ACARA I

PEMBUATAN LARUTAN STOK, MEDIA KULTUR DAN STERILISASI

ALAT

Wahid Sulaiman (S901408003)

Pascasarjana, Program Studi Biosains
Universitas Sebelas Maret
A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Kultur

jaringan

adalah

teknik

budidaya

yang

dilakukan

menggunakan bagian tanaman yang ditanam pada suatu media dalam

keadaan steril. Media kultur merupakan media yang digunakan untuk
menumbuhkan explan. Media kultur harus berisi hara makro dan mikro
yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman, sumber karbohidrat,
vitamin, agar dan ZPT atau ekstrak tanaman yang diperlukan. Media
kultur yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan Skoog
(MS).
Beberapa prosedur yang penting dalam pembuatan media adalah
pembuatan larutan stock dan sterilisasi media. Penggunaan larutan stock
dalam pembuatan media akan mengurangi jumlah pekerjaan yang sifatnya
berulang-ulang, sehingga kesalahan manusia atau percobaan (human atau
experimental error) dapat dikurangi. Selain itu, penimbangan secara
langsung dari bahan-bahan pembuat media, seperti hara mikro dan ZPT,
yang membutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit (miligram atau
mikrogram) pada formulasi akhir tidak akan diperoleh secara akurat. Oleh
karena itu sudah menjadi prosedur baku untuk komponen-komponen
tersebut dibuat dalam larutan stock. Pemberian unsur hara mikro dan ZPT
juga harus disesuaikan dengan jenis tanaman dan kebutukan masingmasing tanaman. Untuk beberapa bahan tertentu, misalnya IAA, stok
larutannya

harus

disimpan

dekomposisi oleh cahaya

dalam

botol

gelap

untuk

mencegah

Sterilisasi merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam

kultur jaringan. Oleh karena itu, pengetahuan tentang prosedur sterilisasi
dan pembuatan media kultur perlu dipelajari dan mendapatkan perhatian
secara khusus. Usaha mengatasi kontaminasi mikroorganisme merupakan
hal yang sangat penting dalam kultur jaringan. Media botol kultur dan
alat-alat yang digunakan untuk menangani kultur jaringan harus
diusahakan steril sebagaimana bahan tanaman yang akan digunakan.
Begitu pula dengan tempat atau laboratorium yang akan digunakan dalam
kegiatan kultur jaringan harus terbebas dari mikroorganisme dan
pathogen. Kebersihan tempat, kerapian dan kecermatan kerja perlu dijaga
untuk mengurangi resiko terjadinya kontaminasi.
2. Tujuan Praktikum
Tujuan Praktikum Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur dan
Sterilisasi Alat adalah:
a. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan larutan stok
b. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan
c. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman

B. Tinjauan Pustaka
Kultur jaringan yaitu suatu metode untuk mengisolasi bagian dari suatu
tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ serta
menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga bagian-bagian tersebut
dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang utuh
kembali.
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam
mineral, vitamin dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan
seperti agar, gula dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang
ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung
dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi
ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan
juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf
(Yunus 2010).
Sterilisasi otoclaf menggunakan panas dan tekanan uap air. Temperatur
sterilisasi biasanya 121o C, sedang tekanan sekitar 17,5- 20 psi. Lama
sterilisasi tergantung dari volume dan jenis bahan. Alat-alat dan air
disterilisasikan selama 1 jam, tetapi media hanya 20-40 menit. Sterilisasi
media yang terlalu lama menyebabkan: degradasi vitamin dan asamasam
amino, inaktivasi sitokinin zeatin riboside dan perubahan pH yang
mengakibatkan depolimerisasi agar. (Susilowati, 2001)
Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai

prasyarat

untuk

mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Syarat tersebut adalah wadah

dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk
tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media
tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup
dan memperbanyak dirinya (Hendra 2007).
Keberhasilan kultur jaringan tanaman dipengaruhi oleh beberapa faktor,
diantaranya sterilisasi, pemilihan bahan eksplan, faktor lingkungan seperti
pH, cahaya dan temperatur, serta kandungan ZPT (Zat Pengatur Tumbuh)
dalam medium kultur.

Penggunaan zat pengatur tumbuh dalam kultur

jaringan tergantung pada jenis tanaman yang digunakan serta tujuan kegiatan.
Untuk pembentukan tunas umumnya menggunakan zat pengatur tumbuh
sitokinin (BA atau kinetin), untuk pembentukan kalus menggunakan auksin
2.4-D dan untuk pembentukan akar menggunakan auksin (IAA, IBA, atau
NAA). Pada tanaman tertentu sering pula digunakan kombinasi sitokinin dan
auksin tergantung tujuan pembentukan tunas, akar atau kalus. Perimbangan
sitokinin terhadap auksin atau sebaliknya dapat mengarahkan proses
morfogenesis. Untuk regenerasi melalui jalur embriogenesis somatik
diperlukan beberapa tahapan dengan menggunakan konsentrasi zat pengatur
tumbuh yang berbeda. Untuk pembentukan kalus embriogenik umumnya
digunakan auksin kuat seperti 2.4-D. Untuk tahap berikutnya konsentrasi
auksin diturunkan dan pada tahap pendewasaan digunakan sitokinin. (Evan
2010).

C. Metode Praktikum
1. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur dan Sterilisasi
Alat dilaksanakan pada hari Kamis, 26 Maret 2015 pukul 09.00 - 13.00
WIB di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi, Fakultas
Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta.
2. Alat
a. Peralatan untuk penanaman eksplan, meliputi:
1) Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), lengkap dengan lampu bunsen
yang berisi spirtus.
2) Petridish dan botol-botol kultur.
3) Peralatan diseksi, yaitu pinset besar/kecil, pisau pemes, gunting
eksplan.
Alat-alat penanaman, yaitu petridish dan peralatan diseksi
dibungkus dengan kertas, kemudian disterilisasi di dalam autoklaf pada
tekanan 1,5 kg/cm2 selama 30 menit. Setelah disterilisasi, alat-alat
tersebut disimpan di dalam oven.
b. Peralatan untuk pembuatan media, meliputi:
1) Timbangan analitik
2) Botol-botol kultur
3) Magnetik stirer
4) pH meter
5) Gelas piala
6) Pipet
7) Plastik pp 0,3 mm
8) Karet gelang
9) Kertas label
3. Bahan
a. Aquadest
b. Larutan Stok, terdiri atas hara makro dan mikro, vitamin serta ZPT
c. Agar-agar
d. Gula
e. NaOH 1 N dan HCl 1 N
4. Cara Kerja
a. Pembuatan Larutan Stok
1) Larutan stok media
a) Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dikalikan menjadi
beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsur hara makro
dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali konsentrasi.
b) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest
dengan volume tertentu, misalnya 500 ml.

c) Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan

menyimpannya ke dalam refrigerator.
2) Larutan stok zat pengatur tumbuh
a) Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml
adalah sebagai berikut:
100 ppm
= 100 mg/l
= 30 mg/0,3 l
= 30 mg/300 ml
b) Menghitung kebutuhan bahan IBA 100 ppm sebanyak 100 ml
adalah sebagai berikut:
100 ppm
= 100 mg/l
= 10 mg/0,1 l
= 10 mg/100 ml
c) Melarutkan bahan dengan Alkohol atau NaOH 1 N kemudian
ditambah dengan aquadest sampai 300 ml untuk BAP dan 100 ml
untuk IBA.
d) Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol dan
menyimpannya ke dalam refrigerator.
b. Pembuatan Media
1) Mengambil masing-masing larutan stok sesuai dengan ukuran yang
telah ditentukan dan memasukkannya ke dalam gelas piala.
2) Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan, misalnya:
a) Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi BAP 2 ppm, maka
volume larutan stok yang diambil adalah:
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100 ppm
= 1000 ml x 2 ppm
V1
= 20 ml/L
b) Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi IBA 0,5 ppm,
maka volume larutan stok yang diambil adalah:
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100 ppm
= 1000 ml x 0,5 ppm
V1 = 5 ml/L
Keterangan
: V1 = volume larutan stok yang diambil
M1 = dosis larutan stok yang tersedia
V2 = volume media yang akan dibuat
M2 = dosis media yang akan dibuat
3) Menambah aquadest sampai 1000 ml.
4) Menambah gula sebanyak 30 gram
5) Mengatur pH dalam kisaran 5,8 - 6,3 dengan menambahkan
beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCL untuk

menurunkan pH. Pada saat pengukuran pH, larutan media diaduk

dengan magnetik stirer.
6) Menambahkan agar-agar 8 gram kemudian dididihkan.
7) Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang lebih
25 ml tiap botol.
8) Menutup botol berisi larutan media dengan plastik.
9) Memasukkan botol-botol berisi media ke dalam autoklaf untuk
proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 30 menit.
10) Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan untuk
mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat
dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat
penanaman.
c. Media Penanaman
Dalam praktikum ini, media yang digunakan adalah media
Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan
ZPT BAP 2 ppm. Media kultur tersebut digunakan untuk penanaman 4
macam setiap mahasiswa/praktikan.

D. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Tabel 1.1 Alat yang Digunakan dalam Pembuatan Media
Gambar

Langkah Kerja
Menyiapkan botol kultur yang
telah dicuci dengan bersih.

Gambar 1.1 Botol kultur

Menyiapkan bahan-bahan yang
dibutuhkan untuk pembuatan
media mencakup nutrisi-nutrisi
yang dibutuhkan oleh tanaman.
Gambar 1.2 Bahan pembuatan media
Menimbang komposisi media
pada timbangan analitik sesuai
dosis media yang akan dibuat.

Gambar 1.3 Timbangan analitik

Mencampurkan media yang telah
disiapkan ke dalam tabung
erlenmeyer lalu mengukur pH
dengan pH meter.

Gambar 1.4 Alat-alat pembuatan media

Memanaskan media dengan alat
pemanas hingga warna media
cukup bening.

Gambar 1.5 Alat pemanas

Memindahkan media dari tabung
erlenmeyer ke dalam botol kultur
25 ml pada setiap botol kultur.

Gambar 1.6 Media

Sumber: Laporan Sementara

Tabel 1.2 Pembuatan Larutan Stock

Gambar

Langkah Kerja

Menambahkan aquadest
pada larutan media yang
telah disiapkan sampai
1000 ml
Gambar 1.7 Penambahan Aquadest
pada Larutan Media

Gambar 1.8 Pengukuran pH Larutan

Media

Mengukur pH larutan, pH
harus 6,3. Apabila kurang
dari 6,3 maka ditambahkan
NaOH, apabila pH lebih
dari 6,3 makan
ditambahkan HCl

Menambahkan gula 30
gram pada larutan media
Gambar 1.9 Penambahan Gula pada
Larutan Media

Media kultur yang telah di

strirrer dapat digunakan
Gambar 1.10 Media Kultur Siap
Digunakan
Tuang media kultur dalam
botol kutur

Gambar 1.11 Media Kultur Dalam

Botol Kultur

Gambar 1.12 Media Kultur Akan

Disterilisasi Dalam
Autoklaf

Kemudian sterilisasi media

kultur dengan autoclave
selama 30 menit

Sumber: Laporan Sementara

Pembahasan
Medium yang digunakan dalam praktikum kultur jaringan tanaman
dapat berupa medium padat dan medium cair. Untuk memudahkan
pembuatan medium kultur sebagian besar komponen disiapkan dalam
bentuk larutan beku. Bahan seperti sukrosa, agar dan beberapa komponen
tertentu tidak dibuat larutan baku, tetapi langsung ditambahkan ke dalam
campuran untuk pembuatan medium. Medium padat umumnya digunakan
untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi membentuk
tanamanyang lengkap (planlet), sedangkan medium cair biasanya
digunakan untuk kultur sel. Media tumbuh dapat mengandung lima
komponen utama, yaitu senyawa anorganik (unsur makro dan unsur
mikro), zat pengatur tumbuh, sumber karbon, vitamin dan suplemen
organik. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain
Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop,
Knudson-C, Anderson dan sebagainya. Media yang digunakan pada
praktikum ini adalah Murashige dan Skoog (MS). Medium MS memiliki
nitrogen yang tersedia dalam bentuk cairan nitrat dan amonia, sehingga
kebutuhan nitrogen akan selalu terpenuhi.
Media kultur jaringan juga memerlukan bahan tambahan seperti
agar, gula (digunakan sebagai sumber energi), dan lain-lain. Agar adalah
campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae dan
digunakan sebagai bahan pemadat media. Gula digunakan sebagai sumber

energi dalam media kultur, karena umumnya bagian tanaman atau eksplan
yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang
rendah. Pemilihan jenis media kultur yang tepat akan menghasilkan
pertumbuhan dan perkembangan eksplan sesuai yang diinginkan.
Jenis media kultur yang digunakan adalah media Murashige and
Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT BAP 2 ppm.
Media MS ini dibuat semi-solid (semi padat) dengan cara menambahkan
agar. Media semi padat ini digunakan karena beberapa alasan,
diantaranyabeksplan yang kecil mudah terlihat dalam media padat, selama
kultur eksplan tetap berada pada orientasi yang sama, eksplan berada di
atas permukaan media sehingga tidak diperlukan teknik aerasi tambahan
pada kultur, orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap, dan kalus tidak
pecah seperti jika ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar
dalam beberapa kasus dapat menghambat pertumbuhan karena agar
mungkin mengandung senyawa penghambat yang dapat menghambat
morfogenesis beberapa kultur atau memperlambat pertumbuhan kultur,
eksudasi fenolik dari eksplan terserap oleh media yang menempel dengan
eksplan sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan eksplan.
pH media biasanya sedikit masam. Media biasanya diatur pada
kisaran 5.6-5.8 tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang
berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0, media
mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak
dapat memadat (Arianto 2006).
Selain media MS, beberapa media dasar yang banyak digunakan
antara lain, media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume
lain, media dasar White yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman
tomat. media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur
jaringan anggrek, media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan
dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel, media dasar schenk dan
Hildebrandt atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanamantanaman monokotil, medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant
Medium (WPM) dan media N6 untuk serealia terutama padi.

Praktikan membuat media sebanyak 50 botol kultur. Hasil dari

pembuatan media yang di buat pada praktikum kali ini berhasil 100%,
karena media terlihat bagus, agarnya bisa mengeras dan tidak terjadi
kontaminasi sebelum dilakukan penanaman eksplan. Setelah didiamkan
selama satu minggu, media pun tidak terjadi kontaminasi. Komposisi
yang digunakan dalam pembuatan media diantaranya stok makro 50 ml,
stok mikro 10 ml, vitamin 10 ml, BAP 100 ppm 20 ml, Fe DTA 50 ml,
gula 30 gram, agar-agar, aquadest, NaOH 1 N dan HCl 1 N.
Stok makro, stok mikro, vitamin, BAP dan Fe DTA berfungsi
sebagai nutrisi bagi pertumbuhan eksplan. Gula berperan dalam
penyediaan energi, agar-agar sebagai pemadat nutrisi dan media, serta
aquadest sebagai pelarut. pH media sebaiknya berkisar antara 5,8-6,3 dan
apabila dalam pembuatannya terlalu asam atau terlalu basa, maka perlu
ditambahkan beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCl untuk
menurunkan pH. pH harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak
mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH
biasanya dilakukan dengan menggunakkan NaOH (KOH) atau HCl pada
waktu semua komponen telah dicampur, beberapa saat sebelum
disterilkan dalam autoklaf. Penambahan asam amino seringkali sebagai
buffer organik.
E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dapat diambil kesimpulan, yaitu:
a. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan.
b. Jenis media kultur yang digunakan adalah media Murashige and Skoog
(MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT BAP 2 ppm dan
dibuat semi-solid (semi padat) dengan cara menambahkan agar.
c. Pembuatan media berhasil 100%, tetapi belum bisa dipastikan
kemampuannya untuk menumbuhkan eksplan.

d. Komposisi yang digunakan dalam pembuatan media diantaranya stok

makro, stok mikro, vitamin, BAP, Fe DTA, gula, agar-agar, aquadest,
NaOH dan HCl.
2. Saran
Suatu keadaan yang aseptik adalah faktor penting dalam kegiatan
kultur jaringan, maka diharapkan agar praktikan dapat menjaga kondisi
tempat maupun media agar tetap steril karena dapat mempengaruhi pada
pertumbuhan eksplan.

DAFTAR PUSTAKA
Arianto, N, Heru Sugito 2006. Pedoman Pelaksanaan Teknik Kultur Jaringan.
Penerbit :Penebar Swadaya. Jakarta.
Lestari, E., G. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam PerbanyakanTanaman
melalui Kultur Jaringan. Jurnal AgroBiogen 7(1):63-68
Hendra, T 2007. Kultur Jaringan. http://lelos66.blog.friendster.com.htm. Diakses
pada tanggal 25 April 2013 pukul 15.00 WIB.
Susilowati, Ari. Listiawati, S. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber
Kontaminasi Kultur In vitro di Sub-Lab. Biologi Laboratorium MIPA Pusat
UNS. Jurnal Biodiversitas, Volume 2 No. 1 hlm 110-114.
Yunus 2010. Teknik Kultur Jaringan. http://www.bbpp-lembang.info.htm. Diakses
pada tanggal 20 April 2015 pukul 15.00 WIB.