PRAKTIKUM X

A. Judul
Pewarnaan Gram
B. Tujuan Praktikum
Mengetahui perbedaan bakteri gram positif dengan gram negative
C. Dasar Teori
Kata mikrobiologi berasal dari bahasa Yuniani, yaitu: micros = kecil, bios =
hidup, logos = ilmu. Jadi mikrobiologi adalah ilmu pengetahuan yang
mempelajari organisme hidup yang kecil yang hanya dapat dilihat dengan
mikroskop. Organisme yang dipelajari dalam mikrobiologi yaitu mikroorganisme,
yang meliputi bakteri, virus, jamur, protozoa.
Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel.
Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit,
sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan,
pengobatan, dan industri. Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti
sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal
inilah yang menjadi dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang
lebih kompleks (Adam, 2001).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.
Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak),
diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada
spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik
pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri
gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna
merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya
dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai.

Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena
kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan
sampai kondisi menjadi baik (Dwijoseputro. 1981).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
(Manurung, 2010).
Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik
Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas
2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet
(ungu) karena mengikat zat warna utama kristal violet. Sedangkan Gram negatif
berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat
warna penutup fuchsin. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4
tingkatan yaitu :
1.

Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang

warnanya violet).

2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan

lugol (J-KJ).
3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau
alkohol-asam.
4. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling

banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat
warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya

bersifat

basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan
karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis
pewarnaan.
pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan
tujuan hanya
untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah
metilen biru dan air furksin.
Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan
morfologi
dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram
positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.

Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans

Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan
zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna
merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

D. Alat dan Bahan

1. Alat

Pembakar bunsen

Pipet tetes

Jarum ose

aquadest

Tisu

Kaca objek

2. Bahan

Etanol 96%

Lugol

Alkohol 70%

Ungu violet

safranin

E. Prosedur Kerja
Ditetesi sediaan dengan 2-3 tetes ungu violet, diamkan selama 1 menit

Dibilas sediaan dengan air

Dikeringkakn menggunakan tissue

Ditetesi dengan lugol (mordan) dan dibiarkan selama 2 menit

Dicuci dengan air dan dikeringkan

Ditetesi dengan larutan peluntur (etanol 96%) selama 30 detik

Diberi larutan cat penutup (safranin) selama 30 detik

Dicuci dengan air lalu dikeringkan diudara

Diamati sediaan dibawah mikroskop

Hasil pengamatan

F. Hasil Pengamatan

Keterangan :
Bentuk
: basil
Gram
: positif

G. Pembahasan
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif

memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
(Manurung, 2010).
Pada praktikum kali ini, kami melakukan teknik pewarnaan gram yang
ditujukan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, grampositif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Proses pewarnaan bakteri diawali dengan bakteri ditetesi kristal violet dan di
diamkan selama satu menit. pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat
melekat sempurna pada dinding bakteri sehingga pengikatan warna oleh bakteri
menjadi lebih kuat. Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan
reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama)
yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam.
Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu) (Dwijoseputro, 1981).
Setelah ditetesi dengan ungu violet, preparat dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan, dicuci di air mengalir agar sisa-sisa dari warna ungu violet
tersebut terbawa air. setelah itu ditetesi dengan lugol dan dibiarkan selama 1 menit,
Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna
utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri (Aditya, 2010).
kemudian dicuci dengan air dan dikeringkan. Setelah itu ditetesi larutan
alkohol 96%, tetes demi tetes selama 30 detik. Hal ini dimaksudkan karena alkohol
dapat membuat bakteri tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat
sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan
tidak ada yang tersisa. dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada
bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak
tercampur dengan warna yang baru. Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas
10

kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek
dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna
tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali selsel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target
serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke
dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram
negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori pori (Purwoko,2004).
Setelah diberi safranin, dicuci kembali dengan aquadest dan diamati
dibawah mikroskop. Dari hasil pegamatan yang dilakukan sampel bakteri bersifat
sebagai gram positif dilihat dari warnanya bakteri tersebut berwarna ungu. Bakteri
gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Kemungkinan kesalah yang terjadi adalah kurang hati-hati dan teliti pada saat
pewarnaan bakteri.

H. Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini, yaitu pada
pewarnaan gram yaitu bakteri yang diuji ternyata bersifat gram positif. Dimana gram
positif tersebut memiliki peptidoglikan yang tebal.

11

DAFTAR PUSTAKA
Adam, M dan Y. Motarjemi. 2001. Dasar-Dasar Keamanan Pangan untuk
Petugas Kesehatan. Peterjemahan : Maria A. Wijayarini. EGC. Jakarta.
Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri.EGC. Jakarta
Dwijoseputro. 1981. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Surabaya.

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri.egc. jakarta

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium

Mikrobiologi UNS.

12

LAMPIRAN
Pertanyaan :
1. Sebutkan beberapa factor yang mempengaruhi pewarnaan
2. Buatlalh ikhtisiar pengecetan gram
3. Jelaskan 2 mekanisme pewarnaan mikroba
Jawab:
1. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu
- Fiksasi
- peluntur warna
- Substrat
- intensifikasi pewarnaan
- penggunaan zat warna penutup.
2.
Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif
dan

negatif,

yang

salah

satunya

berwarna

dan

disebut

kromosfor

(chromosphore). Bila kromosfor berada pada ion positif disebut pewarna basa
(basic dye) dan bila kromosfor berada pada ion negatif disebut sebagai
pewarna asam (acidic dye)
Macam dan Fungsi Pewarnaan
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain).
Pada pewarnaan sedarhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan
mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur
dasarnya dapat terlihat
Menurut Zubaidah (2006), yaitu banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna)
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis.
Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk :
- Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme

13

- Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa.

Macam-macam pewarnaan adalah :
- Pewarnaan sederhana : pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad
renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada
lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
-

sederhana.
Pewarnaan diferensial : prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan

di antara sel-sel mikroba disebut pewarnaan diferensial.

Pewarnaan gram : salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling
penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram.
Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua
kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram

negatif
3. Ada dua macam mekanisme pewarnaan gram yaitu :
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Dengan metode pewarnaan
Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan
Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena
itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong
bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu
dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki
sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga
menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna
yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan
biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

14

 Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam
konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi
zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan
menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur
yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri
tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri
penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara
pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut ZiehlNeelsen.

15