tidak diamati dalam setiap ekstrak ganggang yang diidentifikasi dengan metode ini. Pada derivat ekstrak
7

dari kultur tua atau ekstrak yang disimpan selama beberapa hari, spot chlorophyl a dan b terkadang terpisah dalam dua zona selama pengembangan dalam cahaya klorofom dan pelarut petroleum. Ini merupakan produk isomerisasi yang menunjukkan chlorophyl a dan chlorophyl b. Berdasarkan data nilai Rf pigmen algae laut yang dipisahkan dengan kromatografi dua dimensi menunjukkan bahwa, nilai Rf dapat berubah berdasarkan kuantitas atau jumlah pigmen dalam kertas, dengan waktu pengembangan dan organisme yang digunakan. Hasil ini menandakan posisi relatif pigmen pada kromatogram lebih baik daripada nilai mutlaknya. 3. Fraksi Cholorophyl a kedua Pada beberapa alga laut dan sampel air laut yang dikumpulkan dalam kondisi diatom mengembang menunjukkan warna biru-hijau selain pada spot klorofil a. Zona biru-hijau ini bergerak mendahului klorofil c setelah pengembangan dengan propan1-ol 4% dalam light petroleum tetapi tidak memisah dengan sempurna. Hal ini dikarenakan pada struktur klorofil mengandung bagian yang polar dan nonpolar sehingga dapat larut pada alkohol dan petroleum. Klorofil baru ini tidak berpindah pada fase gerak klorofom-light petroleum. Spektrum absorbsi pada aseton menyerupai klorofil a dengan serapan maksimum pada 663, 615, 580, 535, 429 dan 417 nm. Pigmen yang tidak diketahui dapat dipisahkan dari klorofil c dengan fase gerak etil eter . Pada kondisi ini caroten, xantofil dan klorofil a bergerak bersama dengan pelarut diikuti oleh spot biru hijau yang berlainan (derivat klorofil a kedua ). Klorofil c hanya berpindah sedikit dari tempat penotolan. Kemungkinan pigmen derivat klorofil a ini bersifat lebih nonpolar daripada klorofil c karena lebih terlarut pada fase gerak. Uji Willstetter dan Stoll (1913) menunjukkan bahwa material ini sebagai klorofilida a sebagai turunan dari klorofil a. Perubahan klorofil a menjadi bentuk baru dihasilkan karena adanya enzim klorofilase yang sangat aktif pada beberapa alga. Enzim klorofilase mampu mengubah klorofil menjadi klorofilida dengan hilangnya

gugus fitol. Klorofilase merupakan enzim esterase dimana secara in vitro dapat mengkatalis pemecahan fitol dari klorofil membentuk klorofilida. IV. PEMBAHASAN Beberapa peneliti telah mengasumsikan bahwa kromatografi dua dimensi terlalu lambat dalam meresolusikan pigmen tumbuhan yang tidak stabil. Tetapi dalam metode ini dijelaskan dengan cepat dan sederhana, serta tidak terjadi dekomposisi pigmen jika persiapan ekstraksi dilakukan dengan cepat tanpa terkena sinar matahari secara langsung. Pemisahan lengkap untuk semua komponen minor xantopyl tidak diperoleh dalam metode ini. Dalam suatu campuran, spot organisme yang mengandung xantofil ditunjukan dengan tingkatan tertentu yang saling tumpang tindih, seperti peridinin dan fukosantin. Kedua pigmen ini dapat diselesaikan dengan tiga pengembangan dalam dua dimensi dengan proporsi yang lebih tinggi dari klorofom hingga light petroleum (hingga 60%, v/v). Astaxantin yang biasanya dianggap sebagai karetenoid hewan, tetapi telah diidentifikasi dalam alga hijau Haematococcus pluvialis yang ditemukan pada ester dalam bentuk -falagelata hijau Nannochloris atomus yang diisolasi dari perairan pantai Sydney. Kedua organisme yang mengandung fukosantin dan isomer sebagai karotenoid utama dan diatosantin sebagai pigmen minor. Isochrysis galbana menunjukkan adanya diadinosantin dalam jumlah kecil, sedangkan Sphaleromantis berisi pigmen kuning yang mirip dengan dinosantin, dengan nilai maksimal serapan pada 477 dan 444 m di dalam etanol. Tidak berhasilnya menemukan klorofil c disebabkan karena penggunaan minyak bumi yang bersifat murni, di mana pada zat tersebut klorofil c terlarut, dan bukan dietil eter seperti prosedur pada saat ekstraksi. Analisis secara kuantitatif menunjukkan bahwa konsentrasi klorofil adalah sekitar 1-3 kali dari konsentrasi karotenoid dalam organisme. Konsentrasi klorofil b dan c memiliki urutan yang sama besarnya seperti klorofil, meskipun nilai dari klorofil c masih bersifat dugaan. Dalam diatom dan flagelata berwarna cokelat keemasan
9

(fukosantin) dan isomer merupakan 80-90 % dari total karotenoid, dan peridinin menyumbang 70 % dari total karotenoid dalam kultur dinoflagellata. Masing-masing komponen kecil dalam organisme ini (karoten, diatosanhin, diadinosantinin dll.) mewakili sekitar 5 % dari total karotenoid. Lutein, yang berada di flagelata hijau, menyumbang 40 % dari total karotenoid, dengan karoten, violasantin dan neosantin dalam jumlah mulai dari 10 sampai 20% dari total. Empat flagelata hijau (Chlorophyceae) yang diteliti mengandung klorofil a dan b dan pada karoten memberikan tiga zona xantofil menonjol sesuai dengan lutein, violasantin dan neosantin. Tiga diatom (Bacillariophyceae) dan dua flagelata cokelat keemasan (Chrysophyta) menunjukkan kesamaan dalam komposisi pigmen terhadap klorofil a dan c, karoten dan fukosantin dan isomer sebagai xantofils utama. Pada dinoflagellata (Dinophyceae) dibedakan oleh adanya peridinin di tempat fukosantin sebagai xantofil utama, di samping klorofil a dan c, karoten dan xantofil minor. Dari penelitian ini jelas bahwa klorofil a, b dan c, karoten dan lutein xantofil, fukosantin dan peridinin merupakan pigmen fotosintesis yang paling penting yang ditemukan dalam ganggang yang terdiri dari organisme fitoplankton. V. RINGKASAN
1. Kromatografi kertas 2-dimensi dengan propan-l-ol- light petroleum dan campuran kloroform- light petroleum memisahkan pigmen kloroplas ganggang laut dari kelas Chlorophyceae, Bacillariophyceae, Dinophyceae dan Chrysophyta. 2. Pigmen yang dipisahkan antara lain klorofil a, b, dan c, pheophytin, karoten, xanthophylls lutein, violaxanthin, neoxanthin, fucoxanthin dan isomernya, peridinin, astaxanthin teresterifikasi, dan sejumlah komponen xantofil minor. 3. Konsentrasi dari klorofil b dan c sama dengan urutan perbesaran dari klorofil a meskipun nilai klorofil c hanya bersifat sementara yang dikarenakan ketidakpastian nilai-nilai kepunahan dari klorofil c. Fucoxanthin dan isomernya berjumlah 80-90% dari total karotenoid dalam diatom dan flagelata coklat keemasan. Peridinin berjumlah 70% dari total karotenoid di dinoflagelata.

10