Improving the production of transgenic fish germlines: In vivo evaluation of

mosaicism in zebrafish (Danio rerio) using a green fluorescent protein (GFP)

and growth hormone cDNA transgene co-injection strategy.
Amanda Swari Prasepti1, Claudya Larisha1, Endah Permata Sari1, Shafa Imanda1
1
Jurusan Biologi (Bioteknologi), Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Al Azhar Indonesia
Jl. Sisingamangaraja, Kebayoran Baru, Jakarta Selatan 12110

ABSTRAK
Metode mikroinjeksi pada ikan biasanya digunakan untuk mentransfer
gen. Tetapi hasil terekspresinya gen akan beragam karena integrasi transgen
yang terlambat. Jika tidak terintegrasi ke dalam sel bakteri maka gen tidak dapat
terekspresi dengan baik pada keturunannya. Maka dari itu tujuan dilakukannya
penelitian ini adalah untuk mengevaluasi in vivo mosaikisme sampai pada tahap
tertentu dalam mengekspresikan gen. Ketika ikan tersebut diberi reporter gen
berupa GFP dan growth hormone cDNA, maka akan terlihat mosaikisme dari
germline dan ukuran tubuh pada hewan model. Pada penelitian ini menghasilkan
keturunan dari ikan transgenik dengan gen yang terekspresi secara stabil.
Kata kunci : Transgenesis, ikan transgenik, mikroinjeksi, growth hormone cDNA.
PENDAHULUAN
Transgenesis

untuk
merupakan

proses

mengintroduksi satu atau lebih gen ke

dalam embrio suatu organisme yang
selanjutnya

gen

tersebut

dapat

ditransmisikan pada generasi berikutnya.

di

maupun

berkaitan

dengan

karakter

fisiologis

proses

pada

genetik

tahap

awal

ontogenesis dan salah satu contoh hewan

yang akan ditransgenik adalah ikan jenis
Danio rerio atau yang lebih dikenal zebra
fish.

Gen asing yang diintroduksikan tersebut

biasanya

manipulasi

Transfer

gen

pada

ikan

ini

bertujuan sebagai model eksperimetal

fenotipe penting dalam suatu budidaya,

dalam

sehingga dapat menghasilkan organisme

khususnya

yang lebih unggul dari pada oraganisme

melibatkan

aslinya. Dan dengan adanya metode ini

organogenesis, serta dalam mempelajari

kita

ke

penyakit penyakit yang menyerang

dengan

manusia, serta dalam memproduksi protein

menyajikan reproduksi dan karakteristik

rekombinan. Salah satu cara untuk transfer

biologis

gen

dapat

organisme

mengaplikasikannya
vertebrata

yang

rendah

memungkinkan

mudah

hal

ini

penelitan
dalam

dibidang

medis

penelitian

yang

embriogenesis

adalah

dengan

dan

mikroinjeksi.

Penggunaan mikroinjeksi dalam transgenik

transgen. Transgen yang satu diambil dari

ikan didukung oleh hal-hal seperti jumlah

ikan mas (Cyprinus carpio) - aktin

telur yang relatif banyak dan fertilisasinya

promotor mendorong ekspresi baik A.

terjadi secara eksternal yangmemudahkan

Victoria GFP gen (pcA / GFP plasmid)

introduksi gen asing pengkode target.

atau ikan silverside laut (Odonthestes

Dengan mikroinjeksi pada ikan

zebra ini yang dapat memungkinkan
mengevaluasi motif dan potensi induk
dalam

menghasilkan organisme yang

diingkinkan. Penggunaan gen reporter

yang memungkinkan evaluasi derajat di
mosaicism vivo pada ikan transgenik dapat
memfasilitasi identifikasi pendiri. Gen
yang digunakan untuk motif pada ikan
zebra menggunakan gen coding untuk
green fluorescent protein (GFP) dari uburubur ubur yang telah banyak digunakan
sebagai gen pelapor.
Penelitian

ini

argentinensis)

untuk

diambil

hormon

pertumbuhannya yaitu (msGH) cDNA

(pcA / msGH plasmid). Yang kedua
disediakan oleh Dr. Suzanne Brooks
(Universitas Southampton, Inggris) yaitu
plasmid pcA / GFP untuk menghasilkan
pcA /msGH plasmid dan menggantinya
dengan gen GFP dengan msGH cDNA
(Marins et al., 2002). Kedua gen ini
dilinierisasi dengan Spe I enzim yang
terekstriksi

dan

disuntikkan

pada

perbandingan 1 : 1 ke dalam embrio ikan

tersebut dengan konsentrasi DNA total 35
ng uL-1. Setelah itu proses mikroinjeksi

bertujuan

untuk

menggunakan protocol yang sama dari

mengetahui hasil dari proses transgenesis

Vielkind (1992) menggunakan

pada zebra fish dengan menonjolkan

bermotor picoinjector (Narishige, Jepang).

ekspresi sifat pertumbuhannya (msGH)

dan mozaikisme (GFP).

Sebanyak 1872 embrio disuntikkan

dan diinkubasi dengan suhu 28 C sampai

METODOLOGI
Untuk

IM-30

telur-telur menetas. Satu minggu setelah

memproduksi

ikan

transgenic maka diperlukan ikan dewasa

dari spesies zebra fish (Danio rerio) wild
type. Lalu ikan dipelihara dalam sistem
perairan tertutup bersuhu 28 C dengan
penyinaran dibawah 14 h light/10 h. Lalu
telur yang terbuahi dari ikan tadi diambil
dan akan di mikroinjeksi dengan dua

pembuahan, ikan dianalisa kembali dengan

mikroskop epifluorescence (eksitasi = 485
nm; emisi = 520 nm). Lalu diklasifikasikan
menurut terekspresinya GFP embrio yang
tertetasi

dengan

pola

ekspresi

mosaikismenya(Gibbs dan Schmale, 2000;

Thermes et. al, 2002). Jika lemah maka
hanya ada beberapa sel yang terkspresi.

Jika moderat maka kurang dari 50%

telur yang masih bertahan sebanyak 1414

terekspresi dan yang terkuat akan lebih

yang

dari 50% terekspresi GFP-nya. Lalu gen

epifluorescence,

akan dievaluasi keberadaannya dengan

pembuahan, tingkat kelangsungan hidup

(RT-PCR). Ikan transgenic ini diberikan

untuk ikan yang tidak diobati embrio

nama G0 yang membawa gen GFP.

adalah 1414 dari 1872 (75,5%), sedangkan

Lalu ikan G0 dan ikan nontransgenik sama-sama dibesarkan untuk

dilihat skala pertumbuhannya. Mereka
diberi makan sehari dua kali dengan kadar
protein 47.5 %. Dan data ukuran serta
berat tubuh dianalisa menggunakan t-test
variasi heterogenus statistic program v.06
(statsoft, USA). Delapan G0 yang terpilih
dengan

ekspresi

GFP

yang

terkuat

dipisahkan di akuarium yan g berbeda dari

diamati

kelangsungan
microinjected

dibawah
satu

mikroskop

minggu

hidup

tingkat

setelah

embrio

adalah 877 dari 1872

(46,8%), dimana 275 dari 877 (31,4%)

digolongkan sebagai GFP negatif (tidak
ada ekspresi), 315 dari 877 (35,9%)
sebagai lemah GFP positif, 198 dari 877
(22,6%) sebagai moderat GFP positif dan
89 dari 877 (10,1%) sekuat GFP positif.
Jumlah dari tiga kelas ekspresi GFP adalah
602 dari 877 ikan (68,6%).

teman-temannya dan dipasangkan dengan

Dan setelah 12 bulan didapatkan

ikan non-transgenik. Hanya enam yang

hasil

ikan positif untuk ekspresi msGH

memilki hasrat untuk kawin dengan ikan

oleh RT-PCR msGH transgen. Dan analisa

non-transgenik (wild type) dan membuahi

untuk berat rata rata menunjukan

G1 dengan GFP yang terekspresi. Dari

peningkatan yang signifikan (p <0,01)

semua ketrurunan G0, G1, dan seterusnya

pada kelompok transgenik (1,79 g 0,37)

diekstrak DNA-nya dengan PCR untuk

dalam kaitannya dengan tipe liar dan untuk

dilihat apakah GFP dapat terekspresi

ikan pada usia yang sama (0.68 0.13 g).

dengan baik di setiap keturunannya.

Ini merupakan peningkatan pertumbuhan

sebesar

HASIL

2,6

kali

untuk

kelompok

transgenik dibandingkan dengan ikan nonTransgenik yang dilakukan pada

ikan zebra menghasilkan 1872 embrio

pada satu sel.dengan penggunaan cA /
GFP dan cA / msGH dengan rasio
equimolar (1:1). Dan setelah seminggu
pengamatan didapatkan embrio yang atau

transgenik dan menunjukkan ekspresi cA

/ msGH transgen di ikan zebra.
Dalam studi transmisi transgen,
delapan

ekor

ikan

G0

sangat

mengekspresikan GFP yang disilangkan

dengan ikan non-transgenik. Dua dari ikan

transgenik tidak menunjukan perilaku

M0104 sementara 588 anak G2 diperoleh

reproduksi yang dikembangkan namun

dari perkawinan F0104.

terdapat dua jantan (M0104 dan M0204)

dan empat betina (F0104, F0204, F0304
dan F0404) yang direproduksi, empat di
antaranya (M0104, F0104, F0204 dan
F0304) ditransmisikan gen GFP ke G1
dalam persentase yang bervariasi dari
2,2% menjadi 42%. Ekspresi GFP diamati
dalam keturunan G1 menunjukkan ikan
mengekspresikan gen ditransfer di semua
sel tubuh.
Namun, gen msGH hanya dapat
dideteksi

dalam

keturunan

G1

yang

diperoleh dari induk ikan M0104 dan

F0104 . Hanya setengah keturunan GFPpositif dari orangtua M0104 yang dapat
membawa gen msGH tetapi untuk induk
F0104 semuanya membawa gen tersebut.
Keturunan GFP-positif juga positif untuk
eksogen-nous GH gen (Tabel 1). Tidak ada
ekspresi

gen

GFP

dideteksi

dalam

keturunan dari orang tua M0204 dan

F0404.
Keturunan G1 dari M0104 dan
F0104 G0 mosaik orang tua yang positif
untuk kedua transgen yang dipelihara
sampai pematangan seksual dan enam G1
ikan

dari

masing-masing

induk

dikawinkan dengan jenis ikan liar untuk

menghasilkan keturunan G2. Sebanyak
466 anak G2 dihasilkan dari perkawinan

Gambar 1. Ikan Zebra (Danio rerio) a.Ikan

non-transgenik berumur 1 tahun (bobot =
0.68g 0.13 g) b. Ikan transgenik G0
berumur 1 tahun (bobot = 1.79 g 0.37 g)

dikendalikan oleh promotor ( dan -

PEMBAHASAN
Proses yang paling sulit pada
transgenic

adalah

saat

aktin).

menghasilkan

Analisis

RT-PCR

menunjukkan

germline yang dapat membawa transgen

bahwa 100% dari G0 ikan transgenik GFP

dalam keadaan stabil. Hal ini bertujuan

positif mengekspresikan gen msGH namun

untuk menghasilkan ikan transgenik yang

tidak semua ikan tersebut membawa

membawan transgen aktif (cA/msGH)

transgen msGH dalam sel dan bisa saja

namun juga transgen reporter (cA/GFP)

menurunkan transgen msGH ke generasi

yang mampu mengevaluasi mozaik yang

berikutnya, ini akan terlihat jelas ketika G0

terdapat

dan ikan wildtype disilangkan. Data

disemua

generasi

G0

ikan

transgenik.

percobaan pertumbuhan didukung hasil

Seminggu setelah 68,6% embrio

ikan diinjeksi, maka menghasilkan ikan
transgenik. Bila dibandingan dengan ikan
zebra transgenik 1,95% yang diperoleh
Morales et al. (2011) dan 10% ikan
transgenik yang diperoleh Rahman dkk.
(1997)

yang

menggunakan

transgen

reporter yang sama dengan startegi coinjeksi.

dari

RT-PCR

dan

menunjukkan

bahwa

kelompok transgenik meningkat berat 2,6

kali

lebih

banyak

dari

kelompok

nontransgenic. Hasil ini menunjukkan

bahwa

cA

msGH

transgen

menghasilkan hormon aktif. Semakin berat

ikan transgenik itu memungkin terkaitnya
dengan peningkatan msGH yang beredar
dan tidak dapat dikontrol oleh mekanisme
umpan

balik

negatif

yang

mengatur

Mereka menemukan bahwa 10%

ekspresi gen GH endogen (Peter dan

ikan

Marchant, 1995).

yang

dianalisis

olehnya

menghasilkan ekspresi gen reporter GFP

yang kuat, lebih dari 5% ekspresi GFP
lebih kuat dripada yang diperoleh oleh
Gibbs dan Schmale (2000) untuk ikan
zebra transgenik G0 dan 3% lebih kuat
yang diperoleh Thermes et al. (2002)
untuk G0 ikan transgenik. Kondisi yang
digunakan oleh para peneliti sebelumnya
mirip dan mereka juga menggunakan
transgen linierisasi di mana gen GFP

Konsekuensi negatif dari produksi

mozaik

germline

ikan

transgenik

kenyataan adalah bahwa sel ikan G0 hanya

dapat menerima sedikit atau tidak ada
sama

sekali

salinan

transgen

yang

membuat transmisi transgen ke generasi

berikutnya
diminimalkan

namun

hal

dengan

ini

dapat

mengevaluasi

mozaik dengan penggunaan strategi co

injeksi reporter. Hal ini dapat didukung

dengan

adanya

penelitian

yang

menunjukan adanya iakn yang positif GFP

memiliki telah terintegrasi pada kromosom

yang sama.

ke generasi G1.

Dengan adanya metode ini dapat

Presentasi dari GFP menujukan

memungkinkan mengidentifikasi ikan G0

bahwa ikan G1 memiliki tingkat mozaik

dan dapat pula mengidentifikasi ikan

yangs ama pada germ line ikan G0. Namun

transgen pada generasi berikutnya. Selain

pada penelitian ini menunjukan terdapat

itu, metode ini juga dapat digunakan untuk

dua

mengetahui

ikan

yang

tidak

menghasilkan

proses

integrasi

transgen

keturunan transgen, sementara empat ikan

genomik serta mengidentifikasi keturunan

yang ditransmisikan dengan cA / GFP

yang

dari 2,2% menjadi 42% yang positif

kromosom yang sama.

menunjukan adanya GFP. Pada penelitian

ini

dalam

mengidentifikasi

ikan

G1

ditransmisikan

transgen

pada

KESIMPULAN
Transgenik

sangatlah berhubungan dengan adanya gen

merupakan

teknik

reporter GFP dan penggunaan mikroskop

memindahkan gen dari satu makhluk hidup

epifluorescence. Ikan G1 ini berasal dari

ke makhluk hidup lainnya, baik dari satu

betina F0104 dan jantan M0104yang

hewan ke hewan lainnya ataupun dari satu

disilangkan dengan jenis ikan wild yang

tanaman ke tanaman lainnya. Salah contoh

memverifikasi

transgen

dari teknologi transgenetik ini yaitu ikan

tersebut di integrasi pada genom ikan G2.

transgenik yang mampu menghasilkan

Dalam G2 diproduksi dari keturunan

benih ikan unggul,

M0104 sejumlah ikan GFP-positif tidak

mutu genetik ikan yang dibudidayakan.

membawa eksogen GH transgen sementara

DNA

beberapa ikan GFP-negatif membawanya.

dikendalikan

Hal ini menunjukkan bahwa cA / GFP

genom,

dan cA / msGH transgen terpisah di G2,

dimasukkan dapat mengembangkan salah

sejak diamati rasio genotipe (Tabel 1)

satu aspek dari produktivitas, juga efeknya

sesuai dengangen terletak pada kromosom

dapat diturunkan kepada keturunannya. Ini

yang berbeda. Namun, untuk F0104

bermanfaat untuk meningkatkan produksi

keturunan G2 keturunan semua individu

dan produktivitas ikan. Keunggulan dari

GFP-positif yang membawa cA / msGH

rekayasa ini yaitu pertumbuhan cepat,

transgen serta cA / GFP transgenik,

tahan terhadap serangan penyakit, dan

menunjukkan

tahan terhadap lingkungan yang cukup

bagaimana

bahwa

kedua

transgen

rekombinan

melalui perbaikan

ikan

dimasukkan

sehingga

DNA

yang

telah

ke

dalam

ikan

yang

ekstrem.

Dalam

transgenik

ikan

menggunaan mikroinjeksi yang didukung

oleh hal-hal seperti jumlah telur yang
relatif banyak dan fertilisasinya terjadi
secara

eksternal

yang

memudahkan

introduksi gen asing pengkode target, yang

dapat memungkinkan mengevaluasi motif
dan potensi induk dalam

menghasilkan

organisme yang diingkinkan.

DAFTAR PUSTAKA
Figueiredo, Mrcio de Azevedo., Lanes,
Carlos

Frederico

Daniela

Volcan.,

Ceccon.,
and

Almeida,

Marins,

Luis

Fernando. 2007. Improving the production

of transgenic fish germlines: In vivo
evaluation of mosaicism in zebrafish
(Danio rerio) using a green fluorescent
protein (GFP) and growth hormone cDNA
transgene co-injection strategy. Genetics
and Molecular Biology. Vol 30 (1):31-36.