A.

LATAR BELAKANG
Mikroorganisme terdapat dimana-mana dalam tanah dan debu, di udara,
dalam air dan susu, maupun pada jaringan tubuh kita sendiri. pendeknya
disegala macam tempat serta lingkungan si muka bumi ini. sesungguhnya
memang kita dikelilingi oleh bakteri, fungi, protozoa dan mikroorganisme lain.
Laboratorium, sebagaimana halnya lingkunganlingkungan lain, dihuni
oleh banyak mikroorganisme yang tersuspensikan diudara atau mengendap
bersama debu pada berbagai macam permukaan (pakaian, meja, lantai dan
benda-benda lain). ukuran sel mikroba yang demikian kecil dan ringan
menyebabkannya

mudah terhembus kemana-mana oleh aliran udara atau

menempel pada partikel-partikel debu.

Pembiakan mikroorganisme dalam laboratorium memerlukan media
yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi
mkroorganisme. media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri
terdapat dalam bentuk padat, semi-padat dan cair. Setelah media biakkan
disiapkan, media ini harus disterilkan terlebih dahulu sebelum dapat digunakan
untuk membiakkan mikroorganisme. mikroorganisme luar yang tidak
dikehnedaki itu dapat masuk melalui kontak langsung dengan permukaan
tangan yang tercemar atau dari pelralatan yang belum tersterilkan. untuk
mencegah tercemarnya biakan murni, perlu digunakan teknik aseptik. teknik
aseptic adalah usaha untuk menghindarkan setiap kontak antara kultur murni,
medium steril dan semua wadah steril serta permukaan meja kerja, dengan
mikroorganisme

kontaminan/competitor

(mikroorganime

yang

tidak

diinginkan). Strerilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk

mematikan semua organisme yang terdapat atau di dalam suatu benda.
Flora mikroba dimana saja pada umumnya terdapat dalam populasi
campuran.

untuk

mencirikan

dan

mengidentifikasi

suatu

spesiea

mikroorganisme tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus dapat dipisahkan

dari organism lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan
menjadi biakan murni. (biakan murni adalah biakan yang sel-selnya berasal
dari pembelahan satu sel tunggal).biakan murni diperlukan untuk menelaah dan

mengidentifikasi mikroorganisme termasuk penelaahan ciri-ciri kultural,

morfologis fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang
terdiri satu macam mikroorganisme saja. Ada beberapa metode untuk
memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. dua diantaranya yang
paling sering digunakan ialah dengan metode streak plate dan pour plate.
Pengukuran kuantitatif populasi sering kali amat diperlukan di dalam
berbagai macam penelaahan mikrobiologis. secara garis besar perhitungan
jumlah mikroorganisme dibagi menjadi 2 metode yaitu pertama, secara
langsung (direct method) dengan cara yang dapat digunakan; menggunakan
counting chamber, menggunakan cara pengectan dan pengamatan mikroskopik,
menggunakan filter membran. kedua secara tidak langsung (indirect method)
dengan cara; Most Probable Number (MPN), berdasarkan kekeruhan, analisis
kimia, berat kering, dan berdsarkan jumlah koloni (Total Plate Count) atau
Viable Plate Count.

A. TUJUAN PRAKTIKUM

1. Mengenal prosedur teknik aseptik dan instrumen dasar di Laboratorium

Mikrobiologi.
2. Mengembangkan kemampuan dan keterampilan dalam bekerja di
Laboratorium Mikrobiologi.
3. Mengembangkan kemampuan mendeskripsikan karakteristik fisiologis
(biokimiawi) isolat bakteri uji pada berbagai media (fermentasi, hidrolitik,
dll.)
4. Merencanakan dan melakukan pengenceran berseri.
5. Melakukan penghitungan jumlah sel bakteri viable suatu sampel atau
kultur bakteri.

B. CARA KERJA
1. Teknik-Teknik Dasar dalam Praktikum Mikrobiologi
a. Langkah Kerja Dasar Teknik Aseptik
menggunakan jas laboratorium yang bersih

sebelum bekerja, membersihkan meja kerja dan tangan dengan alkohol 70%
secukupnya secara merata

sebelum menginokulasi suatu biakan, mensterilisasi jarum ose dengan

mencelupkannya dalam alkohol 70% lalu dibakar di api bunsen sampai
membara
melepas kapas penyumbat tabung rekasi dengan cara menjepitnya di antara jari
kelingking dan jari manis yang memegang jarum ose, lalu melakukan proses
penginokulasian dilakukan dekat nyala api bunsen

sebelum membuka petridish tempat isolasi, memanaskan semua sisi tepinya,

lalu membuka sedikit petridish secukupnya ose atau drigalsky dapat masuk,
lalu melakukan proses inokulasi dekat nyala api bunsen

b. Langkah Kerja Mengisolasi Kultur Campuran Bakteri

secara aseptik, mengambil sampel air kolam dengan jarum ose lalu
menggoreskannya secara continuous streak pada agar plate yang steril
menutup petridish dan menyegelnya dengan plastik wrapper, lalu
menginkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 48 jam
selama 15 menit membiarkan agar plate steril yang terbuka di kawasan selasar
kamar mandi laboratorium Biologi lantai 1
setelah 15 menit menutup agar plate dan menyegelnya dengan plastik wrapper
lalu menginkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 48 jam

c. Langkah Kerja Mengisolasi Kultur Murni Bakteri

memilih satu koloni besar biakan murni yang tumbuh dan terpisah dari koloni
lainnya
secara aseptik mengambil koloni tersebut dengan jarum ose dan
menginokulasikannya secara zig-zag di medium agar miring, lalu menutup
tabung medium dengan sumbat kapas

meletakkan tabung pada rak tabung reaksi lalu menginkubasinya pada suhu
kamar selama 24-48 jam

2. Karakterisasi Fenotipik Isolat Bakteri

a. Langkah Kerja Pengecatan Gram

b. Langkah Kerja Uji Daya Fermentatif dan Hidrolitik Bakteri Kultur

Murni
A. Langkah Kerja Hidrolisa Gelatin
secara aseptik menginokulasikan isolat bakteri dengan jarum inokulasi, lurus di
bagian tengah medium, mulai dari atas menembus sampai ujung bawah lalu
diinkubasi selama 48 jam

setelah inkubasi 48 jam medium tersebut diletakkan dalam lemari es selama 30

menit lalu melihat terjadi pemadatan medium atau tetap cair

B. Langkah Kerja Uji Selektif Medium SS

secara aseptik menginokulasikan isolat bakteri dengan ose kolong pada
medium SS agar miring, membentuk goresan zigzag dari pangkal hingga ujung
medium

menginkubasi selama 48 jam lalu diamati dan membandingkannya dengan

kontrol

C. Langkah Kerja Fermentasi Karbohidrat

secara aseptik menginokulasikan isolat bakteri dengan ose kolong dan

menggerakkan ose beberapa kali dalam medium glukosa cair agar isolat bakteri
terlepas dari ose, lalu diinkubasi selama 48 jam

setelah inkubasi 48 jam mengamati perubahan warna dengan pembanding

(kontrol) dan pembentukan gas

mengulangi langkah kerja di atas pada medium laktosa cair dan sukrosa cair

D. Langkah Kerja Hidrolisa Pati

secara aseptik menggunakan ose menginokulasikan bakteri membentuk goresan
lurus pada medium pati agar plate lalu diinkubasikan secara terbalik selama 48
jam
setelah inkubasi 48 jam, meneteskan larutan iodine pada koloni isolat bakteri
yang tumbuh dan dibiarkan selama 30 detik lalu mengamati terbentuknya zona
jernih di sekitar koloni
menggunakan milimeter sekrup mengukur zona batang dan zona jernih yang
terbentuk pada medium

E. Langkah Kerja Uji Katalase

membubuhkan alkohol pada gelas benda lalu dikeringkan dengan
melewatkannya di atas nyala api bunsen beberapa kali

secara aseptik mengambil satu ose penuh isolat bakteri kultur murni lalu
mengoleskannya pada gelas benda

dengan pipet tetes meneteskan 1 tetes larutan H2O2 3% pada olesan bakteri,
lalu melihat terjadi pembentukan gelembung atau tidak

3. Penghitungan Jumlah Sel Bakteri

Metode Spread Plate
mengencerkan secara berseri air kolam (sampel bakteri) hingga delapan kali
pengenceran menggunakan aquadest

memasukkan 0,1 ml suspensi bakteri hasil pengenceran ke dalam petridish

yang sudah berisi medium nutrien agar padat. meratakan dengan drigalsky,
masing-masing pengenceran dua pengulangan

wrapping isolat, inkubasi selama selama 24 jam secara terbalik

menghitung jumlah sel bakteri menggunakan teknik TPC

C. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 1. Data jumlah seluruh kultur bakteri

Hari ke

Asal bakteri

Jumlah

1/ 17 september 2013

Selasar kamar mandi Lt 1

45

Air kolam

25

Selasar kamar mandi Lt 1

93

Air kolam

49

2/ 18 september 2013

Suhu= 270C
Kelembaban= 84%

Tabel 2. Data kultur campuran kelompok VIII (18 September 2013)

Asal bakteri: selasar kamar mandi Lt 1
No Kode
Isolat
1
A

Warna

Konfigurasi

Margins

Keterangan

Jumlah

Putih

Jamur
menyebar

Round

Smooth

Round

Smooth

76

Kuning
orange
Kuning
muda
Putih

Putih

Putih

Irregular

Irregular
(erose)
Round
with Smooth
raised margin
Irregular
wavy

1
4
2

Tabel 3. Data Kultur Campuran (Asal bakteri: air kolam)

No
1
2
3

Kode isolat
A2
B2
C2

Warna
Putih
Putih
Putih

D2

Putih

konfigurasi
L- Form
Round
Round with scalloped
margin
Irregular and spreading

Margins
Smooth
Smooth
Wavy

Jumlah
1
46
1

Lobate

Tabel 4. Data bakteri yang diisolasi

No
1

Kode
isolat
E

Gambar

Warna

Konfigurasi

Margins

Putih

Round
with Smooth
raised margins

Putih

Irregular

Wavy

Kuning
muda

Round

Smooth

C2

Putih

Round
with Wavy
scalloped margins

Tabel 4. Data hasil morfologi dan kemampuan hidrolisa

Kode
isolat
E
F
C
C2

Morfologi sel
Gram
Bentuk sel
Negative Coccus
Negative Coccus
Negative Coccus
Negative Coccus

Susunan
Streptococcus
Monococcus
Monococcus
Monococcus

Kemampuan hidrolisa
NG SIMON SA SIM

+
+

Tabel 5. Uji Fermentasi Karbohidrat Kultrul Murni

Kode isolat

C2

Hari ke1 (selasa, 24/09/13)

2 (rabu, 25/09/13)
3 (kamis, 26/09/13)
4 (jumat, 27/09/13)
1 (selasa, 24/09/13)
2 (rabu, 25/09/13)
3 (kamis, 26/09/13)
4 (jumat, 27/09/13)

Fermentasi karbohidrat
Glukosa
Sukrosa
Laktosa
A (kuning) A (kuning)
A (kuning)

Tabel 6. Uji katalase

Kode isolat
E
F
C
C2

Katalase
Ada gelembung (Positif)
Ada gelembung (Positif)
Ada gelembung (Positif)
Ada gelembung (Positif)

Tabel 7. Kebutuhan Oksigen dan Karakteristik Sebaran Kultur Murni

Kode Isolat
C
C2

Kebutuhan Oksigen
Karakteristik Kultur
Medium Aerob/Anaerob Medium Bentuk Sebaran
Anaerob
Crateriform
NB
NA
Anaerob
Crateriform

Tabel 8. Penghitungan Jumlah Sel Bakteri

Klpk
1

Jenis Sampel
Padat (tanah)

Metode

-5

Pour plate

Pour plate

Spread plate

Spread plate

Pengenceran

Cair (air kolam)

10
10-6
10-7
10-8
10-5
10-6
10-7
10-8
10-5
10-6
10-7
10-8
10-5
10-6
10-7
10-8

Pour plate

Pour plate

Spread plate

Spread plate

Ulangan
1
8
1
Kontam
Kontam
114
43
1
16
16
6
4
27
3

2
5
4
kontam
kontam
0
13
2
kontam
9
kontam
7
6
65

Tabel 9. Penghitungan Jumlah Bakteri yang Memenuhi Persyaratan

Klpk
3

Jenis
Sampel
Padat

Metode

Pengenceran

Spread plate

10-5

Spread plate

10-6

Cair

Pour plate

10-8

Cair

Spread plate

10-8

Jumlah
Perhitungan
Koloni
114
114 x 105 x 10 =
114 x 106 = 1,14
x 108 cfu/gr
43
43 x 106 x 10 =
4,3 x 108 cfu/gr
36
36 x 108 = 3600
x 106 = 3,6 x 109
cfu/ml
65
65 x 108 x 10 =
65 x 109 = 6,5 x
1010 cfu/ml

D. PEMBAHASAN

Pada praktikum mikrobiologi terdiri dari tiga topik percobaan, topik

pertama adalah teknik-teknik dasar dalam praktikum mikrobiologi Terdiri atas
subtopik pengenalan alat dan bahan/media, isolasi kultur campuran dan
penyediaan kultur murni. Topik kedua yaitu karakterisasi fenotipik isolat bakteri.
Dan topik ketiga yaitu penghitungan jumlah sel bakteri dengan tujuan
melakukan pengenceran berseri dan melakukan penghitungan jumlah sel bakteri
viable suatu sampel atau kultur bakteri penghitungan dilakukan dengan cara
total plate count.
Dalam menjalankan prosedur kerja di Laboratorium Mikrobiologi haruslah
tertib untuk menghindari ancaman kontaminasi mikroorganisme terhadap media
kultur bakteri dengan menerapkan metode aseptik pada setiap percobaan
terutama pada saat melakukan kultivasi mikroorganisme dan pemindahan
(transfer) kultur murni. Membersihkan meja dengan menggunakan alkohol
sebelum maupun sesudah melakukan kegiatan merupakan langkah penting yang
terkadang terlupakan. Menjaga kebersihan tangan dan bagian badan lainnya
yang sekiranya bersinggungan dengan peralatan yang digunakan.
Pada praktikum topik pertama praktikan melakukan isolasi kultur
campuran dan penyediaan kultur murni secara aseptik. Isolasi adalah kegiatan
untuk memisahkan bakteri yang diinginkan dengan bakteri kontaminan.
Pemisahan mikroorganisme dari lingkungannya ini bertujuan untuk memperoleh
biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri lainnya atau yang
disebut biakan murni. di alam, populasi mikroorganisme tidak terpisah
(segregasi) berdasarkan spesies akan tetapi berada (exist) dalam sebuah populasi
campuran (mixed population). Untuk melakukan isolasi kultur campuran,
praktikan mengambil sampel mikroorganisme yang berasal dari udara di selasar
kamar mandi laboratorium lantai 1 dan kultur mikroorganisme yang berasal dari
air kolam. Medium tumbuh yang digunakan adalah agar plate dengan media
kultur berupa media SA (Strach Agar) dimana bahan yang digunakna adalah NA

+ 1% Starch. Dalam hal ini dibuat 500 ml media dengan NA yang dibutuhkan
adalah 14 gram, dan starch sebanyak 0,14 gram. Kedua bahan tersebut kemudian
dilarutkan dalam aquadest hingga 500 ml.
Untuk mendapatkan mikroorganisme dari udara di selasar kamar mandi
lantai 1, dengan cara membuka media SA selama 30 menit. Pada saat
pengambilan sampel Suhu lingkungan di selasar kamar mandi lantai 1 adalah 27
0

C, dan kelembaban udara 84 %. Mikroorganisme yang mempunyai suhu

optimum diantara 0o-20o C disebut psikrofil. mikroorganisme yang tumbuh cepat

pada kisaran suhu 20o-50o C disebut mesofil, sedangkan mikroorganisme yang
tumbuh pada kisaran suhu 50o-100o C disebut thermofil. (Bibiana W, 1994: 56)
Untuk kultur mikroorganisme dari air kolam, sampel telah disediakan oleh
laboran dan dalam hal ini, metode yang digunakan untuk mengkultur
mikroorganismenya adalah metode streak plate dengan model Continous streak.
Metode ini lebih menguntungkan karena lebih sederhana, menghemat waktu dan
penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. bakteri
yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar terutama
bila digunakan lempengan agar basah (Bibiana W,1994). Kemudian setelah itu
kedua medium kultur pada petridish di wrapping dan diinkubasi selama 24-48
jam secara terbalik. Inkubasi secara terbalik pada kultur bertujuan agar hasil
respirasi yang mungkin dihasilkan bakteri akan jatuh ke dasar tutup petri
sehingga tidak menganggu pertumbuhan bakteri pada media.
Pengamatan terhadap kultur campuran dilakukan selama 24-48 jam. yaitu
dua kali pengamatan pada hari pertama setelah penanaman (17 september)
didapat jumlah koloni bakteri pada isolat selasar kammar mandi lt 1 sejumlah 45
koloni dan pada air kolam sejumlah 25 koloni. dan pada hari kedua (18
september) jumlah seluruh koloni bakteri pada isolat selasar kamar mandi lt 1
sejumlah 93 koloni dan pada air kolam sejumlah 49 koloni. Selanjutnya
dilakukan identifikasi terhadap kultur bakteri campuran yang didapat
berdasarkan warna, konfigurasi, margin, dan jumlah koloni. Untuk memudahkan
dalam mengidentifikasi koloni bakteri yang didapat diberi kode isolat dari A-F.

selain koloni bakteri juga didapati mikroba lain yaitu jamur. hal ini
dimungkinkan karena penyebaran spora Jamur melalui udara dan pada saat
pangembilan sampel mikroorganisme diudara sporanya masuk atau menempel
pada media SA.
Koloni bakteri hasil dari kultur campuran kemudian digunakan sebagai
sumber penyediaan kultur murni. kultur murni ini adalah mengambil kolonikoloni bakteri yang saling terpisah dari yang lain, dengan ose steril secara
aseptis, dan memindahkannya keagar miring (agar slope/ agar slant), sehingga
masing-masing kultur bakteri pada agar miring ini mewakili satu strain bakteri
(single strain of bacteria). koloni bakteri yang diisolasi untuk kultur murni ada
empat koloni bakteri. koloni bakteri yang diisolasi untuk kultur murni dipilih
koloni yang memisah atau tidak terlalu berdekatan dengan koloni bakteri lain
agar pada saat pengambilan tidak tercampur dan lebih mudah. Pertama koloni
bakteri E yang berasal dari udara selasar kamar mandi lantai 1, berwarna putih,
konfigurasi Round with raised margins, margin smooth. Kedua, koloni bakteri F
yang berasal dari udara selasar kamar mandi lantai 1, berwarna putih,
konfigurasinya Irregular, margin wavy. Ketiga koloni bakteri C yang berasal
dari udara selasar kamar mandi lantai 1, berwarna kuning muda, konfigurasi
Round, margin smooth. Keempat koloni bakteri C2 berasal dari air kolam,
berwarna putih, konfigurasi Round with scalloped margins, margin wavy.
Teknik penyediaan kultur murni dilakukan dengan menginokulasikan ose biakan
bakteri tadi secara zig-zag pada medium agar slope. Pola zig-zag dapat
menunjukkan motilitas dari biakan bakteri tersebut. Selanjutnya, biakan tersebut
dapat disimpan atau digunakan dalam percobaan untuk melihat morfologi
koloni, sel dan karakterisasi bakteri.
Topik kedua adalah karakterisasi fenotipik isolat bakteri. Pada topik ini
dilakukan pengujian karakteristik kultur bakteri yang meliputi morfologi sel dan
sifat fisiologis pada berbagai media. Untuk mengetahui morfologi sel dilakukan
pengecatan gram. Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik bila digunakan
biakan segar yang berumur 24-48 jam. bila digunakan biakan tua terdapat

kemungkinan penyimpangan hasil pewarnaan gram. pada biakan tua banyak sel
yang mengalami kerusakan pada dinding selnya. kerusakan pada dinding sel ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan alkohol.
pengecatan gram memilahkan bakteri menjadi gram positif dan gram negative.
bakteri gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna Kristal
violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi alkohol, sedangkan bakteri
gram negative berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu
pemberian alkohol dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna
merah. perbedaan hasil dan pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur kedua
kelompok bakteri tersebut.
Hasil pengecatan dari keempat isolat bakteri dapat diketahui semua bakteri
berwarna mereh yang artinya bakteri tersebut tidak dapat mengikat warna violet
pada kristal violet. keempat isolat tersebut termasuk ke dalam kelompok bakteri
gram negatif. Setelah dilakukan pengecatan, isolat tersebut diamati pada
mikroskop dengan perbesaran 400x, pengamatan dilakukan untuk mengetahui
bentuk dan penataan bakteri. Dari hasil pengamatan, diperoleh bentuk coccus
yakni bentuk bakteri seperti bola. dan, penataan bakteri coccus yang teramati
pada tiga isolat yaitu monococcus atau bentuk bola tunggal dan satu isolat
berbentuk streptococcus.
Selanjutnya adalah uji fisiologis (biokimiawi) pada uji ini stok kultur
bakteri murni yang digunakan hanya dua bakteri yaitu C dan C2 karena
pertumbuhan bakterinya banyak, agar bisa digunakan untuk uji-uji selanjutnya.
Uji kemampuan hidrolisa gelatin (NG) pencairan gelatin diuji dengan cara
menusukkan mikroorganisme yang akan diuji (bakteri C dan C2) ke dalam
media semi padat yang mengandung nutrient broth dan gelatin. gelatin dapat
mencair bila diinokulasikan dengan mikroorganisme yang mampu maupun tidak
mampu menghidrolisa gelatin. berdasarkan hal tersebut maka gelatin harus
dimasukkan kedalam lemari es selama 30 menit untuk mengetahui kemampuan
mikroorganisme

menghidrolisa

gelatin.

bila

mikrooganisme

mampu

menghidrolisa gelatin maka media semi padat gelatin tetap bersifat cair setelah

dikeluarkan dari lemari es. dari hasil uji dapat diketahui bakteri C dan C2 tetap
dapat atau mampu menghidrolisa gelatin (NG).
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energy. pada uji ini
menggunakan medium sitrat- simmon berupa medium padat. Simmons citrate
agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber
karbon, NH4+ sebagai sumber N dan brom thymol blue sebagai indicator pH. Bila
mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari
medium biakan sehingga menyebabkan peningkatkan pH dan mengubah wana
medium dari hijau menjadi biru. perubahan warna hari hijau menjadi biru
menunjukan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon. dari data hasil uji menunjukkan bakteri C dan C2 negatif
terhadap uji Simon ditunjukkan tidak adanya perubahan warna pada media
Simon. Hal ini berarti bakteri tidak mampu menggunakan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon.
Uji hidrolisis pati, menggunakan media agar yang mengandung zat pati
starch agar (SA). Zat pati bereaksi secara kimiawi dengan yodium; reaksi ini
terlihat sebagai warna biru kehitaman. warna biru kehitaman ini terjadi bila
molekul yodium masuk ke dalam bagian yang kosong pada molekul zat pati
(amilosa) yang berbentuk spiral. proses yodinisasi zat pati menghasilakn
molekul yang mengabsorbsi semua cahaya, terkecuali warna biru. bila zat pati
ini telah diuraikan menjadi maltose atau glukosa, warna biru ini tidak terjadi
karena tidak adanya bentuk spiral. jika bakteri membentuk amylase dalam media
yang mengandung zat pati, maka zat pati disekeliling pertumbuhan bakteri
dihidrolisiskan. bila zat pati tidak dihidrolisiskan terlihat warna biru-kehitaman
disekeliling pertumbuhan. Dari hasil inokulasi bakteri pada media SA
didapatkan bahwa bakteri C dan C2 tidak mampu menghidrolisa pati yang
ditunjukkan dengan tidak terbentuk zona jernih disekitar koloni (tetap berwarna
biru). dengan kata lain bakteri tidak dapat membentuk amilase yang dapat
menghidrolisis pati.

Uji motilitas dengan media SIM. Uji motilitas ini bertujuan untuk
mengetahui ada atau tidak pergerakan bakteri. Motilitas bakteri terlihat ketika
adanya pertumbuhan pada medium yang tidak terbatas pada stab line inokulasi,
sedangkan pertumbuhan bakteri nonmotil terbatas pada garis inokulasi.
Pergerakan bakteri ini terlihat dengan adanya pemisahan agar yang ditandai
dengan adanya warna hitam. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri bermigrasi dari
garis inokulasi ke bentuk kekeruhan padat medium. Bakteri yang motil berarti
memiliki flagel atau alat gerak, sedangkan nonmotil tidak memiliki flagel. Hasil
dari kedua isolat bakteri C dan C2 adalah negatif hal ini berarti bakteri tidak
motil atau tidak memiliki alat gerak. Menurut Volk (1988), bakteri yang
berbentuk coccus kebanyakan adalah bersifat immotil.
Selanjutnya, Uji fermentasi karbohidrat media yang digunakan adalah
glukosa, sukrosa, dan laktosa yang masing-masing diberi tabung durham untuk
mengetahui adanya pembentukan gas. pengamatan dilakukan 4 hari (24-27
september) hasil dari inokulasi bakteri pada media dapat diketahui sebagai
berikut; pada hari keempat isolat bakteri C pada media glukosa dan sukrosa dan
isolat bakteri C2 pada media laktosa mengalami perubahan warna menjadi
kuning hal ini menunjukan adanya pembentukan asam yang merupakan hasil
dari proses fermentasi bakteri. asam yang dihasilkan akan menurukan pH media
biakan sehingga warnanya berubah menjadi kuning.
Uji katalase, bertujuan untuk mengetahui keberadaan katalase pada
bakteri. Enzim katalase pada bakteri dapat dideteksi dengan penambahan
substrat H2O2. Hasil positif dari aktivitas katalase positif ditandai dengan adanya
gelembung gas O2. Dari hasil pengamatan keempat isolat bakteri (E, F, C, C2)
menunjukkan hasil positif yaitu terlihat pembentukan gelembung udara disekitar
koloni. Reaksi kimiawi yang di katalisasikan oleh enzim katalase adalah sebagai
berikut:

Uji kebutuhan oksigen dengan medium NB. Mikroorganisme mampu

menggunakan molekul bukan oksigen sebagai akseptor electron terakhir. bila
akseptor electron ini bukan merupakan oksigen, maka organism tersebut
melaksanakan respirasi anaerob. nitrat NO3- digunakan oleh mikroorganisme
tertentu sebagai akseptor electron terakhir, nitrat ini direduksi menjadi nitrit
(NO2-) dari uji kebutuhan oksigen pada isolat bakteri C dan C2 hasilnya adalah
anaerob. pertumbuhan terjadi dibagian bawah media yang tidak memperlihatkan
perubahan warna, pertumbuhan terlihat sebagai kekeruhan, pembentukan gas
atau flokulas. Selanjutnya Uji karakteristik kultur dengan medium NA (nutrient
agar). diperoleh hasil pengamatan isolate bakteri yang diinokulasikan pada
medium NA termasuk kedalam Crateriform.
Setelah melakukan karakterisasi fenotip isolat bakteri, selanjutnya adalah
penghitungan jumlah sel bakteri. Data pada kegiatan ini menggunakan data kelas
yang memuat data keseluruhan kelompok. Sampel yang digunakan adalah
sampel padat berupa tanah dan sampel cair berupa air yang diambil dari kolam
di laboratorium biologi FMIPA UNY. Praktikan melakukan penghitungan
jumlah bakteri secara tidak langsung berdasarkan jumlah koloni (total plate
count). Metode ini merupakan analisis untuk menguji cemaran mikroba dengan
menggunakan metode pengenceran dan metode cawan tuang. Pertama
melakukan pengenceranhingga 8 kali pengenceran. Pengenceran dilakukan agar
populasi mikroba yang tumbuh pada media agar plate tidak terlalu padat
sehingga lebih mudah dihitung. Metode yang dilakukan ada dua yaitu pour plate
dan spread plate. Penghitungan dilakukan pada pengenceran lima sampai
delapan. Pengenceran dipilih pada konsentrasi rendah dengan harapan bakteri
tidak tumbuh menumpuk agar bisa dihitung.
Syarat penghitungan jumlah koloni bakteri : (1) tidak bertumpuk, (2)
jumlah koloni antara 30-300 koloni, (3) koloni tidak menutup setengah dari
petridish. (4) perbandingan jumlah bakteri dari pengenceran berturut-turut antara
pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau
lebih kecil dari dua maka jumlah bakteri merupakan hasil rerata dari dua

pengenceran tersebut,jika lebih besar dari dua maka yang dipakai adalah jumlah
bakteri dari pengenceran sebelumnya. Dari hasil pengamatan diketahui tiga data
kelompok yang memenuhi syarat untuk dilakukan penghitungan, sisanya tidak
memenuhi syarat dan terkontaminasi hal ini bisa dikarenakan beberapa
kemungkinan yaitu, kegiatan dilakukan tidak aseptik, pada saat penanaman alat
yang digunakan untuk meratakan (drigalsky) terlalu panas sehingga bakteri mati
dan tidak dapat tumbuh.
Dari data hasil penghitungan di atas, jumlah sel bakteri pada sampel cair
terhitung (4,3 x 108 )/(1,14 x 108) = 3,77 yang nilainya lebih besar dari 2 maka
jumlah sel bakteri pada sampel padat memakai jumlah sel bakteri dari
pengenceran 10-5 (pengenceran yang lebih kecil), yakni 1,14x108 cfu/gr. Pada
sampel cair tidak dapat ditentukan jumlah sel bakterinya dalam cfu/ml walaupun
jumlah

koloni tiap petridish telah terpenuhi. Hal ini dikarenakan tidak

terpenuhinya persyaratan perhitungan, yaitu perbandingan jumlah bakteri dari

hasil pengenceran berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan
pengenceran sebelumnya.
Syarat yang tidak terpenuhi ini dikarenakan sedikitnya koloni yang
tumbuh tiap petridish pada sebagian besar hasil pengenceran bertingkat. Hal ini
dikarenakan terlalu kecilnya konsentrasi dan banyaknya pengenceran tanpa
memperhitungkan sampel yang digunakan mengandung banyak mikroorganisme
atau tidak. Logikanya pada sampel cair, sampel memiliki kekeruhan yang sangat
kecil (hampir bening), dapat diduga kepadatan mikroorganisme di sana sangat
kecil, seharusnya tidak menggunakan pengenceran bertingkat yang terlalu
banyak. Meskipun asumsinya untuk setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu
sel, tapi di sinilah kelemahannya, ketika tidak diketahui seberapa besar
kemungkinan sampel tersebut mengandung mikroorganisme, tidak dapat
menentukan pula jumlah pengenceran yang tepat dan efisien untuk mendapatkan
jumlah koloni tiap petridish yang memenuhi syarat perhitungan jumlah sel
bakteri.

F. KESIMPULAN
Dari praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Teknik asptik pada laboratorium adalah teknik yang mengarah pada
praktikum oleh ahli mikrobiologi untuk menghindarkan media kontaminan
atau jaringan hidup kontaminan lainnya, teknik ini meliputi pencucian tangan,
penggunaan disenfektan pada permukaan meja,

penggunaan pemanas

bunsen, penggunaan pipet secara benar dan pembuangan kultur dan peralatan
yang rusak.
2. Teknik isolasi terdiri atas teknik streak plate antara lain T Streak, Radiant
Streak dan Continuous Streak, juga metode pour plate.
3. Media tumbuh bakteri terdiri atas tiga jenis yaitu media padat (NA (Natrium
Agar), SIMON, SIM dan SA (Starch Agar). Sementara untuk medium cair
antara lain NB (Natrium Broth), glukosa, sukrosa, dan laktosa. Dan untuk
media semisolid digunakan medium NG (Natrium Gelatin).
4. Uji biokimiawi meliputi hidrolisis dan fermentasi karbohidrat. Hidrolisis
meliputi hidrolisis terhadap pati, gelatin, sitrat. Fermentasi karbohidrat
meliputi uji sukrosa, glukosa, dan laktosa dengan parameter berupa
perubahan warna dan timbulnya gelembung. Selain itu dialakukan uji
terhadap kebutuhan O2 dan karakteristik kultur.
5. Pengecatan gram merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan untuk
mengetahui jenis, bentuk dan susunan bakteri, dalam hal ini jenis bakteri ada
dua macam yaitu bakteri gram positif (ungu) dan bakteri gram negatif
(merah).
6. Penghitungan jumlah sel bakteri dilakukan berdasarkan jumlah koloni (Total
Plate Count) atau Viable Plate Count terhadap bakteri yang ditanam
menggunakan metode pour plate dan spread plate, dengan melakukan
pengenceran sebelumnya sebanyak delapan kali penegnceran. Salah satu
persyaratan suatu bakteri dapat dihitung adalah jumlah koloni bakteri
berjumlah 30 300 koloni tiap petridish.

DAFTAR PUSTAKA

Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: PT

Gramedia pustaka utama.
Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium/Bibiana W. Lay;
Sugyo Hastowo, Ed. 1. Cet. 1. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada.
Volk, Wesley A. 1988. Mikrobiologi Dasar. alih bahasa Markham ; editor
Soenarto Adisoemarto. Jakarta : Penerbit Erlangga