Kloning dan

karakterisasi gen baru

GENETIKA
MOLEKULER
cry8Ab1 dari
Bacillus thuringiensis
strain B-JJX dengan toksisitas
khusus untuk larva scarabaeid
(Coleoptera: Scarabaeidae)
DI SUSUN OLEH :
WAHID SULAIMAN (S901408003)

Kloning dan karakterisasi gen baru cry8Ab1 dari Bacillus

thuringiensis strain B-JJX dengan toksisitas khusus untuk
larva scarabaeid (Coleoptera: Scarabaeidae)

PENDAHULUAN
Uret ( eng : Grub ), larva kumbang
scarabaeid (Coleoptera: Scarabaeidae),
hama umum yang dapat menyebabkan
kerusakan yang luas untuk tanaman dan
tanaman termasuk biji-bijian, kapas,
tanaman minyak, sayuran, tembakau,
rumput dan tanaman lainnya.
Peringkat pertama di semua jenis hama
tanah di China.
Karena uret hidup di lingkungan bawah
tanah dan sampai batas tertentu dapat
menghindari efek bahan kimia,
pengendalian uret dengan bahan kimia
biasanya tidak seefisien seperti yang
diharapkan.

 Di sisi lain, pengendalian hama

kimia dapat menimbulkan risiko
melalui residu kimia terhadap
lingkungan dan kesehatan
manusia dan hewan.
Oleh karena itu, menemukan
pendekatan preventif yang aman
dan efektif untuk mengendalikan
ulat merupakan suatu prioritas.

 Bacillus thuringiensis (Bt), adalah

spesies Bacillus termasuk dalam
banyak
subspesies,
dapat
menghasilkan kristal yang memiliki
toksisitas yang tinggi untuk berbagai
serangga (Sanahuja et al. 2011).
Karena fitur Bt tersebut, seperti
aktivitas
tinggi
insektisida,
spesifisitas relatif, dan aman bagi
manusia dan hewan, telah diterapkan
secara luas untuk kontrol hama
pertanian, hama hutan, gudang dan
hama sanitasi (Schnepf et al. 1998).

B. thuringiensisdapat memproduksi dua jenis toksin, yaitu toksin kristal (Crystal, Cry) dan toksin sitolitik (cytolytic, Cyt). Toksin Cyt
dapat memperkuat toksin Cry sehingga banyak digunakan untuk meningkatkan efektivitas dalam mengontrol insekta. Lebih dari 50 gen
penyandi toksin Cry telah disekuens dan digunakan sebagai dasar untuk pengelompokkan gen berdasarkan kesamaan sekuens
penyusunnya.
Tabel di bawah ini merupakan klasifikasi toksin Bt pada tahun 1995

Gen

Bentuk Kristal

Bobot Protein (kDa)

Insekta yang
dipengaruhi

cry1 [several
subgrup:A(a), A(b),
A(c), B, C, D, E, F, G]

bipiramida

130-138

larva lepidoptera

cry1 [subgrup A, B, C]

kuboid

69-71

cry3 [subgrup A, B, C]
cry4 [subgrup A, B, C,
D]
Cry5 - Cry9

Datar/tidak teratur

73-74

lepidoptera and
diptera
koleoptera

bipiramida

73-134

diptera

berbagai macam

35-129

berbagai macam

 Kloning dan karakterisasi gen cry

dengan toksitas spesifik untuk uret
menjadi penting dalam bidang
pengendalian hama.
Ekspresi gen cry8Ab1 di HD-73- dan
aktifitas insektisida yang di lakukan
dalam penelitian ini akan menjadi pioner
untuk mengendalikan uret melalui gen
cry baru untuk pembangunan rekayasa
genetika mikroba atau tanaman
transgenik tahan uret.

Metode dan Bahan

Strain, plasmid, serangga dan media kultur
Bt strain B-JJX diisolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan dekat
Yantai, Provinsi Shandong, China Timur, pada tahun 2006
menggunakan perlakuan thermal shock (Zhang et al. 2000). Strain
disimpankan di China Center for Type Culture Collection (CCTCC),
Wuhan, Cina (nomor koleksi : CCTCC AB 2.013.034). Bt acrystalliferous
mutan strain HD-73-, Escherichia coli SSC110 dan ekspresi Bt vektor
pSXY422b disediakan oleh Dr. Fu-ping Song, Institute of Plant
Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences. E. coli DH5 dan
vektor pBluescript SK (+) yang disimpan di laboratorium ini. Bt dan E.
coli dikultur dalam medium LB pada 28 C dan 37 C.

Holotrichia parallela

Holotrichia oblita

Dua spesies scarabaeid Asia, Holotrichia

oblita dan Holotrichia parallela di kumpulkan
dari lapangan di Chengyang District,
Qingdao, Cina. kumbang dewasa diberi
makan dengan daun willow dan disimpan di
dalam ruangan 25 C sampai mereka
meletakkan telur. Larva berkembang diberi
makan dengan kentang selama 3 hari untuk
bioassay. Satu spesies coleopteran, T.
molitor, dan tiga spesies lepidopteran,
Helicoverpa armigera, Spodoptera exigua,
Mythimna separata diinkubasi pada 26 C,
85% RH dan penyinaran dari 16: 8 (L: D).

 Analisis PCR-RFLP dari B. thuringiensis strain

Plasmid DNA diekstraksi dari 66 B. thuringiensis strain
yand di isolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan di
berbagai wilayah Provinsi Shandong, Cina, digunakan
sebagai template untuk Polymerase Chain Reaction (PCR)
amplifikasi. metode ekstraksi Bt DNA plasmid diikuti
protokol dijelaskan oleh Shu et al. (2009). Identifikasi gen
baru cry8 dilakukan dengan menggunakan metode PCRRFLP yang di sempurnakan oleh Yu et al. (2006).

Kloning dan karakterisasi gen

cry8Ab1
Untuk amplifikasi gen cry8 dari Bt strain B-JJX, sebuah sepasang primer spesifik,
primer forward JJX5 (5 - CGGGATCCGATGAGTCCAAATAAT-3) Dan JJX3 primer reverse
JJX5 (5 -GCGTCGACTTACTCTACGTC-3) (ditandai dengan garis bawah menunjukkan
Situs pemotongan BamHI atau SalI), yang dirancang dengan software Primer Premier
5.0 berdasarkan urutan cry8 gen baru dikutip dalam GenBank.
PCR sebagai berikut: 94 C selama 5 menit dan 30 siklus denaturasi pada 94 C untuk
1 menit, anil di 54 C selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 C selama 4 menit
diikuti dengan ekstensi akhir 10-menit pada 72 C.
Perkiraan Produk PCR 3,5 kb panjang, dikonfirmasi oleh sequencing, diligasi dengan
pBluescript SK (+) untuk membuat rekombinan pBlue-cry8. Plasmid rekombinan pBluecry8 diekstraksi dan analisis oleh pencernaan dengan BamHI dan SalI setelah di
amflifikasi dalam E. coli DH5.
Metode untuk ekstraksi E. coli plasmid, DNA. digesti, ligasi, dan transformasi diikuti
protokol dari Sambrook et al. (1989). Sekuensing DNA dilakukan oleh United Gene
Company (Shanghai, Cina). Urutan asam amino dari protein Cry8-jenis dan Cry1Aa
protein yang didownload dari GenBank dan diedit menggunakan Bioedit software.
Kemudian dibuat dendrogram menggunakan software MEGA5.

Ekspresi gen cry8Ab1 di B. Thuringiensis

acrystalliferous
strain
mutan.dipotong dengan BamHI dan SalI
ORF dari cry8Ab1 gen dibuat
dari pBlue-cry8

dimasukkan ke dalam vektor ekspresi pSXY422b untuk membangun

rekombinan vektor ekspresi pSXYcry8.
Kemudian pSXY-cry8 di rubah menjadi E. coli SCS110 untuk di methylasi, dan
kemudian di elektroporasi ke Bt kristal mutan HD- 73- mengikuti metode
Lereclus et al. (1989).
ORF dari cry8Ab1 gen dibuat dari pBlue-cry8 dipotong dengan BamHI dan SalI
dimasukkan ke dalam vektor ekspresi pSXY422b untuk membangun
rekombinan vektor ekspresi pSXYcry8.
Kemudian pSXY-cry8 di rubah menjadi E. coli SCS110 untuk di methylasi, dan
kemudian di elektroporasi ke Bt kristal mutan HD- 73- mengikuti metode
Lereclus et al. (1989).
Sebuah klon positif, HD73-cry8Ab1, diidentifikasi dengan PCR dan kemudian di
culturkan di LB agar plate yang berisi 25 g / mL eritromisin pada 28 C sampai
spora dibentuk dan dirilis. Sel-sel, spora dan kristal parasporal dikumpulkan
dan siap untuk di observasi mengunakan scanning electron mikroskopis dan
analisis SDS-PAGE.

ioassay aktivitas insektisida dari gen cry8Ab1

Bt strain HD-73-, HD73-cry8Ab1 dan Bt B-JJX dikultur dalam
medium LB sampai spora dan kristal parasporal di lepaskan.
Sel, spora dan kristal parasporal disusun oleh sentrifugasi 10.000
r / min selama 10 menit. Konsentrasi protein dalam sampel
dianalisis menggunakan metode Bradford (Bradford 1976).
Insektisida yang aktivitas Bt strain B-JJX, HD73-cry8Ab1, HD-73terhadap H. oblita dan H. parallela dilakukan sesuai dengan
metode Yu et al. (2006).
Toksisitas insektisida Bt strain B-JJX, HD73- cry8Ab1, HD-73terhadap H. armigera, S. exigua, M. separata, T. molitor dilakukan
menurut metode Xue et al. (2005).
Setiap bioassay diulang setidaknya tiga kali. Data bioassay yang
dianalisis dengan menggunakan sistem pengolahan data DPS
(Tang dan Zhang 2012).

HASIL
Skrining B. thuringiensis strain mengandung cry8-jenis gen menggunakan PCR-RFLP

Enam puluh enam B. thuringiensis strain diisolasi dari sampel tanah yang
dikumpulkan dari Provinsi Shandong Cina disaring oleh PCR Metode dengan primer
universal S5un8 / S3un8 yang diterapkan untuk identifikasi cry8-jenis gen. Sebuah
fragmen sepanjang 1,2 kb diamplifikasi menggunakan cetakan DNA diisolasi dari Bt
strain B-JJX (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa Bt strain B-JJX terkandung
gen cry8-jenis yang dapat mengkodekan protein Cry8 berpotensi dengan aktivitas
insektisida terhadap larva scarabaeid. 1,2 kb Produk PCR tidak dapat di digesti oleh
DraI dan EcoO109I (data tidak ditunjukkan) dan pola PCR-RFLP ini berbeda dari cry8
dikenal gen, menunjukkan bahwa B-JJX mungkin berisi gen baru cry8-jenis.
Pengamatan morfologi Bt strain B-JJX menunjukkan sel-sel adalah batang tunggal
atau membentuk rantai. Setelah dikulturkan di piring LB di 28 C selama 3 hari,
menghasilkan spora oval panjang dan bulat atau kristal parasporal cuboidal dalam
berbagai ukuran.

Kloning dan karakterisasi gen cry8Ab1

Sebuah produk PCR 3,5 kb panjang sesuai dengan open reading frame dari
gen cry8 diamplifikasi menggunakan sepasang primer spesifik, JJX5 dan JJX3,
dirancang sesuai dengan cry8-gene type. Fragmen ini dimasukkan ke dalam
vektor kloning pBluescript SK (+) yang menghasilkan generasi plasmid
rekombinan pBlue-cry8 (Gbr. 1A).
Selanjutnya, pBlue-cry8 diidentifikasi dengan PCR dan pemotongan restriksi
ganda dengan BamHI dan SalI (Gambar. 1B), yang membuktikan bahwa
target gen cry8 berhasil dimasukkan ke pBluescript SK (+).
Gen cry8 terdiri dari 3543 bps dengan kandungan G + C dari 37.99% dan
dikodekan protein dari 1180 asam amino. menyimpulkan molekul Berat (MW)
dari Cry8 adalah 133,3 kDa dengan titik isoelektrik pH 4,68 menunjukkan
protein asam yang lemah.
Urutan asam amino gen cry8 tertinggi homologi (75%) dengan yang Cry8Aa1
dan <75% dengan gen cry8 lainnya. Membandingkan urutan asam amino
dari Cry8Ab dengan lainnya Cry8 ICPs dan Cry1Aa, sebuah dendrogram dari
protein Cry8 dihasilkan (Gambar. 2)
Urutan gen cry8 terdaftar di GenBank (Aksesi Jumlah ini EU044830), dan

Gambar. 1. kontruksi plasmid rekombinan pBlue-cry8 dan pSXY-cry8. (A) kontrusi plasmid rekombinan pBlue-cry8 dan
pSXY-cry8. Analisis (B) Pembatasan pencernaan plasmid rekombinan pBlue-cry8. Lane 1: -HindIII DNA Marker (23130,
9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 bp); jalur 2: pBlue-cry8 dipotong dengan BamHI; jalur 3: pBlue-cry8 di potong dengan
SalI; jalur 4: pBlue-cry8 di potong dengan BamHI dan SalI; lane 5: produk PCR dari gen cry8. Analisis (C) Pembatasan
pencernaan plasmid rekombinan pSXY-cry8. Lane 1: -HindIII DNA Marker (23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 bp);
jalur 2: pSXY-cry8 dipotong dengan BamHI dan SalI; jalur 3: pSXY422b plasmid dipotong dengan BamHI dan SalI; jalur 4:
produk PCR dari gen cry8.

Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa gen

cry8Ab1 menyatakan sekitar 130 kDa (MW) protein
(Gambar. 4), yang konsisten sesuai dengan
prediksi. Tidak ada protein 130 kDa di HD-73- asli .

Urutan gen cry8 terdaftar di GenBank

(Aksesi Jumlah ini EU044830), dan
diberi nama cry8Ab1 sebagai gen
baru cry oleh komite nomenklatur
delta-endotoksin B. Thuringiensis
(Crickmore 2013).
Menurut prinsip tata nama untuk cry
gen (Crickmore et al. 1998), jumlah
bahasa Arab terakhir "1" di cry8Ab1
berarti bahwa cry8Ab1 adalah orang
pertama yang disampaikan kepada
komite nomenklatur dan disetujui
antara gen cry8Ab.

Ekspresi gen cry8Ab1 di Bt mutan

acrystalliferous strain HD-73
Fragmen DNA yang mengandung gen cry8Ab1, didigesti
dengan BamHI dan SalI dimasukkan dalam vektor
ekspresi Bt pSXY422b menghasilkan kontruksi plasmid
rekombinan, pSXY-cry8 (Gbr. 1A).
Setelah mengidentifikasi dengan analisis dengan
pemotongan ganda BamHI dan SalI (Gbr. 1 C),
pSXY-cry8 di masukan ke acrystalliferous Bt strain
mutan HD-73-. Sebuah klon positif, HD73-cry8Ab1,
dikultur selama 72 jam sampai spora terbentuk dan
dilepaskan.

Morfologi kristal parasporal dan spora dari Bt ketegangan B-Jjx (A), yang direkayasa Bt regangan
HD73-cry8Ab1 (B) dan Bt acrystalliferous strain mutan HD-73- (C). Bar = 1 m.

Morfologi kristal Cry8Ab1, diamati dengan scanning electron

microscope menunjukkan bentuk spherical parasporal (Gambar.
3B) yang mirip dengan yang bulat dibentuk oleh-jenis liar Bt
strain B-JJX (Gambar. 3A). HD-73- tidak membentuk kristal-kristal
parasporal (Gambar. 3C).

 Aktivitas insektisida dari protein Cry8Ab1 dan strain Bt B-JJX

Protein Cry8Ab1 beracun untuk larva 3 hari-lama H. oblita dan H. parallela dengan LC50 dari 5,72
g toksin g-1 tanah dan 2.00 g toksin g-1 tanah, masing-masing. Bt strain B-JJX juga beracun
untuk larva 3-hari-tua dari kedua H. oblita dan H. parallela dengan LC50 1,72 g toksin g-1 tanah
dan 0,96 g toksin g-1 tanah, masing-masing (Tabel 1). Sebaliknya, HD-73- tidak menunjukkan
aktifitas insektisida untuk larva scarabaeid. Protein Bt strain B-JJX dan Cry8Ab1 tidak
menunjukan aktifitas insektisida terhadap larva coleopteran T. molitor, dan tiga larva
lepidopteran, H. armigera, S. exigua, dan M. separata pada konsentrasi 500 g toksin g-1.

T. molitor

Larva T. Molitor

S. exigua

DAFTAR PUSTAKA
Muharsini, S., A. H. Wardhana, H. Ruzaani, B. Amirhusein. 2003.
Characterization of Bacillus thuringiensis isolat from several areas in Java
and South Sulawesi for biological control of myasis, Chrysomya bezziana.
JITV 8(4): 256-263.
Suryanto, D. 2009. Amplifikasi Gen cry1 dan Analisis Genom Isolat Bacillus
thuringiensis Lokal. Berk. Penel. Hayati: 15 (14), 2009
Yamaguchi, T., Bando, H., & Asano, S. I. (2013). Identification of a Bacillus
thuringiensis Cry8Da toxin-binding glucosidase from the adult Japanese
beetle, Popillia japonica.Journal of invertebrate pathology,113(2), 123-128.
Zhang, Yuan, et al. "Cloning and characterization of a novel cry8Ab1 gene
from Bacillus thuringiensis strain B-JJX with specific toxicity to scarabaeid
(Coleoptera: Scarabaeidae) larvae."Microbiological research168.8 (2013):
512-517.