Isolasi Plasmid

Prinsip dan Tujuan

Sebelum melakukan tahap-tahap lanjutan dalam proses rekayasa genetika, peneliti harus
mendapatkan materi genetik yang diinginkan melalui teknik isolasi. Isolasi dilakukan dengan
tujuan untuk memperoleh DNA yang diinginkan dengan kualitas baik, yang dalam praktikum
kali ini adalah DNA plasmid. Terdapat dua metode yang dapat digunakan dalam melakukan
isolasi DNA plasmid, yaitu metode yang tertera pada kit yang digunakan dan metode alkalin
lisis. Prinsip dalam melakukan isolasi plasmid adalah penghancuran dinding sel, lisis sel,
pembersihan debris sel, dan presipitasi DNA. Prinsip-prinsip tersebut akan dibahas lebih
lanjut dalam bagian pembahasan.

Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan untuk metode alkalin lisis adalah larutan glukosa-EDTA (larutan A),
larutan SDS 10%, larutan NaOH 4N, Larutan KOAc/HOAc (larutan C) dingin, etanol 70%
dingin, etanol absolute dingin, Fenol CHCl3 Isoamilalkohol (25:24:1), dH2O steril, buffer
TE ph 8.0, dan E. coli DH5 (pUC19) yang telah ditumbuhkan selama 16 jam dalam medium
LB dengan penambahan antibiotik ampisilin. Adapun alat yang digunakan adalah sentrifuge
mikro, tabung mikro, pipet mikro dan tip, gelas beker, rak tabung mikro, bak es dan es,
tabung reaksi steril, dan vortex.

Namun, pada praktikum kali ini, praktikan menggunakan Prepease Plasmid Isolation Kit. Kit
tersebut terdiri atas buffer A1, buffer A2, buffer A3, minispin column-centrifuge, buffer A4,
dan buffer elusi. Untuk alat yang digunakan tidak berbeda dengan metode alkalin lisis.

Protokol (Metode Alkalin Lisis)

DH5 ditumbuhkan dalam medium LB+Amp (100 g/ml) pada suhu 37 oC secara aerobik
selama semalam. 1,5 ml kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikro. Tabung mikro
disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan dibuang. Kemudian,
pellet diresuspensikan dalam 110 l larutan A dan didiamkan pada suhu ruangan selama 5
10 menit. Sementara itu, larutan B dibuat dengan mencampurkan 4,25 ml dH2O steril, 0,5 ml

larutan SDS 10%, dan 0,25 ml larutan NaOH 4 N. Ke dalam tabung mikro, ditambahkan 200
l larutan B. Kemudian, tabung mikro dibolak-balikkan secara perlahan. Tabung mikro
diinkubasi pada suhu 0 oC (di atas es) selama 5 10 menit. Larutan C sebanyak 150 l
ditambahkan dan divortex kurang lebih 10 detik. Tabung mikro diinkubasi selama 5 10
menit di atas es. Tabung mikro disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 5000 rpm.
Supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru dan 0,5 ml campuran fenol kloroform
isoamil alkohol ditambahkan. Campuran divorteks sebentar sampai terbentuk suspensi dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil (jangan
sampai bagian fenol terambil) dan 1 ml etanol absolut dingin ditambahkan. Campuran
diinkubasikan pada 20 oC selama 10 menit. Kemudian disentrifugasikan dengan kecepatan
10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang. Pellet dicuci dengan 700 l etanol 70 %
dingin. Pellet dikeringkan dan disuspensikan 40 50 l buffer TE ph 8.0. Kemudian,
campuran disimpan dalam freezer dengan suhu -20 oC.

Protokol (Prepease Kit)

Kultur disiapkan dengan menginokulasikan bakteri ke media LB. Lalu, diinkubasi selama 24
jam sambil dishaking. Kultur bakteri dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasikan
selama 30 detik dengan kecepatan 11.000 rpm. Supernatan dibuang dan pellet
diresuspensikan dengan buffer A1. Campuran divortex. Buffer A2 ditambahkan ke dalam
suspensi dan dikocok perlahan (tidak menggunakan vortex). Kemudian, buffer A3
ditambahkan dan dikocok perlahan sampai suspensi berwarna keputihan. Campuran
disentrifugasi selama 5 10 menit dengan kecepatan 11.000 rpm. Lisat murni dimasukkan ke
minispin column-centrifuge. Lalu, lisat dicuci dengan buffer A4 atau wash buffer. Kemudian
campuran disentrifugasi. Campuran kemudian dikeringkan dan disentrifugasi kembali. Buffer
elusi ditambahkan dan diinkubasi selama 1 menit. Campuran disentrifugasi.

Gambar X. Protokol Kerja Prepease Plasmid Isolation Kit

Pembahasan
Isolasi yang dilakukan pada DNA genomik dan DNA plasmid menggunakan prinsip yang
sama. Namun, terdapat beberapa perbedaan pada metode yang digunakan. Pada isolasi DNA
plasmid, untuk melakukan lisis sel juga menggunakan larutan NaOH. Selain itu, pada metode
DNA plasmid, dilakukan renaturasi untuk memisahkan DNA genomik dan DNA plasmid.
Metode alkalin lisis menghasilkan yield yang lebih rendah dibandingkan menggunakan kit
yang tersedia. Pada saat terjadi denaturasi, DNA genomik, yang terdiri atas untaian panjang,
akan menjadi kusut sehingga sulit untuk terrenaturasi kembali. Hal ini tidak terjadi pada
DNA plasmid yang dapat dengan mudah terrenaturasi.
DNA plasmid dan DNA genomik memiliki beberapa perbedaan mendasar. DNA plasmid
memiliki struktur supercoiled pada struktur tersiernya, sedangkan DNA genomik memiliki
struktur linier. Dikarenakan struktur tersier yang berupa supercoiled, DNA plasmid memiliki
berat yang lebih dibandingkan DNA genomik. Perbedaan berat dapat digunakan untuk
membedakan kedua DNA pada ultrasentrifugasi, dimana DNA plasmid berada di bawah.
Metode ultrasentrifugasi CsCl / Ethidium Bromida dilakukan untuk isolasi pada skala yang
lebih besar. Perbedaan berat tersebut juga dapat diamati melalui elektroforesis gel agarosa.

Terdapat beberapa tahapan dalam melakukan isolasi DNA plasmid. Tahapan pertama adalah
penghancuran dinding sel. Penghancuran dinding sel dapat dilakukan secara mekanis ataupun
enzimatis. Tahapan berikutnya adalah melakukan lisis pada sel. Pada metode alkalin lisis,
digunakan larutan SDS dan NaOH untuk melakukan lisis. Cara dan bahan yang digunakan
pada penghancuran dinding sel dan lisis sel bergantung pada jenis bakteri yang digunakan
juga. Misalnya lisozim digunakan pada bakteri Gram positif. Kemudian, organel-organel sel
yang tidak diinginkan (debris sel) dibersihkan dengan cara memecah protein penyusun
organel-organel sel tersebut. Pemecahan dapat menggunakan proteinase-K. Debris sel yang
telah dipecah kemudian diekstraksi dengan menggunakan pelarut organik. Kemudian, DNA
yang berada pada fase air dipresipitasi dengan menggunakan alkohol. Ketika menggunakan
kit, DNA yang diinginkan tidak dipresipitasi, melainkan dijerat dengan menggunakan kolom
yang disediakan kit.
Penyimpanan DNA yang diinginkan dapat menggunakan buffer TE. Buffer TE bekerja
dengan cara mengkhelat logam yang bekerja sebagai kofaktor enzim DNAse sehingga tidak
terjadi degradasi pada DNA. Namun, buffer TE juga dapat menyebabkan enzim polimerase
tidak aktif. Selain menggunakan buffer TE, suhu rendah (-20 oC) dapat digunakan untuk
mencegah aktifnya enzim DNAse.

Karp, Gerald. 2010. Cell and Molecular Biology. Denver, AS : Johns Wiley & Sons Co.
Malik, A. 2012. Penuntun Kerja : Isolasi Plasmid dan Kloning DNA. Depok : Departemen
Farmasi FMIPA UI.
Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.