METODE PENELITIAN

1. Bahan dan Alat Penelitian

a. Bahan
Asetaminophen standar BPFI, Tramadol HCl standar BPFI. Bahan pelarut
dan fase gerak (methanol, aquabidest) yang digunakan untuk analisis HPLC
digunakan bahan dengan mutu pro HPLC dari E. Merck selanjutnya bahan kimia
lain bila tidak disebutkan digunakan mutu dan produk yang sama.
Tablet yang mengandung asetaminophen 325 mg dan tramadol 37,5 mg
dibeli di apotik dengan nama: Ultracet (Janssen-cilag), Patral (Mahakam Beta
Farma), dan Acetram (Pharos). Sampel tablet untuk aplikasi penetapan kadar
asetaminophen dan tramadol HCl secara simultan diperoleh dalam periode bulan
Januari 2014.
b. Alat
HPLC dari Shimadzu type LC-10AD dengan kolom oktadesisilan (ODS 4,6
x 25 mm), membrane filter berukuran 0,45 m, ultrasonic, Neraca Analitik OHaus Adventurer (d = 0,0001), labu takar, serta alat alat gelas yang biasa
digunakan pada laboratorium kontrol kualitas.
2. Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas
Variabel bebas penelitian ini adalah kadar parasetamol dan tramadol HCl
dalam tablet.
b. Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah peak kromatogram
3. Prosedur Penelitian Optimasi
a. Pembuatan Larutan Baku Parasetamol (325 ppm)
Ditimbang 32,50 g standar Parasetamol secara akurat lalu dilarutkan dalam

fase gerak. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100,0 ml secara kuantitatif
dan ditambahkan fase gerak sampai garis tanda dan dikocok homogen, sehingga
didapatkan larutan parasetamol dengan konsentrasi 325 mg/ml dari Parasetamol.
b. Pembuatan Larutan Baku Tramadol HCl (37,5 ppm)
Ditimbang 3,75 g standar Tramadol HCl secara akurat lalu dilarutkan dalam
fase gerak. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100,0 ml secara kuantitatif
dan ditambahkan fase gerak sampai garis tanda dan dikocok homogen, sehingga
didapatkan larutan Tramadol HCl dengan konsentrasi 37,5 mg/ml dari Tramadol
HCl.
c. Penentuan Kurva Kalibrasi untuk Parasetamol dan Tramadol HCl
Dibuat larutan baku kerja dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl
dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan sebesar 195; 260; 325; 390; dan
455 ppm (60% sampai 140%) untuk Parasetamol serta 22,5; 30; 37,5; 45; dan 52,5
ppm (60% sampai 140%) untuk Tramadol HCl, masing masing ditambahkan
fase gerak dikocok 1 menit. Kemudian ditambahkan fase gerak sampai 10,0 ml
di labu ukur, lalu dikocok. Larutan tersebut dikromatografi selama 10 menit
menggunakan fase gerak dengan laju 1,0 ml/menit. Kurva kalibrasi dilakukan
dengan memplot daerah puncak vs konsentrasi untuk kedua obat tersebut.
d. Optimasi Kondisi Kromatografi
Fase diam C18 ODS Kolom (150 4.6mm); fase gerak: Metanol : Aquadest
(30:70 v / v) pada pH 3,4 diatur dengan asam o-fosfat; deteksi pada panjang
gelombang
228 nm; volume injeksi 10 l; suhu kolom pada suhu kamar; laju alir 1,0 ml/menit.
Parameter tes kesesuaian sistem meliputi resolusi, efisiensi kolom yang dilihat dari
angka plat teoritis dan faktor tailing sebagaimana tabel beriku
Tabel Data tes kesesuaian sistem
No. Parameter

Kesesuaian Sistem Spesifikasi

1. Resolusi (Rs)

> 1.5

2. Angka Plat Teoritis (N) Tidak kurang dari 2000

3. Faktor Tailing (TF)

Tidak lebih dari 2

4. Validasi Metode
a. Linearitas
Dibuat larutan Parasetamol dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan
sebesar 195 455 ppm dan untuk Tramadol HCl dengan konsentrasi akhir yang
diperhitungkan sebesar 22,5 52,5 ppm dengan ditambahkan fase gerak sampai
10,0 ml di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan tersebut
dikromatografi menggunakan HPLC dan dilihat kurva kalibrasi dari standar
Parasetamol dan Tramadol HCl.
b. Presisi
i Ripitabilitas
Dibuat larutan Parasetamol dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan
sebesar 325

ppm dan untuk Tramadol HCl dengan konsentrasi akhir yang

diperhitungkan sebesar 37,5 ppm dengan ditambahkan fase gerak sampai 10,0 ml
di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan tersebut
dikromatografi menggunakan HPLC dengan 3 kali pengulangan dan dihitung
kromatogram rata-rata dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl,
standar
deviasi (SD) dan koefisien variasi (KV). Presisi dikatakan memenuhi persyaratan
jika KV tidak lebih dari 2 % (KV < 2 %).
ii Presisi Antara
Dilakukan preparasi larutan Parasetamol dan Tramadol HCl yang sama
sebagaimana item i. Selanjutnya larutan tersebut dikromatografi menggunakan
HPLC pada satu hari yang sama di enam waktu yang berbeda dan dihitung

kromatogram rata-rata dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl,

standa
deviasi (SD) dan koefisien variasi (KV). Presisi dikatakan memenuhi persyaratan
jika KV tidak lebih dari 2 % (KV < 2 %).
iii Reprodusibilitas
Dilakukan preparasi larutan Parasetamol dan Tramadol HCl yang sama
sebagaimana item i. Selanjutnya larutan tersebut dikromatografi menggunakan
HPLC pada dua hari yang berbeda dalam satu minggu dengan analis berbeda,
instrument berbeda pada waktu yang berbeda dan dihitung kromatogram rata-rata
dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl, standar deviasi (SD) dan koefisien
variasi (KV). Presisi dikatakan memenuhi persyaratan jika KV tidak lebih dari 2
% (KV < 2 %).
c. Akurasi
Sejumlah 3 seri tablet yang telah digerus ditambahkan parasetamol dan
tramadol HCl pada masing-masing seri sebanyak 80%, 100% dan 120%. Masingmasing seri dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Kemudian ditambah fase gerak
sampai 10,0 ml di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya
larutan
dianalisis menggunakan HPLC dan dihitung % kadar perolehan kembali (%
Recovery) dari data kromatogram yang didapat.
d. Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ)
Dibuat larutan Parasetamol dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan
sebesar 162,5 ppm dan untuk Tramadol HCl dengan konsentrasi akhir yang
diperhitungkan sebesar 18,75 ppm dengan ditambahkan fase gerak sampai 10,0 ml
di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan tersebut
dikromatografi menggunakan HPLC dan dilihat kromatogram dari standar
Parasetamol dan Tramadol HCl. LOD dikatakan baik bila rasio signal/noise lebih

besar daripada 3 dan LOQ dikatakan baik bila rasio signal/noise lebih besar
daripada 10.