MAKALAH FITOKIMIA

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS, KROMATOGRAFI KERTAS, DAN

KROMATOGRAFI KOLOM

Anti Pebrianti Mentari

260110110054

Annisa Noor Insany

260110110088

Indah Khairunnisa H.

260110110144

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
SUMEDANG

2014
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT karena atas rahmat dan
ridho-Nya kami dapat menyelesaikan makalah ini. Makalah ini disusun untuk
melengkapi tugas mata kuliah Fitokimia dan diharapkan dapat menambah
pengetahuan bagi penulis dan pembacanya.
Terima kasih bagi seluruh pihak yang telah membantu dalam penyusunan
makalah ini, serta terima kasih kepada seluruh dosen yang telah membantu kami
untuk memahami ilmu Fitokimia dan ilmu farmasi secara umum, sehingga
makalah ini dapat terselesaikan dengan baik.
Kami menyadari bahwa makalah ini masih belum sempurna, oleh karena
itu kami mengharapkan saran-saran yang dapat membantu dalam penyempurnaan
makalah ini. Semoga makalah ini dapat memberi manfaat bagi seluruh penuntut
ilmu dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Fitokimia.
Atas perhatiannya, kami ucapkan terima kasih.

Jatinangor, Desember 2014

Tim Penulis

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Pengertian Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan.
Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat
sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat
berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan
isolasi senyawa murni skala kecil.

Pelarut yang dipilih untuk pengembang

disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis
seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi-pereaksi
yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai
Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat
dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan
sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang
ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil
dari 1,0.
Teknik Kromatografi Lapis Tipis
1. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran ratarata
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka
semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.Penjerap yang
paling sering digunakan adalah silica dan serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi.

2. Fase Gerak (1)

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang
paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi
campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga
pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk
dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2 - 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzena akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan.
d. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia
masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan
asam.
3. Aplikasi (Penotolan) Sampel (1)
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling
sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l,
maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan
pengeringan antar totolan.
4. Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan
sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan

uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel
dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam
bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel. Bejana
kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai
ketinggian lempeng yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase
gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah
mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak
telah jenuh.
5. Deteksi Bercak
Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia
yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu
pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara
fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara
pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar
ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat
bercak akan terlihat jelas.
Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :
a. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi
secara kimia dengan solut yang mengandung gugus fungsional tertentu
sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih
dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas
warna bercak.
b. Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang
gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak
yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang
berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan dapat dibeli dalam
bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluorosen yang tidak
larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar

fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen

fluorosensi setelah dilakukan pengembangan.
c. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu
dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak
sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.
d. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.
e. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu
instrument yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari
permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar
tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai
puncak (peak) dalam pencatatan (recorder)
6. Perhitungan Nilai Rf

Perbandingan jarak bercak dan jarak tempuh eluen

Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus:
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf
yang baik yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar
antara 0,2-0,8.

7. Alternatif Prosedur KLT

Adanya variasi prosedur pengembangan KLT dilakukan untuk meningkatkan

resolusi, sensitifitas, kecepatan, reprodusibilitas dan selektifitas. Beberapa
pengembangan ini meliputi KLT 2 dimensi, pengembangan kontinyu dan
pengembangan gradien. KLT 2 dimensi atau KLT 2 arah ini bertujuan untuk
meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai
karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama
sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, sistem 2 fase gerak yang
sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran
sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai
tingkat polaritas yang berbeda.
Pengembangan kontinyu dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara
terus menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki)
melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan.
Pengembangan gradien dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak
yang berbeda-beda. Tujuan utama system ini adalah untuk mengubah polaritas
fase gerak. Meskipun demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang
reprodusibel sangatlah sulit.
Penggunaan Kromatografi Lapis Tipis
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen
dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi,
menentukan efektivitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk
kromatografi kolom, serta memantau kromatografi kolom, melakukan
screening sampel untuk obat.
Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan untuk uji identifikasi senyawa
baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf.
Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung
pada lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik
densitometri dan cara berikutnya adalah dengan mengerok bercak lalu
menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak dengan metode

analisis yang lain, misalnya dengan metode spektrofotometri. Dan untuk

analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan
yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang nondekstruktif.
Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerok dan
dilakukan analisis lanjutan. Saat ini metode KLT semakin berkembang dengan
hadirnya KLT-KT (Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi), dimana cara ini
lebih efisien dan dengan menghasilkan analisa yang lebih baik dibandingkan
KLT biasa.
KROMATOGRAFI KERTAS
Pengertian Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas adalah suatu metode pemisahan campuran dari
substansinya menjadi komponen- komponennya berdasarkan distribusi suatu
senyawa pada dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fasa diam dalam
kromatografi berupa air yang terikat pada selulosa kertas sedangkan fasa geraknya
berupa pelarut organik non polar (pelarut yang sesuai).
Selulosa merupakan polimer dari gula sedehana yaitu glukosa. Rantai
polimer dari selulosa memiliki gugus hidroksil (-OH) disekeliling strukturnya.
Karena memiliki gugus -OH maka selulosa dapat berinteraksi dengan air oleh
karena itu pada fase diam bersifat sedikit polar. Didalam kertas selulosa
mengandung air yang berasal dari pembuatan kertas dan dari atmosfer. Dibawah
ini adalah struktur dari selulosa.
Bila digunakan fasa diam yang lain, maka biasanya kertas akan
dikeringkan, kemudian menggunakan fasa diam seperti glikol, formamide, dan
alkohol. Pelarut (eluen) yang digunakan bisa berupa pelarut murni, atau campuran
pelarut antara alkohol, asam-asam, ester, fenol dan amina.
Pemisahan pada kromatografi kertas terjadi kerena perbedaan kelarutan
zat-zat dalam pelarut serta perbedaan penyerapan (adsorbsi) kertas terhadap zatzat yang akan dipisahkan. Zat yang lebih larut dalam pelarut dan kurang
teradsorbsi pada kertas akan bergerak lebih cepat. Sedangkan zat yang kurang

larut dalam pelarut dan lebih teradsorbsi pada kertas akan tertinggal atau bergerak
lebih lama.
Kromatografi kertas merupakan bentuk kromatografi yang paling
sedehana mudah dan murah. Jenis kromatografi ini banyak digunakan untuk
identifikasi kualitatif maupun untuk analisis kuantitatif. Penemu kromatografi
kertas adalah Martri, Consden dan Gordon.
Teknik Kromatografi Kertas
1. Teknik menaik (ascending), pada teknik menaik ini rembesan fasa gerak
bergerak ke atas karena efek kapiler.
2. Teknik menurun (descending), pada teknik menurun ini rembesan fasa
bergerak ke bawah yang dikarenakan efek kapiler yang juga dibantu oleh
efek gravitasi sehingga rembesan berjalan lebih cepat.
Metode Kromatografi Kertas
1. Tahap penotolan cuplikan
Mula-mula menyiapkan kertas kromatografi dengan ukuran tertentu. Kertas
yang digunakan memiliki susunan serat kertas membentuk medium berpori yang
bertindak sebagai tempat untuk mengalirnya fase bergerak. Lalu membuat garis
awal dengan jarak 2-3 cm dengan salah satu ujung kertas dengan menggunakan
pensil. Selanjutnya totolkan larutan cuplikan dengan menggunakan mikropipet
atau pipa kapiler pada garis awal tadi, kemudian keringkan. Misalkan Kita ingin
mengetahui tinta mana yang digunakan untuk menulis pesan. Dalam diagram pena
diberi label 1, 2 dan 3 dan tinta pesan sebagai M.
2. Tahap pengembangan
Pada tahap ini ujung kertas kromatografi dekat garis awal yang telah berisi
totolan cuplikan dicelupkan ke dalam pelarut (pelarut untuk contoh ini misalnya

etanol) yang terdapat di dalam bejana kromatografi. Pencelupan diusahakan tidak

merendam totolan cuplikan atau garis awal. Kemudian bejananya ditutup.
Biarkan pelarut merembes melewati totolan cuplikan. Komponen-komponen
cuplikan akan terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan kelarutan komponenkomponen cuplikan dalam pelarut akan mengakibatkan kecepatan bergerak
komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak
komponen-komponen ini lebih umum disebut migrasi deferensial. Pemisahan
komponen-komponen ini terjadi karena migrasi deferensial. Hasil pemisahan akan
nampak sebagai noda-noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda
dari garis awal. Noda-noda ini selanjutnya disebut sebagai kromatogram.
Perembesan pelarut dihentikan setelah pelarut hampir mencapai ujung kertas.
Pekerjaan selanjutnya adalah memberi tanda batas gerakan pelarut, dan kemudian
kertas diangkat dari cairan pengelusi untuk seterusnya dikeringkan.
3. Tahap identifikasi atau penampakan noda.
Menghitung nilai Rf
Rf (rate of flow) menyatakan derajad retensi suatu komponen dalam fase
diam. Karena itu Rf juga disebut faktor refensi. Rf adalah jarak tempuh relatif
terhadap pelarut. Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona relatif terhadap
garis depan pengembang. Kromatografi yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona
dicirikan dengan nilai-nilai Rf.
Pengukuran

ini

dilakukan

dengan

mengukur

jarak

dari

titik

pemberangkatan (pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan

pusat rapatan tyiap zona. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun
ascending. Nilai Rf akan menunjukkan identitas suatu zat yang dicari.
Setiap komponen mempunyai harga Rf sendiri-sendiri. Dengan
menggunakan zat baku noda dapat diidentifikasikan.
Bila noda tidak berwarna, langkah pertama yang harus diambil adalah
menampakkan noda tersebut. Penampakan noda dapat dilakukan dengan cara:

1. Menyemprot kertas dengan pereaksi penimbul warna ditizon, ninhidrin,

kalium kromat, amonium sulfida dan lain-lain.
2. Menyinari sinar dengan sinar ultra violoet.
3. Mendedahkan kertas pada uap iodium.
Kemudian langkah selanjutnya adalah menentukan harga Rf masisng-masing dari
noda, seperti yang telah disebutkan diatas.

Kromatografi Kertas Dua Arah

Kromatografi kertas dua arah digunakan dalam menyelesaikan masalah
pemisahan substansi yang memiliki nilai yang sangat serupa. Pada prosesnya
menggunakan dua pelarut yang berbeda.
Misalnya kita menggunakan zat warna sebagai sampel. Prosedur yang
harus dilakukan adalah:
1. Tahap pertama
Mula-mula titik tunggal campuran ditempatkan pada salah satu ujung garis dasar.
Kemudian masukkan kedalam pelarut seperti yang sebelumnya hingga pelarut
mendekati ke atas kertas.
2. Tahap kedua
Pada kromatogram, posisi depan pelarut ditandai dengan pensil sebelum
kertas mengering, diberi lebel sebagai SF1. Kemudian masukkan kedalam pelarut
yang pertama, dihasilkan titik sentral besar dalam kromatogram yaitu sebagian
biru dan sebagian hijau. Dua pewarna dalam campuran memiliki nilai yang sudah
hampir sama.
3. Tahap ketiga
Menunggu kertas kering sepenuhnya, dan kemudian memutar kertas
sampai 900 dan kemudian mengembangkan kromatografi lagi di dalam suatu
pelarut yang berbeda. Bintik-bintik akan bergerak dengan jumlah yang berbeda,
hal ini menyebabkan terjadinya perbedaan nilai . Jika kita ingin mengidentifikasi
titik-titik dalam campuran maka kita harus menghitung nilai nya untuk disetiap
tempat, dan kemudian membandingkannya dengan nilai-nilai yang telah diukur

untuk senyawa yang dikenal dengan kondisi yang sama persis. Apabila kita
mengidentifikasinya dengan zat pembanding pada kromatogram yang sama
seperti

yang

dilakukan

diawal

dengan

pena,

maka

kita

tidak

bisa

mengidentifikasinya. Karena campuran yang dipisahkan pada contoh ini terpisah

menjadi empat tempat yang berbeda.
Prosesnya terlihat pada gambar dibawah ini.
Aplikasi Kromatografi Kertas dalam Kehidupan Sehari-hari
Aplikasi teknik pemisahan kromatografi kertas dalam kehidupan sehari-hari
adalah:
1. Menentukan komponen yang terkandung dalam uang logam.
Cara kerjanya adalah pertama-tama uang logam warna kuning dan putih dicuci
dan disikat, kemudian ditambahkan dengan HCl pekat sebagai pelarut pemisah
komponen uang logam. Selanjutnya cuplikan dari tetesan tersebut ditotolkan di
kertas kromatografi bersama dengan cuplikan HCl pekat, cuplikan CuSO 4, dan
cuplikan NiSO4. Fase diam pada percobaan ini adalah lapisan pelarut yang
teradsorbsi pada permukaan kertas berupa kertas kromatografi dan fase geraknya
adalah bagian dari pelarut yang berfungsi menggerakkan eluen berupa campuran
n-butanol, asam asetat glasial, dan air (untuk uang logam putih) dan campuran nbutanol, etanol, dan amoniak 2M (untuk uang logam kuning). Pada percobaan ini,
kromatografi kertas dilakukan secara ascending diamana pelarut yang terdapat
dibawah akan bergerak keatas pada kertas yang tercelup di dalamnya. Penjenuhan
dengan uap pelarut bertujuan untuk mempercepat terjadinya elusi atau pergerakan
komponen-komponen sampel pada media kertas kromatografi.
Maka hasil akhirnya adalah untuk uang logam warna kuning cuplikan dari
uang logam tersebut memiliki nilai Rf yang hampir sama dengan cuplikan CuSO4
sehingga dapat disimpulkan bahwa logam tersebut bahan penyusunnya adalah
tembaga. Sedangkan untuk uang logam putih tidak memiliki nilai R f yang sama
dengan CuSO4 maupun dengan NiSO4. Karena memang logam putih ini terbuat
dari aluminium maka tidak terdeteksi pada percobaan ini.

1. Menguji apakah bahan pewarna yang digunakan dalam makanan aman atu
tidak untuk dikonsumsi.
2. Menguji tinta yang digunakan pada pemalsuan dokumen, seperti surat
perjanjian, cek dan giro.
3. Menguji apakah terdapat obat terlarang dalam urin manusia.
4. Memeriksa apakah pestisida yang terdapat dalam sayuran atau bahanbahan masih dalam batas aman atau tidak.
5. Mengetahui kandungan asam amino tertentu dari campuran asam amino.
6. Dapat mengidentifikasikan keberadaan suatu unsur.
Misalnya ingin mengidentifikasi logam Ag, Pb dalam larutan pengembang asam
asetat. Caranya yaitu:
Mula-mula kertas kromatografi disiapkan, dan ditarik batas pensil kira-kira 2 cm
dari pinggir kertas. Lalu kertas dibagi menjadi empat kolom dan di beri nomor
pada tiap kolomnya. Pada kolom 1 dan 3 ditetesi dengan larutan cuplikan A dan B,
kolom 2 dan 4 dengan larutan baku Ag dan Pb (II). Sementara itu larutan
pengembang disiapkan yang berisi 12,5 ml larutan asam asetat dan air. Masukkan
kertas kromatografi kedalam larutan pengembang kemudian ditutup. Selanjutnya
kertas diambil dari dalam larutan bila kertas mencapai larutan pengembang.
Kemudian pada kertas diberi tanda batas dengan menggunakan pensil dan
kemudian

kertas

dikeringkan.

Kemudian

setiap

kolom

digunting

dan

disemprotkan dengan pereaksi pengenal. Larutan Ag dengan dikromat

menghasilkan warna merah dan Pb (II) dengan KI menghasilkan warna kuning.
Setelah warna tampak, jarak perpindahan dari tiap komponen diukur dan dihitung
nilai Rf. Dari data yang telah diperoleh kita gunakan asam oksalat sebagai pelarut.
Dan diperoleh masing- masing untuk kelarutan cuplikan A dan B, serta logam Ag
dan Pb.

KROMATOGRAFI PREPARATIF
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi
berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-

komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya
serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak
dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan
pemisahan.
KLT Preparatif dapat digunkaan untuk memisahkan bahan dalam jumlah
gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Seperti
halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase
gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan
bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan dengan
mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau aluminium oksida,
dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka
banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT
biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika
gel.
Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih
dahulu dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah
menguap, misalnya n-heksana, diklorometana atu etil asetat. Karena jika pelarut
yang digunakan tidak mudah menguap, maka akan terjadi pelebaran pita.
Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus
berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga
bergantung pada lebarnya pita.
Setelah plat KLT Preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah
diketahui dikerok dari plat. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben
dengan pelarut yang sesuai (5 ml pelarut untuk 1 gram adsorben). Diupayakan
untuk menggunakan pelarut yang paling nonpolar yang mungkin. Harus
diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka makin
besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak
yang diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan
membran.
Kelebihan dari penggunaan KLT Preparatif adalah biaya yang digunakan
murah dan memakai peralatan paling dasar. Sementara kekurangannya antara

lain : adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat adalah senyawa
beracun, waktu yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup panjang ,adanya
pencemar setelah proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen
yang diperoleh berkurang dari 40%-50% dari bahan awal.

KROMATOGRAFI KOLOM
1. Pengertian
Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk
pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi
kolom termasuk kromatografi cairan, adalah metoda pemisahan yang cukup
baik untuk sampel lebih dari 1 gram.
2. Prinsip
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap
dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam
sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir
kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat
sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan
turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa
tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus
sehingga terjadi pemisahan dalam kolom.
3. Mekanisme
Biasanya sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga merupakan
serbuk kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga tidak
terjadinya kerusakan waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel.
Fase diam dan sampel ini berada di dalam kolom yang biasanya dibuat dari
gelas, logam ataupun plastik. Selama elusi fase gerak dialirkan dari atas,

mengalir karena gaya gravitasi atau ditekan dan juga disedot dari arah bawa.
Komponen sampel akan terpisah selama bergerak dibawa fase gerak didalam
kolom (fase diam). Komponen yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan
keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung
sebagai fraksi, volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom).
4. Tahapan Kerja
a. Kolom kromatografi
Kolom biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi, ukurannya beragam.
Perbandingan panjang kolom sekurang-kurangnya 10 kalinya diameternya,
perbandingan ini tergantung mudah tidaknya komponen dipisahkan.
Perbandingan berat sampel dan fase gerak (1 : 30) biasanya cukup
memadai untuk pemisahan yang mudah, perbandingan dapat ditingkatkan
hingga (1:50) untuk komponen yang susah dipisahkan.
b. Fase diam
Ukuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase
diam untuk KLT, ukuran yang digunakan antara 63-250|iim. Ukuran
partikel lebih kecil 63 jam fase gerak akan mengalir lebih lambat, sehingga
perlu ditekan atau dihubungkan dengan pipa hisap. Silika gel (SiOi) adalah
fase diam yang serba guna, banyak digunakan. Pada pembuatannya silika
gel perlu diaktifkan panaskan pada 150-160C selama 3-4 jam. Fase diam
lain adalah alumina.
c. Pemilihan Fase gerak (pelarut=solven = eluen)
Pemilihan fase gerak sangat menentukan berhasil tidaknya pemisahan.
Untuk menentukan fase gerak yang akan digunakan, dilakukan
pendekatan:
1. Penelusuran literature/pustaka.
2. Mencoba dengan KLT.
Cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan fase
diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangkan dengan
fase gerak non polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang lebih polar.

d. Membuat kolom (packing)

Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering.
Cara basah lebih mudah untuk memperoleh packing yang memberikan
pemisahan yang baik. Sedangkan cara kering umumnya dilakukan untuk
alumina.
Cara basah
Kedalam ujung kolom kromatografi (tempat keluarnya fase diam)
diatas keran diletakkan gelas wool, tidak perlu ditekan kuat. Diatasnya
ditaburkan pasir sehingga membentuk lapisan tebal + 1 cm. Selanjutnya
dimasukkan petroleumeter sambil mencoba kecepatan menetes fase gerak
dengan memutar keran. Di dalam beker gelas dibuat bubur fase diam
dengan petroleum eter. Dengan bantuan batang pengaduk bubur
dimasukkan kedalam kolom berisi petroleum eter. Sambil diketuk-ketuk
butir-butir fase diam akan turun dan tersusun rapi didalam kolom. Bila
kolom penuh dengan petroleum eter keran dibuka untuk menurunkan
permukaannya dan petroleum eter yang keluar dapat digunakan
lagi untuk membuat bubur fase diam. Packing dihentikan sampai panjang
kolom yang dikehendaki. Selapis pasir diletakkan pada packing kolom
untuk melindungi kolom. Kolom dijaga untuk tidak kering, maka diatas
lapisan pasir haras selalu ada selapis fase gerak. Pada proses packing ini
dinding luar kolom gelas disemprot dengan aseton. Penyemprotan
dimaksudkan

untuk

mendinginkan

kolom

sehingga

menghambat

terbentuknya gelembung udara. Adapun untuk kolom yang diameternya

kecil fase diam kering dapat ditaburkan sedikit demi sedikit kedalam
kolom yang berisi petroleum eter. Kolom ini digunakan setelah disimpan
semalam.
Cara kering

Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian fase gerak

dimasukkan lapis demi lapis sampil ditekan dengan karet atau alat penekan
lain. Selain ditekan dapat juga dibantu dengan dihisap, sehingga dihasilkan
packing fase diam yang mampat. Diatas fase diam diletakkan kertas saring
dan diatasnya lagi selapis pasir. Pada posisi keran terbuka fase gerak
dituangkan dan dibiarkan mengalir keluar. Packing kolom disimpan
dengan mempertahankan selapis fase gerak berada diatas lapisan pasir.
e. Penyiapan Sampel
Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai,
kemudian dituangkan hati-hati diatas packing kolom. Fase gerak
dikeluarkan tetes demi tetes, diatur kecepatan menetesnya (tergantung
besar-kecilnya kolom) dan dijaga kolom tetap terendam, untuk itu
ditambah fase gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak merusak packing
kolom. Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi. Volume fraksi
tergantung berat sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat
proses awal elusi ini. Makin kecil volume fraksi, akan diperoleh
pemisahan yang lebih baik, namun akan dikumpulkan banyak fraksi.
Untuk 10 gram sampel biasanya dikumpulkan fraksi dengan volume a 150
ml.
Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah
dengan mencampur dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan
dalam pelarut yang sesuai, biasanya pelarut yang digunakan adalah pelarut
yang digunakan untuk pembuatan ekstrak. Larutan ekstrak ini kemudian
dicampur dengan 2,0-3.0 bagian fase diam, dengan hati-hati campuran ini
dikeringkan didalam rotary evaporator hingga diperoleh serbuk ekstrak
kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan ditutup dengan
selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.
f. Elusi (pengembangan)

Fase gerak (cairan =pelarut pengembang)

Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit
demi sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom
sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya. Cara yang praktis adalah
dengan memasukkan kedalam corong pisah, ujung corong pisah
dimasukkan kedalam corong pisah, ujung corong pisah dimasukkan ke
dalam kolom dan ujung lain tertutup, sedangkan keran terbuka. Fase gerak
akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan keluarnya fase gerak dari
kolom.
Dibedakan dua jenis cara elusi:
>> Elusi gradien (bertahap) yaitu selama proses elusi menggunakan fase
gerak dengan polaritas tetap.
>> Elusi isokratik yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak
berubah-ubah polaritasnya. Untuk membuat polaritas berubah-ubah
maka komposisi fase gerak berubah. Pada umumnya dimulai fase gerak
non polar kemudian berubah ke pelarut polar. Perubahan ini dapat
diprogramkan sesuai dengan pemisahan yang diinginkan.

Elusi dihentikan jika sudah tidak ada lagi sampel yang dapat dibawa keluar
lagi oleh fasa gerak, bila digunakan elusi gradient sidah sampai pada fase
gerak yang paling polar.
g. Komponen yang dipisahkan

Kromatografi kolom yang konvensional tidak dilengkapi detektor, namun

sekarang dapat digunakan dengan mengalirkan eluate (efluen) pada detector
untuk mendeteksi komponen. Yang umum digunakan dan mudah dikerjakan
adalah dengan memonitor fraksi dengan KLT. Fraksi yang mempunyai profil
bercak KLT yang mirip digabungkan. Selanjutnya gabungan ini dapat
dianalisis lebih lanjut.
Kromatografi Kolom Vakum
1. Pengertian Kromatografi Kolom Vakum
Kromatografi kolom vakum (KKV) adalah kromatografi yang dilakukan
untuk memisahkan senyawa dengan menggunakan silika gel sebagai adsorben dan
berbagai perbandingan pelarut (elusi gradien) dan menggunakan pompa vakum
untuk memudahkan penarikan eluen.
Kromatografi kolom vakum sama dengan kromatografi cair vakum.
Karena kromatografi cair vakum merupakan salah satu jenis dari kromatografi
kolom. Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran
larutan dengan perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan
kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian
senyawa.
Kromatografi

kolom

vakum/kromatografi

cair

vakum

merupakan

kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak
digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom
kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan
maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap
yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi.
Walaupun KKV/KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari pada
kromatografi lapis tipis (KLT), KKV/KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya.
Kromatografi cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh para
ilmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk
separasi menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini
adalah kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak

dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum. Kromatografi cair
vakum pada awalnya digunakan untuk separasi senyawaan steroid dan produkproduk natural dari laut. Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu corong
Buchner yang memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan fase diam
yang tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai dalam kromatografi
lapis

tipis

(70-230

mesh).

Corong Buchner yang

berisi fase

diam ini

digunakan dalam kondisi vakum/bertekanan, yang berakibat pada kemampuan

yang dihasilkan olehkromatografi cair vakum akan sama dengan kromatografi
gravitasi namundiperlukan waktu yang lebih singkat. Cara asli yang
diperkenalkan

oleh

Coll menggunakan

corong Buchner

kaca masir

atau kolom pendek, sedangkan Targett menggunakan kolom yang lebih panjang
untukmeningkatkan daya pisah.

Gambar 1. Kromatografi Kolom Vakum

2.

Prinsip Kromatografi Kolom Vakum

Prinsip kerja dari kromatografi kolom vakum adalah adsorpsi atau serapan,

sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan

dipisahkan terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan
yang berbeda-beda. Dimana mekanisme adsorpsinya yaitu mengadsorbsi ion-ion

dan molekul-molekul senyawa pada fase diam dan pemisahannnya berdasarkan

kelarutan senyawa dengan eluen yang digunakan.
3. Keuntungan dan Kerugian Kromatografi Kolom Vakum
Kromatografi kolom vakum mempunyai keuntungan:
1.

Mempunyai biaya ekonomis

2.

Adanya aliran fase gerak lebih cepat

3.

Pengerjaannnya sederhana

4.

Cuplikan yang dipisahkan lebih banyak

Kerugian kromatografi kolom vakum:

1. Membutuhkan waktu yang cukup lama

2. Sampel yang digunakan banyak jika dibandingkan dengan KLT dan
terbatas jika dibandingkan dengan kromatografi konvensional
4. Perbedaan Kromatografi Kolom Vakum dengan Kromatografi Kolom
Konvensional
Adapun perbedaan kromatografi kolom vakum dengan kromatografi
kolom konvensional yaitu:
1

Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase

gerak lebih lambat (10-100l/menit)

Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih

ideal jika digabung dengan spectrometer massa

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
missal sampel klinis

5. Pelarut
Pelarut yang digunakan dalam kromatografi cair vakum adalah pelarut yang
kepolarannya paling rendah sampai pelarut yang kepolarannya tinggi. Dimana
Elusi diawali dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolaran
ditingkatkan perlahan-lahan (polaritas meningkat) dengan harapan bahwa

komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan tingkat kepolarannya.

Oleh karena itu, Kromatografi Cair Vakum menggunakan tekanan yang rendah
untuk meningkatkan lajua aliran fase gerak. Kolom dihisap perlahan-lahan ke
dalam wadah penampung fraksi sampai kering dengan cara memvakumkannya.
Urutan pelarut yang digunakan adalah sebagai berikut:
Fraksi

Pelarut

Komposisi

Volume (ml)

Heksana

100

100

Heksana-etil asetat

50:50

100

Etil asetat

100

100

Etil asetat-metanol

75:25

100

Etil asetat-metanol

50:50

100

Etil asetat-metanol

25:75

100

Metanol

100

100

Atau digunakan urutan pelarut sebagai berikut :

Fraksi

Pelarut

Komposisi

Volume (ml)

Heksana

100

100

Heksana-etil asetat

80:20

100

Heksana-etil asetat

60:40

100

Heksana-etil asetat

40:60

100

Heksana-etil asetat

20:80

100

Etil asetat

100

100

Metanol

100

100

6. Jenis-jenis Kromatografi Kolom Vakum

Jenis-jenis kromatografi kolom vakum yaitu:
A. Suction Colomn
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan
absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan
dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen
kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.
B. Rapid-Sigel
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan
absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan

dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi

komponenkimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.
C. Press Colomn
Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerakdengan
cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara
yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan
peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi.

DAFTAR PUSTAKA
Day, R.A dan Underwood. 1981. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat.
Jakarta: Erlangga.
Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka
Pelajar: Yogyakarta.
Rahman, Abdul., dkk., 2008, Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar:
Yogyakarta.
Soebagio, dkk. 2002. Kimia Analitik II. Malang: FMIPA Universitas Negeri
Malang

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.

Penerbit ITB. Bandung.