Judul Laporan Akhir : Validasi Metode Penentuan Total Fenol dalam Ekstrak Daun

Jambu Biji dan Rimpang Temu Hitam

Pemrasaran/NIM
: Anisa Maulida / J3L213092
Pembahas 1/NIM
:
Hari/Tanggal
:
Waktu
:
Ruangan
:
Dosen Pembimbing : Harry Noviardi, MSi
Menyetujui,

Harry Noviardi, MSi

1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Radikal bebas sering dikaitkan dengan sumber kerusakan struktur dan fungsi sel
manusia. Reaksi radikal bebas di dalam tubuh tidak dapat dihindari namum dapat
diperlambat dengan mengkonsumsi senyawa yang mengandung antioksidan.
Antioksidan berfungsi mencegah atau memperlambat terjadinya kerusakan dengan
cara mendonorkan atom hidrogen sehingga radikal dapat stabil dan menjadi non aktif
(Adam 2013). Fenol merupakan senyawa yang banyak terkandung dalam tanaman.
Struktur fenol yang memiliki gugus hidroksil yang terikat pada cincin benzena,
membuat senyawa ini dapat berfungsi sebagai penyumbang atom hidrogen ketika
bereaksi dengan senyawa radikal. Hal inilah yang membuat fenol dikenal luas sebagai
antioksidan.
Penentuan total fenol dilakukan secara spektrofotometri dengan metode Folin
Ciocalteu yang ditetapkan oleh Farmakope (2011). Metode tersebut belum tervalidasi,
sehingga untuk menjamin metode yang digunakan tetap memberikan hasil yang baik
perlu dilakukan validasi metode. Validasi metode adalah suatu tindakan penelitian
terhadap parameter tertentu, berdasarkan pada percobaan laboratorium untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya. Parameter pengujian yang dilakukan ialah linearitas, presisi, akurasi,
batas deteksi dan batas kuantitasi (Harmita 2004).
1.2 Tujuan
Praktik Kerja Lapang bertujuan memvalidasi metode penentuan total fenol
dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L) dan rimpang temu hitam
(Curcuma aeroginosa) secara spektrofotometri sinar tampak.

2 BAHAN DAN METODE

2.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan meliputi Spektrofotometer UV-Vis U2800, alat-alat
gelas, rak tabung, kuvet, vorteks, pipet mikro dan tips.
Bahan-bahan yang digunakan antara lain simplisia jambu biji, simplisia temu
hitam, etanol teknis 96%, metanol pro analyst (Merck) , Folin Ciocalteu 7.5%
(Merck), NaOH 1% (Merck) , akuades, asam galat (Sigma aldrich).
2.2 Lingkup Kerja
2.2.1 Total Fenol (Farmakoe 2011)
Larutan uji dipipet sebanyak 1 mL lalu ditambahkan 5 mL pereaksi Follin
Ciocelteau 7.5% ke dalam tabung reaksi. Setelah itu dihomogenkan dan diinkubasi
diruang gelap selama 8 menit. Kemudian ke dalam tabung yang sama ditambahkan
NaOH 1% sebanyak 4 mL dan diinkubasi di ruang gelap selama 1 jam. Larutan
langsung diukur absorbansinya pada panjang gelombang 730 nm.
2.2.2 Linearitas
Uji linearitas dilakukan dengan cara membuat larutan standar induk 100 mg/L
Deret standar dibuat konsentrasi 5; 15; 30; 50; 70; dan 100 mg/L, masing-masing
dibuat dengan cara memipet 1.25; 3.75; 7.5; 12.5; 17.5 dan 25 mL dari larutan 100
mg/L ke dalam labu takar 25 mL, kemudian ditera dengan larutan metanol p.a.
Selanjutnya prosedur dilakukan seperti pada poin 2.2.2. Pengujian dilakukan 6 kali
ulangan.
2.2.3 Presisi
Uji presisi dilakukan menggunakan sampel ekstrak konsentrasi 1000 mg/L,
sebanyak 25 mg sampel ekstrak ditimbang dalam labu takar 25 mL dan ditera dengan
metanol p.a. Selanjutnya prosedur dilakukan seperti pada poin 2.2.2. Pengujian
dilakukan 7 kali ulangan.
2.2.4 Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan menambahkan sejumlah standar asam galat ke
dalam sampel. Standar asam galat dibuat dalam konsentrasi 500 mg/L dan diencerkan
untuk mendapatkan konsentrasi akhir standar 5, 10, dan 15 mg/L. Sebanyak 25 mg
sampel ekstrak ditimbang dalam labu takar 25 mL, kemudian ditambahkan 2.5; 5; dan
7.5 mL standar asam galat pada masing masing labu takar dan ditera dengan metanol
p.a. Selanjutnya prosedur dilakukan seperti pada poin 2.2.2. Pengujian dilakukan 7
kali ulangan.
2.2.7 Batas deteksi dan batas kuantitasi
Uji batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung secara statistik melalui regresi

linear dari kurva kalibrasi standar asam galat. Nilai simpangan baku residual
(Sy/x) dihitung dari absorbans dan regresi linear kurva kalibrasi. Kemudian nilai Sy/x
yang didapatkan dikali 3 untuk batas deteksi serta dikali 10 untuk batas kuantitasi dan
dibagi dengan kemiringan atau slope (b).

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Penentuan total fenol dalam sampel jambu biji dan temu hitam dilakukan sesuai
metode yang ditetapkan oleh Farmakope (2011) dengan pereaksi Folin-Ciocalteu.
Metode tersebut
didasarkan kepada kemampuan reagen Folin-Ciocalteu
mengoksidasi gugus hidroksil (OH-) dari senyawa golongan fenol. Senyawa fenolik
mereduksi fosfomolibdat fosfotungstat dalam Folin-Ciocalteu membentuk kompleks
molibdenum yang berwarna biru. Kompeks berwarna tersebut diukur pada daerah
sinar tampak (Rumayati et al. 2014).
3.1 Linearitas
Linearitas adalah kemampuan suatu metode analisis dalam memberikan respon
secara langsung terhadap hasil yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit
dalam rentang tertentu. Pengujiaan dilakukan dengan membuat deret standar 5, 15,
30, 50, 70, dan 100 mg/L dengan 6 kali pengulangan. Berdasarkan hasil yang
didapatkan pada Gambar 1 menghasilkan persamaan regeresi linear y = 0.0007 +
0.009x.
1.000
Absorbans

f(x) = 0.01x + 0
R = 1

0.500
0.000
0

20

40

60

80

100

Konsentrasi Asam galat (mg/L)

Gambar 1 Hubungan konsentrasi asam galat dengan absorbans

Nilai koefisien determinasi (R) yang diperoleh dari deret standar sebesar
0.9998. Nilai tersebut memiliki nilai linearitas yang baik karena nilai R yang
mendekati 1.0 dan memenuhi persyaratan ICH dalam Chan et al. (2004), yaitu
0.997.
3.2 Presisi
Uji presisi dilakukan dengan menggunakan sampel ekstrak jambu biji dan temu
hitam yang diukur sebanyak 7 kali ulangan, baik interday maupun intraday. Presisi
interday akan didapatkan data dalam satu hari pengukuran dan presisi intraday akan

didapatkan data dalam tiga hari pengukuran. Menurut Harmita (2004), presisi
diterima apabila nilai Simpangan Baku Relatif (SBR) 2%. Presisi metode
penentuan total fenol dalam sampel jambu biji dan temu hitam disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil uji presisi interday dan intraday sampel jambu biji dan temu hitam
Sampel

Kadar (%b/b)

Jambu Biji
Temu Hitam

36.9
5.32

SBR (%)
Interday
0.60
0.97

Intraday
0.39
1.5

Berdasarkan hasil pengukuran presisi interday, didapatkan rerata kadar

(%b/b) total fenol dalam jambu biji dan temu hitam secara berurutan sebesar
36.9 dan 5.32% b/b. Hasil %SBR pada sampel jambu biji dan temu hitam
secara berurutan sebesar 0.60 dan 0.97%. Uji presisi intraday, didapatkan
%SBR pada sampel jambu biji dan temu hitam secara berurutan sebesar 0.39
dan 1.5%. Nilai tersebut menunjukkan bahwa metode penentuan total fenol
pada kedua sampel memberikan presisi yang baik karena masih memiliki nilai
SBR 2%.
3.3 Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan menambahkan asam galat ke dalam sampel 1000
mg/L dengan tiga konsentrasi yaitu 5, 10 dan 15 mg/L yang dicampurkan ke dalam
sampel jambu biji dan temu hitam dengan konsentrasi 1000 mg/L dan diukur
absorbansnya. Nilai absorbansi yang didapatkan, dinyatakan dalam konsentrasi
terukur untuk menghitung persen perolehan kembali dari ketiga tingkat standar asam
galat. Metode penentuan fenol dikatakan akurat apabila memenuhi syarat nilai
perolehan kembali dengan rentang 98-102% (Chan et al. 2004). Hubungan
konsentrasi asam galat dengan persen perolehan kembali dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil uji akurasi sampel jambu biji dan temu hitam
Sampel
Jambu biji
Temu hitam

5
99.81
99.81

% Perolehan kembali
10
15
99.32
99.71
100.16
99.60

Hasil uji akurasi pada sampel jambu biji dan temu hitam pada tiga tingkat
konsentrasi menghasilkan persen perolehan kembali yang masih masuk ke dalam
rentang yang diacu. Sampel Jambu biji memberikan rerata nilai persen perolehan
kembali pada konsentrasi 5, 10 dan 15 mg/L secara berurutan sebesar 99.81, 99.32,
dan 99.71% dan sampel temu hitam memberikan rerata nilai persen perolehan
kembali secara berurutan sebesar 99.81, 100.16, dan 99.60%.

3.4 Batas deteksi dan Batas Kuantitasi

Uji batas deteksi dan batas kuantitasi ditentukan dari persamaan linear regresi
kurva standar rerata hasil penentuan linearitas. Batas deteksi ditentukan untuk
mengetahui konsentrasi analit terendah yang dapat diukur dan antara sinyal derau
dengan analit dapat dibedakan. Sedangkan batas kuantitasi ditentukan untuk
mengetahui konsentrasi terendah yang dapat ditentukan oleh suatu metode pada
tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik (Kriswanto et al. 2014). Nilai Batas deteksi
dan batas kuantitasi merupakan 3 kali dan 10 kali simpangan baku residual (Sy/x) dan
kemudian dibagi dengan kemiringan (b). Berdasarkan pada nilai yang didapatkan dari
batas deteksi dan batas kuantitasi sebesar 1.7 dan 5.7 mg/L.

4 SIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan pada hasil validasi metode penentuan total fenol dalam daun
jambu biji (Psidium guajava L) dan rimpang temu hitam (Curcuma aeruginosa)
secara spektrofotometri sinar tampak, dengan parameter uji linearitas, presisi, akurasi,
batas deteksi dan batas kuantitasi. Uji linearitas diperoleh koefisien determinasi
0.9998. Uji presisi telah memenuhi syarat presisi pada %SBR 2%. Uji akurasi
didapatkan hasil yang berada dalam kisaran syarat keberterimaan 98-102%. Uji batas
deteksi dan batas kuantitasi pada konsentrasi 1.7 dan 5.7 mg/L. Berdasarkan pada
data validasi tersebut, metode yang digunakan untuk menentukan total fenol dalam
sampel jambu biji dan temu hitam telah valid dan dapat digunakan dalam analisis
rutin.
Pengujian parameter validasi metode ini dapat dilakukan parameter validasi lain
seperti selektivitas, ketangguhan, kekuatan, dan stabilitas.

DAFTAR PUSTAKA
Adam C. 2013. Penentuan total fenol dan aktivitas antioksidan ekstrak daun leilem
(Clerodendurum minahassae). Jurnal Ilmiah Mahasiswa Universitas Sam
Ratulang: 1-5
Chan CC, Lam H, Lee YC, Zhang XM. 2004. Analytical Method Validation and
Instrument Performance Verification. Canada (US): A John Wiley & Sons Inc.
Depkes RI. 2011. Farmakope Herbal Indonesia Edisi I. Jakarta (ID): Departemen
kesehatan Republik Indonesia. Hal: 110.
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksananaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(3): 117-135
Rumayati, Idiawati N, Destiarti L. 2014. Uji aktvitas antioksidan, total fenol dan
toksisitas dari ekstrak daun dan batang lakum (Cayratia trifolia (L) Domin).
Jurnal Kimia Khatulistiwa. 3(3): 30-35.