PEMBUATAN ANTIBODI POLIKLONAL

RABBIT ANTI-OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED

GLYCOPROTEIN (rabbit anti-ovPAG)
ABSTRAK
Tujuan dari penelitian ini adalah memproduksi antibodi poliklonal
menggunakan isolat yang telah dimurnikan pada kelinci New Zealand White
(n=12 ekor). Isolat dengan kandungan total protein berturut-turut 181; 171; 2,67;
44,33; 86 ng/l dan 0,9% NaCl Fisiologis (S; DT; DN8; DN16; DN32, dan K)
disuntikan secara subcutan pada bagian punggung kelinci. Sebelum
diimunisasikan isolat dicampur dengan adjuvant (Freuds Complete satu kali dan
Incomplete 2 kali sebagai Booster I dan II). Interval penyuntikan dua minggu dan
darah dikoleksi dalam tabung berisi antikoagulan setiap sebelum penyuntikan
isolat. Hasil penelitian menunjukan, DN32 memberikan respon imun yang baik
terhadap protein ovPAG yang terkandung dalam
isolat yang disuntikan
menggunakan teknik ELISA, diperoleh rabbit anti-ovPAG DN32. Determinasi
rabbit anti-ovPAG dilakukan dengan menguji kespesifikan anti-ovPAG
menggunakan metode Western Blot. Uji diferensiasi Rabbit anti-ovPAG DN32
terhadap ovPAG dalam urin domba , diperoleh pita protein yang jelas dengan
berat molekul 71 dan 31 kDa pada domba bunting sedangkan domba tidak
bunting hanya mempunyai satu pita dengan berat molekul 71 kDa. Kesimpulan
penelitian bahwa protein dengan berat molekul 31 kDa merupakan protein
penanda kebuntingan pada domba garut.
Kata kunci : ovPAG, kotiledon, Western Blot, Rabbit anti-ovPAG, ELISA
ABSTRACT
The aim of the study was to produce polyclonal antibody ( rabbit antiovPAG) which could detect PAG in the urine of pregnant ewes. Twelve rabbits
were immunized respectively against ovPG S, DT, DN8, DN 16, DN 32 and
NaCl 0,9% as a placebo. Briefly, 0.5 ml of isolate was emulsified in aqual volume
with Freuds adjuvant (Complete and Incomplete). Thereafter, the mixture was
injected at mutiple sites along the dorsal area of rabbits by subcutaneous route.
Rabbits received the same amount at 14 day intervals over period of 8 weeks.
Blood were collected from marginal ear vein, starting before first injection
(baseline), and every 14 days . Rabbit anti-ovPAG were measured using Modified
ELISA Technique, DN32 had the best immune response among others. Moreover,
rabbit anti-ovPAG DN32 also could differenciate ovPAG in the urine of pregnant
and non-pregnant ewes using Western Blot Technique,. There were two protein
bands had molecular weight at 71 and 31 kDa on pregnants urine whereas on the
non-pregnant urine only one band appeared at 71 kDa. It could be concluded that
protein of ovPAG at molecular weight at 31 kDa is a marker protein on garut
sheep and could be developed as a major protein for producing antisera.
Key words : ovPAG, cotyledon, Western Blot, Rabbit anti-ovPAG, ELISA

49

PENDAHULUAN
Deteksi kebuntingan dini menjadi penting pada ruminansia kecil karena
akan sangat membantu dalam peningkatan populasi dan pengurangan biaya
produksi. Pregnancy-associated glycoprotein merupakan agen yang berfungsi
sebagai penanda kebuntingan juga merupakan indikator kesehatan calon anak
(Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991; Klein et al. 2006).
Pregnancy-associated glygoprotein (PAG) merupakan famili aspartik
proteinase yang disekresikan oleh sel binukleat trofoblastik (Wooding 1992;
Pernyi et al. 2002; El Amiri et al. 2003; Hughes et al. 2003) dan molekulnya
tampak dalam lapisan sel epitel luar plasenta spesies hewan ungulata
(Green et al. 2000). Pregnancy-associated glygoprotein terdeteksi dalam darah
menggunakan metode radioimmuno assay (RIA) saat penempelan plasenta fetus
ketika sel binukleat trofoblastik mulai berpindah dan masuk ke dalam sel
endometrium membentuk sinsisium fetomaternal ( Ranilla et al. 1994;
Verberckmoes et al. 2004). Oleh sebab itu PAG merupakan indikator yang baik
untuk penanda kebuntingan juga kesehatan feto-plasental (Karen et al. 2003;
Boscos et al. 2003). Konsentrasi PAG terendah pada domba bunting adalah 2
ng/ml,

secara

signifikan

dicapai

pada

kebuntingan

hari

ke-25

(Verbeckmoes et al. 2004; Gonzalez et al. 2004).

Menurut Setiatin et al. (2009),

purifikasi kotiledon plasenta yang

dikoleksi pada saat melahirkan mempunyai protein dengan berat molekul 30,86
kDa dihitung berdasarkan migrasi relatif protein didalam monogel SDS-PAGE
(Stryer 1995; Devlin 2002). Pita protein ovPAG domba garut yang paling banyak
muncul mempunyai berat molekul 30.86 kDa,

lebih rendah dibanding

El Amiri et al. (2004) pada 55-65 kDa.

Beberapa isolat ovPAG yang diperoleh

pada saat pemurnian

dipergunakan untuk memproduksi antibodi poliklonal (Ayad et al. 2007), dengan

menyuntikannya pada kelinci. Pemanfaatan kelinci New Zealand White (NZW)
sebagai hewan coba telah mendapat persetujuan dari Komisi Pengawasan dan
Kesejahteraan
INDOANILAB

dan

Penggunaan

No.:03-IA-ACUC

Hewan
2008,

Percobaan
Tanggal

15

(KPK-PHP)
Nopember

PT
2008

50

(Lampiran 1).

Antibodi poliklonal dipergunakan untuk mendeteksi ikatan PAG

dalam material biologis (Green et al. 2005). Dengan demikian dimungkinkan

untuk memanfaatkannya sebagai agen yang dapat mendeteksi keberadaan PAG
dalam urin. Determinasi Rabbit anti-ovPAG dilakukan menggunakan monogel
SDS-PAGE yang dilanjutkan dengan metode Western Blot untuk menguji
keberadaan antibodi poliklonal yang terkandung dalam plasma darah kelinci
(Barbato et al. 2008; Bella et al. 2009) sedangkan konsentrasinya diukur dengan
teknik ELISA termodifikasi (Gambar 19).

51
1

Koleksi darah

Antibodi Baseline

Isolat + FCA
Antibodi Primer

Isolat + FICA I
Antibodi Booster I

Isolat + FICA II
Antibodi Booster II

Rabbit anti-ovPAG
ELISA

Respon Imun

Western Blot

Determinasi Antibodi Ab(+) & Ab (-)

Diferensiasi ovPAG dalam urin domba

Bunting

Tidak Bunting

Gambar 19 Alur kerangka pemikiran penelitian pembuatan antibodi poliklonal rabbit anti-ovine pregnancy-associated glycoprotein
(rabbit anti-ovPAG)
1. Penyuntikan ke-1; 2. Penyuntikan ke-2 atau Booster I; 3. Penyuntikan ke-3 atau Booster II ; FCA=Freuds Complete Adjuvant ;
FICA=Freuds Incomplete Adjuvant

52

METODE PENELITIAN
Pembuatan Antibodi Poliklonal
Kelinci strain NZW dengan bobot rata-rata 3 kg, sejumlah 12 ekor dibagi
menjadi 6 kelompok masing-masing dengan 2 ulangan tanpa ada perbedaan jenis
kelamin. Pakan yang diberikan berupa pelet dan wortel sedangkan multivitamin
diberikan sebelum perlakuan dan diulangi setiap selesai imunisasi.
Isolat ovPAG (S,DT, DN8, DN16, DN32) yang diperoleh dari purifikasi
ekstrak kotiledon plasenta dalam kolom Sephadex-G75 dan

DEAE-cellulose

(Tabel 2). Freuds complete adjuvant (Sigma) dan Freuds Incomplete adjuvant
(Sigma) diperlukan sebagai larutan pengikat (adjuvant) ovPAG yang akan
diimunisasikan pada kelinci (Goldsby et al. 2000; Erb & Hau 1994;
Hendriksen & Hau 2003).
Tabel 2 Isolat ovPAG dan konsentrasinya yang diimunisasikan pada kelinci New
Zealand White
Isolat ovPAG

Jumlah (ekor)

Konsentrasi (ng/l)

Sephadex-G75 (S1 & S2)

181.00

DEAE-Tris HCl 0,01 M (DT.1 & DT.2

171.00

DEAE-NaCl 80 mM (DN8.1 &DN8.2)

2.67

DEAE-NaCl 160 mM (DN16.1 & DN16.2)

44.33

DEAE-NaCl 320 mM (DN32.1 &DN32.2)

86.00

Kontrol (K1 & K2)

Isolat diimunisasikan pada bawah kulit atau subkutan bagian punggung

kelinci NZW (Gambar 19). Imunisasi pertama dilakukan dengan menyuntikan
campuran 0.5 ml isolat ditambah 0.5 ml Freuds complete adjuvant atau FCA
(Sigma). Booster pertama dilakukan dengan menyuntikan campuran 0.5 ml
isolat ditambah 0.5 mL dan Freuds Incomplete adjuvant atau FICA (Sigma)
Booster kedua dilakukan dua minggu setelah booster pertama dengan
menyuntikan campuran dengan komposisi yang sama dengan booster pertama.

53

Darah dari vena maupun arteri telinga (Vena dan Arteri auricularis) ditampung
kedalam tabung yang telah berisi antikoagulan, setiap dua minggu sekali dengan
volume maksimum 20% bobot kelinci (Ayad et al. 2007).
Darah (Baseline; FCA; FICA I dan II) disentrifus pada kecepatan 2 500
rpm selama 15 menit untuk dipisahkan plasma darahnya kemudian ditempatkan
dalam tabung, disimpan pada suhu 20oC sampai seluruh plasma terkumpul.
Setelah semua plasma darah tekumpul, respon imun kelinci terhadap ovPAG yang
diimunisasikan, diukur dengan melihat kerapatan optik menggunakan teknik
ELISA termodifikasi yang diukur pada panjang gelombang 450 nm.
Pemanfaatan Teknik ELISA Termodifikasi untuk Mengukur Konsentrasi
Rabbit anti-ovPAG
Prinsip utamanya adalah mengukur konsentrasi antigen berdasarkan
antigen yang dapat ditangkap oleh antibodi (capture antigen) dengan
menggunakan antibodi yang tidak dilabel oleh enzim (Crowther

2001;

Green et al. 2005; Silva et al. 2007).

Antigen ovPAG hasil isolasi

yaitu S, DT, DN8, DN16 dan DN32

ditambah bufer kabonat-bikarbonat (coating-buffer) dengan perbandingan 1:10

dimasukkan pada masing-masing sumuran sebanyak 100 l, kemudian diinkubasi
pada 4oC semalam. Keesokan harinya, dicuci menggunakan PBS Tween 0.1 %
sebanyak 4 kali. Larutan penghambat (Blotto 5%) merupakan campuran 5 gr susu
skim dengan PBS 0,1%. Setiap sumuran diisi 300 l

blotto 5%

kemudian

diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit (Silva et al. 2007). Setelah 60 menit,
blotto dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali.
Rabbit anti-ovPAG diencerkan dalam blotto 5% (1 : 50)

kemudian pada

masing-masing sumuran diisi 100 l, kemudian diinkubasi pada suhu kamar

selama 90 menit. Selanjutnya lempeng ELISA, dicuci sebanyak 4 kali
menggunakan larutan pencuci yang sama. Setiap sumuran diisi campuran Goat
anti-rabbit IgG peroxidase (Sigma) dalam blotto 5% (1:2000) sebanyak 100 l,
diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Lempeng ELISA dicuci
menggunakan PBS Tween 0.1% sebanyak 4 kali.

54

Langkah selanjutnya, setiap sumuran ditambah 100 l TMB atau 3,3,5,5

tetra methyl benzidine dihydrochloride (Sigma) kemudian diinkubasi selama 20
menit pada suhu kamar (warna biru). Reaksi dihentikan dengan menambahkan
larutan 2N H2SO4 sebanyak 50 l pada setiap sumuran. Perubahan warna biru
menjadi kuning, menunjukan reaksi telah berakhir, selanjutnya kerapatan optik
dibaca menggunakan Microplate Reader Model 3550 (Biorad) pada panjang
gelombang 450 nm (Crowther 2001; Chow et al. 2003).

Determinasi Rabbit anti-ovPAG menggunakan Metode Western Blot

Determinasi dilakukan untuk mengevaluasi reaksi antara ovPAG yang
terdapat dalam ekstrak kotiledon plasenta dan urin domba garut bunting maupun
tidak bunting terhadap rabbit anti-ovPAG yang diproduksi dalam kelinci sebagai
antibodi poliklonal. Urin domba ditampung pagi hari dan dibuat alliquot untuk
dapat dipergunakan juga saat mengukur konsentrasinya.
Langkah awal untuk memulai teknik ini perlu dibuat monogel SDS-PAGE,
Selanjutnya ovPAG dialirkan ke dalam gel yang dengan adanya elektrode yang
mengalir di dalam running buffer protein bermigrasi dan berhenti sesuai dengan
berat molekulnya. Kemudian gel ditransfer ke dalam membran nitroselulose
(Barbato et al. 2008; Bella et al. 2009; Majewska et al. 2005; Huebner 2004).
Transfer ovPAG ke dalam membran nitroseluse dilakukan dengan cara
memisahkan gel dari kaca kemudian dimasukkan kedalam transfer bufer. Posisi
kertas nitroselulose berada di atas gel sedangkan diantara membran nitroselulose
dan gel ditambahkan kertas saring yang basah. Selanjutnya gel,

membran

nitroselulose dan kertas saring dimasukkan ke dalam kaset transfer yang telah
ditambah spon di kedua sisinya.

Setelah itu kaset transfer dicelupkan

dalam

transfer bufer pada 100 volt selama 60 menit . Membran nitroselulose diletakkan
dalam cawan petri,dan direndam dalam larutan blotto 5% selama 1 jam
(Goldsby et al. 2000; Huebner 2004).
Blotto diaspirasi dan selanjutnya dicuci dengan menambahkan PBS Tween
0.1 % , pencucian dilakukan sebanyak empat kali. Kemudian rabbit anti-ovPAG
ditambahkan ke dalam cawan petri dengan perbandingan rabbit anti-ovPAG dan

55

blotto 5% masing-masing 1 : 50, diinkubasi semalam. Keesokan harinya sampel

dicuci dengan PBS Tween 0.1 % sebanyak 3 kali dengan interval 5 menit.
Konjugat -Rabbit Alkaline Phosphatase diencerkan dalam blotto 5% dengan
perbandingan 1: 5 000, selanjutnya diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC.
Membran nitroselulose dicuci kembali dengan PBS Tween 0.1 % sebanyak 3 kali
dengan interval 5 menit, selanjutnya ditambahkan substrat berisi campuran 5bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate

disodium

salt

(BICP)

dengan

nitrotetrazolium blue chlorine-98% (NBT), inkubasi 20 menit kemudian dicuci

dengan dH2O.

Analisis Data
Data respon imun, pemilihan antibodi, dan determinasi rabbit anti-ovPAG
dianalisis secara deskriptif. Respon imun dianalisis

dengan mengukur

peningkatan nilai kerapatan optik terhadap rabbit anti-ovPAG (B; FCA; FICA1,
dan FICA2) yang dihasilkan. Antibodi yang dipergunakan untuk ELISA
ditentukan berdasarkan data respon imun dan konsentrasi total proteinnya,
Selanjutnya, determinasi rabbit anti-ovPAG positif dan negatif terhadap ovPAG
terhadap dalam K; DN32; DN16; DN8; DT, dan S maupun urin bunting dan tidak
bunting dianalisis berdasarkan estimasi berat molekul yang muncul pada pita
protein.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini menggunakan kelinci produsen anti-ovPAG karena memiliki
tingkat kekerabatan yang jauh dengan domba, mudah ditangani serta mudah
dipelihara.

Selain itu, persyaratan lain yang harus dipenuhi, kelinci tersebut

belum pernah mendapat paparan ovPAG. Antigen atau imunogen dalam hal ini
ekstrak ovPAG merupakan substansi yang mempunyai kemampuan untuk
menghasilkan respon imun yang spesifik. Ada beberapa persyaratan agar isolat
ovPAG dapat dipergunakan sebagai imunogen adalah dikenali sebagai benda
asing, mempunyai berat molekul yang besar, mempunyai struktur kimia yang

56

kompleks, dosis penyuntikan, rute penyuntikan dan waktu penyuntikan serta

mempunyai epitop yang dapat dikenali oleh antibodi. Ovine PregnancyAssociated Glycoprotein domba garut

memiliki beberapa kriteria sebagai

imunogen yaitu mempunyai tingkat kekerabatan yang jauh dengan kelinci,

memiliki berat molekul antara 30,7 78 kDa, serta belum pernah diimunisasikan
pada kelinci yang digunakan sebagai produsen antibodi (Setiatin et al. 2009).
Antigen baru akan dikenali oleh limfosit B maupun T apabila epitopnya
dikenali. Epitop merupakan sisi aktif antigen yang dapat berikatan dengan
reseptor sel B maupun T. Respon imun yang dihasilkan bergantung dari dosis dan
rute penyuntikan antigen atau imunogen.

Campuran antibodi yang dapat

mengenali beberapa epitop pada antigen yang sama disebut antibodi poliklonal.
(Goldsby et al. 2000; Abbas et al. 2007).
Kekuatan interaksi antigen dan antibodi bergantung seberapa dekat
kecocokan antara antigen dan antibodi. Total kekuatan interaksi nonkovalen
antara tempat terikatnya antigen (single antigen) terhadap epitop tersebut.
Semakin tinggi afinitas antibodi, kemampuan antibodi untuk mengikat semakin
kuat dan ikatannya bertahan lama semakin rendah afinitas ikatan antibodi dan
epitop makin lemah dan ikatannya mudah lepas. Reaksi silang (cross-reactivity)
terjadi apabila ada dua antigen yang memiliki epitop yang identik atau antibodi
yang spesifik untuk satu epitop juga mengikat epitop lain yang tidak berhubungan
tetapi memiliki sifat kimia yang sama (Huebner 2004).

Pengukuran Konsentrasi Rabbit anti-ovPAG

Reaksi ELISA berakhir setelah penambahan 2N H2SO4 ke dalam setiap
sumuran yang ditandai dengan terjadinya perubahan warna dari biru menjadi
kuning. Gradasi warna yang muncul berkaitan erat dengan banyaknya antigen
(ovPAG) dalam sampel yang diikat oleh rabbit-ovPAG.
Respon imun kelinci (6 perlakuan; 2 ulangan) pada percobaan memberikan
hasil yang beragam sehingga perlu dilakukan seleksi terhadap antibodi yang akan
diujikan kespesifikannya (Gambar 20). Sebanyak 11 ekor kelinci memberikan
respon yang baik kecuali DN 8.1, setelah dilakukan pengukuran kerapatan

57

optiknya menggunakan teknik ELISA Termodifikasi. Titer awal menunjukan

kerapatan optik sebelum ada pengaruh imunogen atau ovPAG ditentukan sebagai
titer baseline. Penambahan adjuvant kedalam isolat yang disuntikan berfungsi
untuk meningkatkan imunogenitas isolat. Adanya Mycobacterium sp dalam
Freuds Complete Adjuvant (Sigma ) pada imunisasi pertama akan menstimulir
sel B maupun T untuk membentuk respon imun (Cruse & Lewis 2002).
Respon imun primer

sel B teraktivasi untuk berproliferasi dan

berdiferensiasi di dalam sel sekresi antibodi dan sel memori. Sebagian sel
antibodi, migrasi dan bertahan di sumsum tulang dalam periode yang panjang.
Imunisasi kedua (Booster I) dan ketiga (Booster II) akan menghasilkan respon
imun sekunder yang konsentrasinya lebih tinggi dari imunisasi pertama. Hal ini
terjadi karena memori sel B diaktivasi untuk memproduksi antibodi dalam jumlah
banyak yang kerjanya distimulir oleh sel T ( Goldsby et al. 2000; Abbas et al.
2007).
Berdasarkan grafik kerapatan optik rabbit anti- ovPAG , ada sembilan ekor
yang dapat dipergunakan sebagai sumber antibodi yaitu S1,S2,

DT1, DT2,

DN8.2, DN16.1, 16.2, DN32.1 dan 32.2. Anti-ovPAG DN8.1 tidak dipergunakan
pada uji selanjutnya karena telah menunjukan kerapatan optik yang tinggi dalam
plasma darah baseline. Tingginya titer antibodi dapat terjadi karena kelinci yang
dipergunakan kemungkinan pernah terpapar oleh protein yang mempunyai
spesisitas seperti isolat DN8.1. Oleh sebab itu, memori sel B akan langsung
memproduksi antibodi terhadap imunogen yang disuntikan.

Sedangkan

rendahnya kerapatan optik pada kelompok kontrol, merupakan hasil yang sangat
penting karena kelinci tidak memberikan respon imun terhadap NaCl 0.9% dan
baru memberikan respon positif terhadap penyuntikan isolat yang di dalamnya
mengandung ovPAG.

58

Gambar 20 Respon imun poliklonal antibodi rabbit anti-ovPAG terhadap berbagai sumber isolat ovine pregnancy-associated
glycoprotein (ovPAG)
B=Baseline; FCA=Freuds Complete Adjuvant ; FICA=Freuds Incomplete Adjuvant

59

DN16

DN32

Konsentrasi ovPAG :
DN16 = 44,33 ng/ml
DN32 = 86,00 ng/ml

Gambar 21 Perbandingan Potensi DN16 dan DN32 sebagai sumber Rabbit Anti-ovPAG
Keterangan : A= berat molekul (Setiatin et al. 2009)
B = respon imun
C = Konsentrasi

Rabbit anti-ovPAG yang paling memenuhi syarat untuk dipergunakan

sumber antibodi adalah DN16 dan DN32. Akan tetapi setelah dikaji terhadap
potensi yang dimilikinya maka rabbit anti-ovPAG DN32 yang akan dipergunakan
untuk uji selanjutnya karena memiliki beberapa kelebihan dibanding DN16
(Gambar 21). Pertama, berdasarkan pita protein yang terbentuk pada monogel
SDS-PAGE, DN32 mempunyai intensitas yang lebih tebal yang mengindikasikan
bahwa kandungan proteinnya lebih tinggi. Kedua, berdasarkan respon imun yang
dimiliki

DN32

memberikan

respon

yang

lebih

baik

serta

60

ditunjang oleh faktor yang ketiga yaitu DN32 memiliki konsentrasi total protein
86 ng/ml dibanding DN16 sebesar 44,33 ng/ml.

Determinasi Rabbit -ovPAG

Determinasi keberadaan Rabbit anti-ovPAG terhadap berbagai sumber
ovPAG yang telah tersusun pada membran nitroselulose berdasarkan berat
molekulnya perlu dilakukan untuk mengevaluasi keberhasilan imunisasi. Blotto
5% berfungsi sebagai larutan untuk menghambat agar pori membran yang tidak
mengikat protein ovPAG tidak berikatan dengan protein lain agar reaksi yang
diperoleh menjadi spesifik. Enzim terkonjugasi (Huebner 2004) dalam Konjugat
anti-Rabbit Alkaline Phosphatase memiliki ikatan enzim yang berfungsi untuk
melisiskan molekul yang mempunyai ikatan fosfat. Agar fosfat yang terurai oleh
enzim dapat dibaca, maka ditambahkan substrat BICP + NBT pada membran
nitroselulose. Pita protein yang muncul merupakan hasil reaksi yang spesifik
antara enzim dengan protein rabbit anti-ovPAG yang menunjukan adanya reaksi
rabbit anti-ovPAG terhadap ovPAG yang ada dalam sampel yang diuji
(Gambar 22).

71

71

62

71
62
53

34

34

31

14

14

14

Gambar 22 Determinasi rabbit anti-ovPAG DN32 negatif (Ab -) maupun positif (Ab +)
terhadap berbagai sumber ovPAG (K; DN32; DN16; DN8; DT; S)

61

Rabbit anti-ovPAG Negatif adalah antibodi yang diperoleh dari plasma

darah sebelum kelinci disuntik ovPAG atau disebut juga Baseline (Gambar 22).
Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 Negatif terhadap protein ovPAG pada K
tidak terbentuk pita protein. Kelompok ini juga memberikan respon imun yang
rendah berarti kelinci K tidak memberikan respon imun terhadap NaCl 0.9%.
Isolat DN32 dan DN16 hanya memiliki satu pita protein pada berat molekul
71 kDa sedangkan DN8 tidak mempunyai pita protein meskipun memberikan
respon imun yang cukup tinggi, kemungkinan pada DN8 tidak ada epitop yang
dikenali oleh antibodi DN32 negatif. Isolat DT memiliki dua pita protein pada 31
dan 14 kDa sementara S memiliki lima pita protein pada 71; 34, dan 14 kDa.
Agar dapat dianalisis lebih lanjut, perlu dilakukan uji konfirmasi

Rabbit

anti-ovPAG DN32 positif . Hasilnya menunjukan bahwa semua isolat ovPAG

mempunyai pita protein pada berat molekul 71 kDa dengan intensitas yang
berbeda-beda. Hal ini dapat terjadi apabila dua antigen yang memiliki dua epitop
yang sama tetapi tidak identik sehingga salah satu epitop akan mengikat lebih
kuat daripada epitop lainnya (Huebner 2004). Isolat DN32 dan DN16 memiliki
dua pita protein dengan berat molekul yang sama pada 71 dan 62 kDa tetapi
DN32 masih mempunyai pita protein lain pada 14 kDa.

Isolat ovPAG S

mempunyai lima pita protein sekitar 71; 62; 53; 34, dan 14 kDa (Gambar 22).
Berdasarkan uji konfirmasi Rabbit -ovPAG DN32 negatif maupun positif,
terdapat reaksi silang terhadap isolat lain yang terpapar dengan rabbit anti-ovPAG
DN32. Protein dari DT maupun S saat dilakukan uji konfirmasi terhadap antiovPAG DN32 negatif maupun positif membentuk pita protein yang jelas berarti
banyak terjadi reaksi silang terhadap protein yang dimiliki oleh kedua isolat
sehingga DT dan S tidak dipergunakan sebagai sumber rabbit anti-ovPAG.
Antibodi DN8 juga tidak dipergunakan karena pada saat uji antibodi negatif
maupun positif memberikan hasil yang jelas yaitu hanya memiliki satu pita pada
71 kDa yang merupakan protein umum dari kelinci. Protein pada berat molekul 71
kDa merupakan protein umum yang dimiliki oleh kelinci sehingga bereaksi
terhadap semua antibodi Rabbit -ovPAG DN32 negatif maupun positif.

62

kDa

71

31

P1

P2

P3

N1

N2

N3

P1

P2

P3

N1

N2

Gambar 23 Determinasi rabbit anti-ovPAG DN32 negatif dan positif terhadap

ovPAG dalam urin domba garut bunting dan tidak bunting.
P=bunting, N=tidak bunting

Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 dilanjutkan dengan uji diferensiasi

terhadap ovPAG dalam urin domba garut bunting dan tidak bunting. Pengujian
menggunakan Ab- DN32 menunjukan tidak adanya ikatan anti-ovPAG dengan
ovPAG dalam urin domba bunting (P1-3) maupun tidak bunting (N1-3). Akan
tetapi pada saat Ab+ DN32 direaksikan dengan ovPAG dalam urin domba baik
dalam kondisi bunting maupun tidak bunting, memberikan hasil yang lebih jelas.
Pita protein pada 71 kDa terdapat pada urin domba bunting (2 bulan) maupun
tidak bunting dengan intensitas yang berbeda. Perbedaan yang mendasar adalah
pada urin domba bunting ditemukan pita protein pada 31 kDa sedangkan pada
urin domba tidak bunting, pita protein tersebut tidak muncul (Gambar 23). Hasil
ini menunjukan bahwa kemungkian besar penanda kebuntingan pada domba garut
terpapar pada protein dengan berat molekul 31 kDa. Hasil ini hampir sama
dengan hasil isolasi pada kotiledon plasenta domba garut yang memiliki protein
dengan berat molekul 30,86 kDa (Setiatin et al. 2009).
Adanya ikatan spesifik antara Rabbit anti-ovPAG DN32 terhadap ovPAG
dalam urin yang dapat membedakan status kebuntingan domba garut
menunjukkan bahwa produksi antibodi polilonal Rabbit anti-ovPAG berhasil.

N3

63

Dengan demikian dimungkinkan untuk dilakukan eksplorasi lebih lanjut terhadap

pengembangan metode deteksi kebuntingan dini menggunakan teknik Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) termodifikasi agar lebih aplikatif di
lapangan.

KESIMPULAN
Rabbit anti-ovPAG DN32 dipergunakan sebagai sumber Rabbit antiovPAG yang paling spesifik dibandingkan dengan yang lainnya. Protein dengan
berat molekul 31 kDa merupakan protein penanda kebuntingan pada domba
garut.

DAFTAR PUSTAKA
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. 2007. Cellular and Mollecular Immunlogy. Ed
ke-6. Philadelphia : Elsevier Inc. hlm 3 17; 123-142.
Ayad A, Sousa NM, Sulon J, Iguer-Ouada M, Beckers JF. 2007. Comparison of
five radioimmunoassay systems for PAG mesurement : Ability to detect
early pregnancy in cow. Reprod Dom Anim 42(4):433-440.
Barbato O et al. 2008. Isolation of pregnancy-associated glycoproteins (PAG)
from water buffalo (Bubalus bubalis) placenta by use of Vicia villosa
bound agarose affinity chromatography. Res Vet Sci 85(3):457-466.
Bella A, Sousa NM, Dehimi M, Watts J, Beckers JF. 2009. Western analyses of
Pregnancy-Associaed Glycoprotein Family (PAG) in Placental Extracts of
Various Mammals. Theriogenology, Volume 68 (7) : 1055-1066.
Boscos CM, Samartzi FC, Lymberopoulos AG, Stefanakis A, Belibasaki S. 2003.
Assessment of progesterone concentration using enzymeimmunoassay for
early pregnancy diagnosis in sheep and goats. Reprod Dom Anim 38(3):
Chow YA et al. 2003. Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick
ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion.
J Agric Food Chem 51 : 7854-7860.
Crowther JR. 2001. The ELISA Guidebook. New Jersey : Humana Press. hlm 182.
Cruse JM, Lewis RE. 2002. Illustrated Dictionary of Immunology. Ed ke-2. New
York : CRC Press.
Devlin TM. 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation. New York
: Wiley-Liss.

64

El Amiri B et al. 2003. Isolation and partial characterization of three pregnancyassociated glycoproteins from the ewe placenta. Mol Reprod Dev 64 : 199206.
El Amiri B , Remy B , Sousa NM, Beckers JF. 2004. Isolation and
characterization of eight pregnancy-associated glycoproteins present at
high levels in the ovine placenta between day 60 and day 100 of gestation.
Reprod Nutr Dev 44:169-181.
Erb K, Hau J. 1994. Monoclonal and Polyclonal Antibodies. Di dalam : Svendsen
P, Hau J, editor. Handbook of Laboratory Animal Science. Vol-1. Boca
Raton, Florida : CRC Press. hlm 293-309.
Green JA et al. 2000. Pregnancy-associated bovine and ovine glycoproteins
exhibits spatially and temporally distinct expression patterns during
pregnancy. Biol Reprod 62:1624-1631.
Green JA et al. 2005. The establishment of an ELISA for the detection of
pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) in the serum of pregnant cows
and heifers. Theriogenology 63(5):1481-1503.
Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. 2000. Kuby Immunology. Ed ke-4. New
York : WH Freeman & Co. hlm 63-172.
Gonzlez F et al. 2004. A comparison of diagnosis of pregnancy in the goat via
transrectal ultrasound scanning, progesterone, and pregnancy-associted
glycoprotein assays. Theriogenology 62:1108-1115.
Hendricksen C, Hau J. 2003. Production of Polyclonal and Monoclonal
Antibodies. Didalam: Hau J, van Hoosier GL, editor. Handbook of
Laboratory Animal Science : Essential Principles and Practices. Volume
1. Ed ke-2. Boca Raton, Florida : CRC Press. hlm 391-411.
Huebner J. 2004. Antibody-antigen interactions and measurements of
immunologic reactions. Di dalam : Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM,
editor. Immunology, infection, and immunity. Washington, DC : ASM
Press. hlm 207-232.
Hughes AL, Green JA, Piontkivska H, Roberts. 2003. Aspartic proteinase
phylogeny and the origin of pregnancy-associated glycoproteins. Mol Biol
Evol 20(11) : 1940 1945.
Karen A et al. 2003. Evaluation of false transrectal ultrasonographic pregnancy
diagnoses in sheep by measuring the plasma level of pregnancy-ssociated
glycoproteins. Reprod Nutr Dev 43:577-586.
Klein C et al. 2006. Monozygotic twin model reveals novel embryo-induced
transcriptome changes of bovine endometrium in the preattachment period.
Biol Reprod 74: 253-264.
Majewska M, Panasiewicz G, Dabrowski M, Gizejewski Z, Beckers JF,
Szafranska B. 2005. Multiple forms of Pregnancy-Associated
Glycoproteins released in vitro by porcine chorion or placentomal and
interplacentomal explants of wild and domestic ruminants. Biol Reprod.
5(2):185-203.

65

Pernyi Z et al. 2002. Aspartic proteinase members secreted by the ruminant

placenta: Specificity of three radioimmunoassay system for the
measurement of pregnancy-associated glycoprotein. Reprod Dom Anim
37:324-329.
Ranilla MJ, Sulon J,Mantecn MD, Beckers JF. 1994. Plasmatic profiles of
pregnancy-associated glycoprotein and progesterone levels during
gestation in churra and merino sheep. Theriogenology : 537-545.
Setiatin ET , Sajuthi D, Purwantara B, Talib C. 2009. Ekstraksi dan isolasi ovine

pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotildon plasenta domba

garut sesaat setelah melahirkan. JITV 14(3) : 208 -215.
Silva E et al. 2007. Accuracy of a pregnancy-associated glycoprotein ELISA to
determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-seven days after
timed artificial insemination. J Dairy Sci 90:4612-4622.
Stryer, L. 1995. Biochemistry. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 875
910.
Verbeckmoes S et al. 2004. A new test for early pregnancy diagnosis in sheep:
Determination of ovine pregnancy associated glycoprotein (ovPAG)
concentration by means of a homologous radioimmunoassay Vlaams
Diergeneeskundig Tijdschrift 73:119-127.
Wodzicka-Tomaszewka M, Sutama IK, Putu IG, Chaniago TD. 1991. Reproduksi,
Tingkahlaku, dan Produksi Ternak di Indonesia. Jakarta : Penerbit PT
Gramedia Pustaka Utama.
Wooding FBP. 1992. Current topic: the synepitheliochorial placenta of ruminants:
binucleate cell fusions and hormone production. Placenta 13:101-113.
Zoli AP et al. 1991. Purification and characterization of a bovine pregnancyassociated glycoprotein. Biol Reprod 45:1-10.