BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi adalah dengan cara metode
pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya
yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan
(Dwidjoseputro, 1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan
mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan praktikum kali ini unutk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan sederhana, pengenceran
negative, maupun pengenceran gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme (Sutedjo,
1991).
1.2 Tujuan Percobaan

Mengetahui macam-macam metode pewarnaan.

Dapat membedakan bakteri gram positif dan negative dengan metode pewarnaan.
Mengetahui macam-macam zat warna yang digunakan dalam pewarnaan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa yaitu
dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung,menggunakan
kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar
dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan
mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk
mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel
dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi
(Dwijoseputro, 2005).
Macam macam pewarnaan
A. Pewarnaan negatif
Pada pewarnaan ini merupakan pewarnaan tidak langsung karena yang di warnai adalah
latar belakangnya, sedangkan bakerinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Zat warna yang di
gunakan adalah nigrosin.
B. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat warna yang tunggal
bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel bakteri. Pada pewarnaan ini zat warna yang
kami gunakan adalah gentiana violet.
C. Pewarnaan gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan yodium,
larutan akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau
air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam
positif akan memprtahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal
violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat

pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar, 2007).
Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu
proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop
sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri .Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metal ungu pada
metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna ungu gelap setelah
di cuci dengan alkohol.
Sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu pewarnaan
penimbal (conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gramnegatif menjadi berwarna merah atau merah muda.

Pengujian ini berguna untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies
organisme inang, sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding
sel gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida (Pelczar, 2007).
D. Pewaranaan spora/ flagel
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang sama sepertti kristal
amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu
fase di mana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor
luar yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh
dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies
basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh
dan bereproduksi selama banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan
di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang
di maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini tergantung oleh
spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel
induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya tidaklah sama bagai semua
spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang dibentuk ditengah-tengah sel, yang
kedua adalah terminal yang dibentuk diujung, ketiga yaitu subterminal yang dibentuk di dekat
ujung. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan zat-zat
yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainya

merugikan tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu
oleh faktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium
yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk membentuk sporaspora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air
meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya
keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah
spora. Hal ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di
tengah-tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung
bakteri (Pelczar, 2001).
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:
1. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel
bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein menjadi
gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah
avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan bahan kimia.
2. Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada bayangan
mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan
warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.
3. Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa tertentu.
Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat
akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat
dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.
4. Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat kimia
yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat warna terikat
lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan
basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan
basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan

Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna
mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan warna pada sel-sel yang berbeda
warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan
dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama
(Sutedjo, 1991).

BAB III
METODE KERJA
3.1 Waktu dan tempat
Praktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan di laksanakan pada hari Rabu 06 April 2011
pukul 10.00-12.00 WITA. Bertempat di laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda .
3.2 Alat dan bahan
3.2.1Alat-alat
- Lampu bunsen
- Pipel
- Objek glass (kaca presparat dan penutup)
- Tabung reaksi
- Jarum oase
- Mikroskop
- Kipas angin
- Kaca tipis
- Spatula
- Gunting
- Spritus
- Kertas saring
- Pinset
- Cover glass
- Pensil
- Kertas
3.2.2 Bahan- bahan
- Aquades
- Alkohol 95 % + 70 %
- Biakan murni satu jenis bakteri
- Zat warna Kristal violet
- Nigrosin
- Larutan logols

Malachite green
Tissue
Crystal violet
Safranin
Methylen
Media Na
Nigrap
Tinta cina
3.3 Cara kerja
3.3.1 Pewarnaan sederhana

1. Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%

2. Dikeringkan (dilap) dengan tissue
3. Difiksasi diatas lampu bunsen
4. Ditetesi akuades
5. Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat
6. Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose
7. Difiksasi diatas lampu bunsen, setelah kering, ditetesi larutan crystal violet, biarkan 1-2 menit
8. Cuci dengan air mengalir sampai zat warnanya hilang
9. Keringkan kaca preparat
10. Amati dengan mikroskop, dan catat hasilnya
3.3.2 Pewarnaan negatif
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%

Dikeringkan (dilap) dengan tissue
Difiksasi diatas lampu bunsen
Ditetesi akuades
Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat
Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose
Diambil larutan nigrosin (tinta cina)
Keringkan (anginkan) kaca preparat
Amati dibawah mikroskop dan catat hasilnya
3.3.3 Pewarnaan gram

1. Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%

2. Dikeringkan (dilap) dengan tissue
3. Difiksasi diatas lampu bunsen
4. Ditetesi akuades
5. Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat
6. Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose
7. Keringkan dan fiksasi diatas lampu bunsen
8. Setelah kering, teteskan zat warna crystal violet sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit
9. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
10. Teteskan lagi dengan larutan lugol, dan biarkan selama 1 menit, lalu cuci dengan air mengalir,
dan keringkan.

11. Cuci lagi dengan alkohol 70% selam 30 detik

12. Cuci dan keringkan
13. Berikan larutan basil fuchsin atau safrina selama 2 menit
14. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
15. Amati dengan mikroskop dan catat hasilnya
3.3.4 Pewarnaan spora
1. Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%
2. Dikeringkan (dilap) dengan tissue
3. Difiksasi diatas lampu bunsen
4. Ditetesi akuades
5. Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat
6. Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose
7. Tutup koloni tersebut dengan menggunakan kertas saring
8. Teteskan 2-3 tetes malachite green
9. Difiksasi diatas lampu bunsen
10. Diamkan selama 1 menit, setelah itu lepas kertas saring
11. Bilas dengan akuades selama 30 detik
12. Teteskan safranin selama 30 detik
13. Keringkan
14. Amati dengan mikroskop dan catat hasil

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1

Hasil pengamatan
Tabel hasil pengamatan pewarnaan dan cara-cara pewarnaan
N

Pewarnaan

Keterangan

Pewarnaan sederhana

Perbesaran 40 x 10
Bentuk sel seperti batang yang biasa

o
1.

disebut basil
Berwarna ungu

2.

Pewarnaan negative

Perbesaran 40 x 10
Bentuk sel seperti batang atau sering
disebut basil.
Berwarna ungu kemerah-merahan.

3.

Pewarnaan gram
Perbesaran 40 x 10
Bentuknya batang yang sering du sebut
dengan basil.
Berwarna merah

dan

sekitarnya

berwarna orange.

4.

Pewarnaan spora

Perbesaran 40 x 10
Bentuk bakteri basil
Sporanya berwarna hijau
Mikrobannya berwarna orange

4.2

Pembahasan
Macam-macam pewarnaan yang di lakukan dalam praktikum tentang cara-cara
pewarnaan antara lain :

a.

Pewarnaan sederhana
Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan
menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini hanya menggunakan satu

macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk
melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet,
basic fuchin atau safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama)
yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam (Sutedjo, 1991).
b.

Pewarnaan Negatif
Tujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk mikroba dengan
pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah cara pengamatan
mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk membedakan spesies kecil dan cairan optiknya.
Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat secara tidak langsung,
karena yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami
pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk
melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena
bakteri praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif
memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas. Fungsi zat warna: Safranin
merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel
yang telah kehilangan warna utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target
(Pelczar, 2007).

c.

Pewarnaan Gram
Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi bakteri
dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial (untuk
membedakan) karna dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram negatif dan positif.
Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.
Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan
kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna
lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.
Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak
kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan
(safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Fungsi zat warna:

Crystal

violet

yang

berfungsi

membentuk

ikatan

mg-Ribonucleid

acid

pada

membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal

violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan alkohol.
Lugols ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-Ribonuclead acid.
Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.
Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks mgRibonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif (Pelczar, 2007).
d.

Pewarnaan Spora
Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora
dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif. Prinsip pada
pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga brwarna hijau.
Melalui pendinginan utama akan terperangkap didalam spora dengan pencucian zat warna utama
yang da pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan yang kedua(safranin) sel
vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat
yang dapat berpenetrasi kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).
Pada praktikum kali ini hasil yang diperoleh yaitu bakteri yang diamati bulat lonjong
memanjang dengan serabut ekor bewarna merah. Bakteri ini identik dengan bakteri garam positif
sebab bakteri yang di lihat dominan violet, di dalam kolono ini juga terdapat spora yang
berwarna hijau. Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)
dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat
warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu. Contoh bakteri
garam positif yaitu: Bacillus subtilis, Stepcoccus sp lactis; Staphylococcus aureus. Bakteri gram
negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat
dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan
mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Contoh bakteri garam negatif:
Corynebacterium diphteri,Eschercia coli dan Salmanela thypora (Sutedjo,1991).
Perbedaan dan ciri-ciri bakteri garam positif dan bakteri garam negatif:
Bakteri garam negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna crystal violet
sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah jika diamati dengan mikroskop.
Disisi lain bakteri garam negatif seperti Eschercia coli memiliki sistem membran ganda di mana
membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding

sel tebal berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan luarnya, bakteri ini
juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini
umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding gram negatif terutama lapisan
lipopolisakarida (dikenal juga dengan lapis atau endotoksin). Disisi lain, bakteri gram positif
akan berwarna ungu perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang
berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram. Bakteri gram negatif seperti
Staphylococcus aureus (bakteri pathogen yang umumnya pada manusia) hanya memiliki
membrane plasma tunggal yang dikelilingi membrane plasma tebal berupa peptidoglika sekitar
90% dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglika sedangkan sisanya berupa molekul lain
bernama asam teikoat (Pelczar, 2007).
Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi kedalam
endospora.
Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh faktor kesalahan adapun faktor
kesalahan sebagai berikut: Fiksasi yang kurang tepat dapat mengakibatkan bakteri mati,
Pemberian zat warna yang terlalu berlebihan dapat memperlambat pengeringan tanpa fiksasi dan
memperlambat proses pengamatan, Sentuhan atau geseran pada preparat yang telah berisi bakteri
dapat menganggu struktur bakteri.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari praktikum pewarnaan dan cara-cara pewarnaan dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut :
-

Dalam praktikum kali ini digunakan 4 macam metode pewarnaan, yaitu: Pewarnaan Sederhana
(pada pewarnaan ini bakteri berwarna ungu), pewarnaan negative (pada pewarnaan ini bakteri
berwarna merah menyala dengan ujung kepala orange dengan dasar hitam pekat), pewarnaan
gram pada pewarnaan ini bakteri yang didapat dominan violet, jadi termasuuk dalam bakteri
garam positif), pewarnaann spora (pada pewarnaan spora yang terbentuk berwarna hijau).

Bakteri terbagi atas dua yaitu:

a.

Bakteri gram positif yaitu bakteri yang mengikat zat warna utama dengan kuat sehingga tidak
dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat warna lawan. (pada
pengamatan kali ini bakteri bewarna violet).

b. Bakteri gram negative yaitu bakteri yang bersifat kebalikan dari gram positif (yang pada kali ini
bakteri tampak berwarna merah).
-

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan kali ini adalah: crystal violet, safranin, lugols
lodin, dan malachite green.
5.2 Saran
Sebaiknya pada praktikum selanjutnaya praktikum lebih berhati-hati dan teliti pada saat
pengerjaan agar hasil yang diperoleh lebih valid. Selain itu kerjasama antar praktikum dan
asisten juga lebih di tingkatkan lagi agar praktikum berjalan dengan lancer.

DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme adalah mahluk hidup kosmopolitan, terdapat dimana-mana. Bisa terdapat
di dalam air dan tanah, makanan, hewan dan tumbuhan, serta manusia. Keberadaan dan besarnya
populasi mikroorganisme sangat penting untuk diketahui dan dipelajari karena memiliki
karakteristik dan peran yang sangat erat interaksinya baik dengan lingkungan abiotik maupun
lingkungan abiotiknya. Besarnya populasi mikroorganisme dapat menentukan kualitas suatu
produk, menentukan tata guna sumber daya, menentukan tingkat kesuburan suatu lahan dan lainlain.
1.2 Tujuan Praktikum
1)
2)
3)
4)
5)
6)

Membuat media KNA/Nutrient Agar

Melakukan sterilisasi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum
Menghitung jumlah bakteri pada setiap milliliter sampel
Membuat sediaan mikroskopik
Melaksanakan tahapan-tahapaan pewarnaan gram
Menentukan karakteristik bakteri berdasarkan hasil dari pewarnaan gram

BAB II
LANDASAN TEORI
2.1

Media Pertumbuhan Mikroorganisme

Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji

sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus
disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut
ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi.

Nutrient Agar
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan
untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian
mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef,
pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur
bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk
pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.
Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000
ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada
121C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

2.2 Sterilisasi dan Desinfeksi

Sterilisasi dapat diartikan sebagai membunuh semua mikroorganisme termasuk
spora bakteri pada benda yang telah didekontaminasi dengan tepat. Tujuan Sterilisasi adalah
memusnahkan semua bentuk kehidupan mikroorganisme patogen termasuk spora, yang mungkin
telah ada pada peralatan kedokteran dan perawatan yang dipakai. Sterilisasi dapat dilakukan
dengan cara:
1. Sterilisasi dengan pemanasan kering
a.

Pemijaran/flambir
Cara ini dipakai langsung dan sederhana selain itu, cepat dan dapat menjamin

sterilisasinya,hanya penggunaannya terbatas pada beberapa alat saja, misalnya:

- Benda-benda dari logam (instrument)
- Benda-benda dari kaca.
- Benda-benda dari porselen.
b. Dengan cara udara panas kering
Cara ini pada dasarnya adalah merupakan suatu proses oksidasi, cara ini memerlukan suhu
yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan sterilisasi pemanasan basah.

2. Sterilisasi dengan penambahan zat-zat kimia

Cara ini tidak begitu efektif bila dibandingkan dengan cara pemanasan kering. Cara ini
dipergunakan pada bahan-bahan yang tidak tahan pemanasan atau cara lain tidak bisa
dilaksanakan karena keadaan.
Contoh zat kimia

: Formaldehyda, hibitane, Cidex.

3. Sterilisasi dengan radiasi.

Radiasi ultraviolet
Sterilisasi ini dilakukan kerena terdapat banyak kuman di udara dan biasanya dilakukan di
tempat-tempat khusus. Misalnya: di kamar operasi, kamar isolasi, dsb. udaranya harus steril. Hal
ini dapat dilakukan dengan sterilisasi udara (air sterilization) yang memakai radiasi ultraviolet.
4.

Sterilisasi dengan filtrasi

Cara ini digunakan untuk udara atau bahan-bahan berbentuk cairan. Filtrasi udara disebut
HEPA (Hight Efficiency Paticulate Air).
Desinfeksi adalah membunuh mikroorganisme penyebab penyakit dengan bahan kimia
atau secara fisik, hal ini dapat mengurangi kemungkinan terjadi infeksi dengan jalam membunuh
mikroorganisme patogen. Disinfektan yang tidak berbahaya bagi permukaan tubuh dapat
digunakan dan bahan ini dinamakan antiseptik. Antiseptik adalah zat yang dapat menghambat
atau menghancurkan mikroorganisme pada jaringan hidup, sedang desinfeksi digunakan pada
benda mati. Desinfektan dapat pula digunakan sebagai antiseptik atau sebaliknya tergantung dari
toksisitasnya.
Kriteria desinfeksi yang ideal:

Bekerja dengan cepat untuk menginaktivasi mikroorganisme pada suhu kamar

Aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh bahan organik, pH, temperatur dan kelembaban

Tidak toksik pada hewan dan manusia

Tidak bersifat korosif

Tidak berwarna dan meninggalkan noda

Tidak berbau/ baunya disenangi

Bersifat biodegradable/ mudah diurai

Larutan stabil

Mudah digunakan dan ekonomis

Tujuan dari sterilisasi dan desinfeksi adalah:

Mencegah terjadinya infeksi

Mencegah makanan menjadi rusak

Mencegah kontaminasi mikroorganisme dalam industri

Mencegah kontaminasi terhadap bahan- bahan yg dipakai dalam melakukan biakan

murni.

2.3 Pewarnaan Mikroorganisme

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).
Macam-macam pewarnaan (Yulneriwanti, 2008) :
1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang
- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
2. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
3. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam
4. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, flagel dll

 Cara pewarnaan negatif

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae
(filzahazny, 2008). Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna
metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda hal ini
dikarenakan bakteri gram negatif smemiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah sedangkan pada bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel
berupa peptidoglikan yang tebal. Sehingga setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori
dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol dan akhirnya dinding sel tetap menahan
warna biru. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka (filzahazny, 2008).
2.4 Morfologi
Pada bakteri umumnya dikenal 3 macam bentuk yaitu kokus, basil, dan spiral.
a. Kokus
Kokus berasal dari kata coccus yang berarti bola, jadi kokus adalah bakteri yang
bentuknya serupa bola-bola kecil. Beberapa kokus secara khas ada yang hidupnya sendirisendiri, ada yang berpasangan, atau rantai panjang bergantung. Caranya membelah diri dan
kemudian melekat satu sama lain setelah pembelahan. Golongan kokus tidak sebanyak golongan
basil. Kokus ada yang berdiameter 0,5 m adapula yang diameternya sampai 2,5 m. Pada
bentuk kokus ada beberapa tipe morfologi diantaranya adalah:
1.

Streptococcus
Kokus yang bergandeng-gandeng panjang serupa tali leher. Streptococcus dicirikan dengan sel-

sel yang membelah menjadi dua kokus, yang pada pembelahan berikutnya tidak memisahkan
diri, biasanya dengan meninggalkan dua kokkus yang melekat satu sama lain. Kokus yang
senantiasa membelah dalam satu bidang namun tidak memisahkan diri membentuk rantai
kokkus. Berdiameter 0,5 1,2 mikron
2. Sarcina
Kokus yang mengelompok serupa kubus,yaitu kokus membelah ke dalam tiga bidang yang tegak
lurus satu sama lain membentuk paket kubus Berdiameter 4,0 4,5 mikron.
3. Staphylococcus
Kokus yang mengelompok merupakan suatu untaian yaitu kokus yang membelah dalam dua
bidang yang membentuk dua gugusan yang tidak teratur bagaikan buah anggur. Berdimeter 0,8
1,0 mikron
4. Diplococcus
Kokus yang bergandengan dua-dua.
5. Tetracoccus
Kokus yang mengelompokkan berempat
b. Basil
Basil berasal dari kata bacillus yang artinya tongkat pendek atau batang kecil silindris.
Bakteri yang berbentuk basil adalah bakteri yang bentuknya menyerupai tongkat pendek atau
batang kecil silindris. Basil mempunyai bentuk dan ukuran yang beraneka ragam. Ujung
beberapa basillus di antaranya ada yang berupa batang rokok dan ada yang berbentuk seperti
cerutu. Basil juga sama seperti kokkus ada yang bergandeng-gandengan panjang yang disebut
Streptobasil, ada yang bergandengan dua-dua yang disebut diplobasil dan ada yang terlepas satu
sama lain. Ujung-ujung basil yang terlepasa satu sama lain itu tumpul, sedang ujung-ujung yang
masih bergandengan itu tajam. Akan tetapi bila ditinjau dari segi pembelahan basil membelah
hanya dalam satu bidang sehingga disebut sebagai sel tunggal. Beberapa basil ada yang
bentuknya hampir sama dengan kokkus yaitu lebar dan panjangnya sama serta bentuknya
lonjong sehingga disebut koko basil. Basil ada yang lebarnya antara 0,2 sampai 2,0 , sedang
panjangnya ada yang satu sampai 15 .
c. Spiral

Spiral adalah bakteri yang bengkok atau tidak lurus atau berbentuk silinder. Bakteri yang
berbentuk spiral itu tidak banyak terdapat. Spiral terbagi menjadi tiga bentuk diantaranya :
1. Vibrio atau bakteri koma
Batang melengkung seperti koma dan kadang membelit seperti huruf S. Mempunyai spiral yang
pendek.
2. Spiril
Bentuknya seperti spiral atau seperti lilitan. Individu-individu sel yang tidak saling melekat
3. Spirocheta
Bentuknya seperti spiral tetapi pergerakannya sangat aktif yang dimungkinkan karena adanya
flagela yang membelit diketahui bentuk aslinya.

BAB III

METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum 1
Waktu: Kamis, 22 Desember 2011,
Pukul: 10.00 WIB s/d 12.00 WIB
Praktikum 2
Waktu: Jumat, 23 Desember 2011
Pukul: 07.30 WIB s/d 11.00 WIB
Praktikum 3
Waktu: Sabtu, 24 Desember 2011
10.00 WIB s/d 12.00 WIB
Tempat Praktikum: Laboratorium Mikrobiologi FPMIPA
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi
Alat :
Beaker glass
Batang pengaduk
Tabung reaksi
pH indikator
Kertas saring
Kapas
Pembakar

Bahan :
Daging tanpa lemak
Aquades
Bacto pepton
Agar-agar

 NaCl
3.2.2 Metode Pengenceran Cawan Tuang (Plate count agar)
Alat :
Tabung reaksi
Pipet volume 1 ml steril
Cawan petri steril
Spidol
Lampu bunsen
Penangas air

Bahan :
Aquadest air
Kaldu nutrisi agar
Sampel (apel, minuman botol)
3.2.3 Pewarnaan Gram
Alat :

Mikroskop

Lampu spirtus

Jarum/lup inokulasi

Botol semprot

Staining jar

Objek glas
Bahan :

Biakan bakteri umur 24 jam

Kristal violet

Larutan iodium

Safranin

Alkohol 96 %

3.3 Prosedur kerja

3.3.1 Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi

Buatlah ekstrak daging (daging 0,25 kg direbus dalam 500 ml hingga volume menjadi
setengahnya atau direbus selama 1-2 jam )

Saring ekstrak daging dengan kertas saring, kemudian tambahkan akuades hingga volume
menjadi 500 ml.

Masukkan pepton 5,0 g NaCl 2,5 g dan agar-agar 7,5 g kemudian panaskan suspensi tersebut
hingga mendidih selama 15 menit dengan menggunakan magnetic stirer with hot plate.

Ukur pH, usahakan pH menjadi 6,6-7,3.

Buatlah agar diri dengan menggunakan tabung reaksi. Untuk agar diri ke dalam tiap tabung
isikan 12-15 suspensi agar dan. Untuk plate count agar (PCA) isi tiap tabung dengan 9 ml
medium.

Tutup semua tabung reaksi dengan kapas sebaik mungkin, sterilkan semua tabung dan cawan
petri dengan menggunakan autoklaf selama 15-20 menit pada suhu 121oC

Setelah disterilkan, untuk agar diri biarkan dalam keadaan tegak.

3.3.2 Metode Pengenceran Cawan Tuang (Plate count agar)

Sediakan 6 tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml aquadest steril, letakkan berurutan dan
beri tanda 1 s/d 6

Buatlah pengenceran dari sempel yang akan diperiksa mulai dari pengenceran 10 -1, 10-2,
sampai dengan pengenceran 10-5, dengan cara memasukkan 1 ml sampel kedalam tabung
reaksi pertama kemudian kocok maka konsentrasi menjadi 10 -1. Kemudian pipet 1 ml larutan
dari tabung pertama masukkan ke tabung kedua dan kocok sampai homogen, konsentrasi
larutan menjadi 10-2 demikian seterusnya sampai tabung keenam.

Sediakan tiga cawan petri steril , letakkan berurutan dan beri tanda 10 -3 , 10-4, 10-5 dengan
spidol atau label

Ambil larutan dari tabung ke 4, ke 5, dan ke 6 masing-masing 1 ml dengan menggunakan

pipet steril dan memasukkan ke dalam cawan petri steril yang sudah diberi tanda.

Siapkan medium kaldu nutrisi agar cair dengan suhu 40-45 oC sebanyak 3 tabung masingmasing berisi 9 ml kaldu nutrisi agar.

Masukkan kaldu nutrisi agar ke dalam cawan petri yang berisi larutan sampel, satu tabung
KNA untuk satu petri, goyangkan hingga homogen dengan cara memutar searah jarum jam
dan berlawanan arah jarum jam diatas meja, biarkan hingga dingin dan mengeras.

Inkubasikan pada suhu 22-37oC selama 24-48 jam di dalam inkubator.

Hitung jumlah koloni menggunakan colony counter.

Untuk menentukan jumlah bakteri coli per ml sampel, jumlah koloni dikalikan dengan
pengenceran. Misalnya pada pengenceran 10-5 didapatkan koloni sebanyak 100, jadi jumlah
bakteri per ml sampel adalah 100 x 105.

3.3.3 Pewarnaan Gram

Siapkan kaca preparat yang sudah di tetesi air

Taruh biakan yang akan diwarnai

Fiksasi sediaan mikroskop diatas api

Tuanglah sediaan dengan karbol kristal violet, biarkan selama 3 menit.

Buanglah kelebihan zat warna pada sediaan tersebut dengan dibilas dengan air mengunakan
botol semprot.

Tuangi larutan lugol, biarkan 45-60 detik.

Masukkan ke dalam alkohol 96% dalam beker gelas, goyang-goyangkan selama 1 menit

Bilaslah dengan air dengan menggunakan botol semprot, keringkan dengan kertas isap

Tuangi larutan safranin, biarkan selama 3 menit.

Cuci dengan menggunakan air menggunakan botol semprot dan keringkan di udara.

Amati sediaan dibawah mikroskop dengn menggunakan lensa objektif 100x , terlebih dahulu
sediaan di tetesi minyak imersi.

Hasil pewarnaan :

Berwarna ungu : gram positif

Berwarna merah : gram negatif

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Tabel Hasil Pengamatan (Menghitung Bakteri)

Sampel

: makanan

Tanggal

: 24 Desember 2011
Jumlah bakteri /

Pengenceran

Jumlah Koloni

10-3

11

11 x 103 CFU/ml

10-4

9 x 104 CFU/ml

10-5

10

10 x 105 CFU/ml

Sampel

: minuman

Tanggal

: 24 Desember 2011

ml sampel

Jumlah bakteri /

Bulat, menyebar
Tidak beraturan ,
menyebar
Titik (bulat) , meyebar

Pengenceran

Jumlah Koloni

10-3

12

12 x 103 CFU/ml

Bulat, menyebar

10-4

5 x 104 CFU/ml

Bulat, menyebar

10-5

4 x 105 CFU/ml

Titik, meyebar

ml sampel

4.2 Hasil pengamatan Pewarnaan Gram

Mikroorganisme

: Staphylococcus

Bentuk sel

: Bulat

Rangkaian sel

: berkumpul

Warna sel

: ungu

Garam

: (+) positif

Gambar : bakteri pada minuman

Karakteristik bakteri

Mikroorganisme

: Streptobasil

Karakteristik bakteri

Bentuk sel

: Batang

Rangkaian sel

: memanjang

Warna sel

: ungu

Garam

: (+) positif

Gambar : bakteri pada makanan

BAB V
KESIMPULAN
Dari hasil pengamatan yang kami peroleh dari bakteri makanan dan minuman yang
diambil dari buah apel dan teh madu, ditemukan bakteri pada makanan (buah apel) bentuk
selnya

batang,

rangkaian

selnya

memanjang,

bewarna

ungu,

gram

(+),

jenis

mikroorganismenya Streptobasil. Sedangkan dalam minuman (the madu), ditemukan bakteri

yang bentuk selnya bulat, rangkaian selnya berkumpul, bewarna ungu, gram (+), jenis
mikroorganismenya Staphylococcus.
Hasil pengamatan yang kami peroleh jumlah bakteri makanan pada pengenceran 10 -5
terdapat 10 koloni bakteri, Jumlah bakteri / ml sampel 10 x 10 5 CFU/ml dan karakteristik
bakterinya titik (bulat) , meyebar. Dan hasil pengamatan jumlah bakteri di minuman pada
pengenceran 10-5 terdapat 4 koloni bakteri, Jumlah bakteri / ml sampel 4 x 105 CFU/ml, dan
karakteristik bakterinya adalah titik menyebar.
Dari hasil pengamatan tersebut jumlah koloni bakteri dan jumlah bakteri/ml, bakteri
pada makanan (buah apel) lebih banyak dibandingkan jumlah bakteri di dalam minuman (teh
madu).

DAFTAR PUSTAKA
Biologionline.htm
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
http://firmangalung07.blogspot.com/2009o/08/teknik-pewarnaan-mikrooganisme.html
http://ekonom-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-5-morfologi-mikroba.html
http://www.dostoc.com

Kirimkan Ini lewat Email BlogThis! Berbagi ke Twitter Berbagi ke Facebook

Posting Lebih Baru