Analytical Biochemistry 421 (2012)

4355

Daftar isi tersedia pada SciVerse ScienceDirect

halaman utama
Biochemistryjournal Analisa:

Alat bantu Proteomic untuk penyelidikan terhadap rambut

manusia protein struktural dan bukti kelemahan situs-situs pada
rambut keratin segmen slab
Nikolaus R. Barthlemy a,1, Audrey Bednarczyk
Jullien b,
Alain Van Dorsselaer a, Nkhet Cavusoglu b,

a,1

, Christine Schaeffer-Reiss a, Dominique

Sebuah
B

IPHC, CNRS, UMR 7178, 67087 Universit de Strasbourg, Strasbourg, Prancis

Laboratoire de Protomique et menganalisa des Protines, L'Oral Penelitian dan Inovasi, 93601 Aulnay-sous-Bois, Prancis

Sebuah r t aku c l e
aku n f ya
Pasal sejarah:
Menerima 5 Mei 2011
Diterima dalam bentuk direvisi 3
Oktober 2011 diterima tanggal 5
Oktober 2011
Tersedia online 12 Oktober 2011
Kata
Kunci: rambut
manusia
Proteomic
Rambut
spectrometry
keratins massal
Modifikasi Posttranslational
2-DE gel
MudPit
Pemetaan Peptida

Sebuah b s t r sebuah c t
Rambut manusia adalah terutamanya terdiri atas keratins rambut dan keratin-dikaitkan
protein (KAPs) yang membentuk jaringan yang kompleks memberikan rambut-kekakuan
dan sifat mekanis. Namun, selama pertumbuhan mereka, bulu perihal untuk berbagai
pengobatan yang dapat mendorong menimbulkan kerusakan. Untuk pemahaman yang
lebih baik tentang rambut manusia struktur protein, proteomic spectrometry massal (MS)
strategi berbasis dapat membantu dalam characterizing banyak isoforms dan
posttranslational modifikasi pada rambut manusia fiber protein. Namun, karena properti
physicochemical mereka, karakterisasi protein rambut manusia menggunakan pendekatan
proteomic klasik masih merupakan tantangan. Untuk mengatasi masalah ini, kita telah
menggunakan dua pendekatan pelengkap untuk menganalisa protein dari korteks rambut
manusia. Teknologi identifikasi protein multidimensi yang (MudPit) pendekatan diizinkan
mengenali semua keratins dan KAPs utama yang ada dalam rambut serta posttranslational
modifikasi dalam keratins seperti cysteine trioxidation, Lisin, dan histidine methylation.
Kemudian dua dimensi gel electrophoresis dipasangkan dengan MS (2-DE gel MS)
memungkinkan kami untuk mendapatkan paling lengkap 2-DE pola gel dari rambut
manusia protein, menyatakan heterogene tidak terdugaStruktur ity dari keratin. Menganalisis struktur ini oleh pemetaan peptida diferensial telah
membawa ewi- penuh percaya diri dari spesies melekat pada rambut keratins dan
mencadangkan suatu zona melanggar istimewa dalam -helical segmen.
2011 Reed Elsevier Inc. Semua
hak cipta dilindungi undang-undang.

Selama beberapa dekade terakhir, sebagian besar

penelitian mengenai keratin protein telah umumnya
difokuskan pada susunan kimia dari bahan wol untuk
tujuan mengembangbiakkan dan tekstil. Namun, selama
tahun-tahun terakhir ini, penyidikan pada rambut
manusia protein telah pertemuan dengan perhatian
yang semakin berkembang, terutama di bidang dan
kosmetik dermato- ilmu logis. Pemahaman yang lebih
baik tentang bahan biologis ini dan organisasi struktural
dari rambut manusia protein
dapat membantu
pengembangan produk dan penyakit lainnya yang
berpotensi yang berkaitan dengan isu-isu yang terkait
dengan rambut dan folikel rambut protein [1,2].
Rambut luar ini terbuat dari sel-sel mati terdiri terutama
dari protein-protein yang mewakili berbagai 60-95% dari
total komposisi kimia. Konstituen yang lain adalah lemak,
air, dan logam tingkat yang mungkin berbeda-beda,
tergantung pada rambut [3].

Serat rambut dapat dibagi menjadi tiga komponen

umum [4]: (i) sebuah lapisan sel cangkang luar, (ii)
sebuah korteks bagian dalam, dan (iii) sebuah pusat
aku-

penulis yang bersangkutan. Fax: +33 01 48 68 97 73.

Alamat E-mail: ncavusoglu@rd.loreal.com (N. Cavusoglu).
1
para penulis ini memberikan kontribusi yang sama untuk
pekerjaan ini.

Dulla (dalam beberapa kasus). Korteks yang berisi jenis sel

yang berbeda, dan masing-masing sel berisi 500-800 keratin
2
intermediate filamen (Anak) yang merupakan protein utama
menyatakan dalam rambut manusia. Anak manusia terdiri dari
keratin protein yang dapat disortir ke dua fami- terletak: (i)
jenis asam yang saya keratins (K31-K 38 tahun, yang berisi 9
anggota) dan (ii) netral jenis dasar II keratins (K81-K86, yang
berisi 6 anggota) [5,6]. Interaksi rumit dari jenis tipe I dan II
kera- hasil kaleng dalam pembentukan heteropolymers [1,7
9].
Protein-protein ini dikelilingi oleh sebuah matriks maya
terdiri dari atin ker--dikaitkan protein (KAPs). 26 PSP
keluarga mewakili

Singkatan digunakan: KIF, keratin filamen peralihan; Psp, keratin protein

yang berhubungan dengan; HSP, protein sulfur tinggi; UHSP, ultra--tinggi
belerang; HGTP protein,-: glisin-tinggi protein tirosin;, UV sinar ultraviolet;
PTM, modifikasi posttranslational; MS, spectrometry massal; 2-DE gel, dua
dimensi gel electrophoresis, pI, titik isoelectric; MW, Berat Molekul; 2D, dua
dimensi; MudPit, teknologi identifikasi protein multidimensi; SCX, metal
exchange; nanoLC kuat-MS/MS, nano-liquid chromatography ditambah
untuk tandem MS; SDS, sodium dodecyl sulfat; DTT, DL-dithiothreitol;
Na2HPO4, disodium hydrogen fosfat; NH 4HCO3,- nium amunisi bikarbonat;
HPLC, performa tinggi liquid chromatography; CID, benturan- proses
disosiasi diinduksi oleh; UPLC, ultra-Performance Liquid Chromatography;
TOF) waktu,- terbang.

0003-2697/$ - lihat hal depan 2011 Reed Elsevier Inc. Semua hak cipta dilindungi
undang-undang. doi:10.1016/j.ab.2011.10.011

44
(2012) 43-55

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421

Lebih dari 100 KAPs dengan urutan tinggi di setiap

keluarga homologi.
Komponen-komponen ini membentuk kuat dan ringkas
jaringan rumit dari protein diikat bersama oleh intra- dan
lembaran-lembaran itu kemudian saling bertumpuk
interac- N MENGHUBUNGI RIM DI legalinfo@rim.com.
seperti hubungan disulfide, obligasi hidrogen, pelepasan
muatan garam obligasi, dan obligasi amide [11,12].
Berbagai obligasi internal ini sangat penting untuk
memberi
kekakuan
kepada
struktur
rambut
dan
membuatnya tahan terhadap faktor-faktor lingkungan,
seperti sinar ultraviolet (UV) expo- yakin, polutan, dan
cuaca, atau pengobatan kimia
[3].
Walaupun ekspresi jenis tipe I dan II keratins dan KAPs
folikel pada rambut adalah didirikan, ekspresi mereka pada
mature
rambut,
modifikasi
(PTMs
posttranslational
mereka), dan cara-cara mereka dapat diubah dalam poros
rambut tetap tidak jelas. Peran mereka dalam bentuk dan
kualitas rambut, serta mekanisme yang terlibat, tidak
dikenali [10,11].
Dapat membantu dalam characterizing Proteomics
banyak isoforms dan PTMs serat rambut manusia protein.
Beberapa
tantangan-tantangan
melakukan
tetap
mengenai
karakterisasi
protein
rambut
dengan
menggunakan spectrometry massal umum (MS) strategi
berbasis. Kebanyakan menghadapi tantangan-tantangan
ini disebabkan oleh insolubility rambut protein-protein dan
kesulitan mengekstrak- ing dan solubilizing protein pada
bahan pelarut yang kompatibel dengan gel electrophoresis
atau liquid chromatography. Selain itu, sebagian besar
protein adalah keratins rambut, dan isu memisahkan dan
mendeteksi protein (misalnya minor, KAPs) adalah masih
bersikap kritis. Mengenai dy ini- namic masalah jangkauan,
urutan tinggi dari homologi rambut manusia keratins (7090%) dan KAPs menaikkan sebuah tantangan tambahan
utama yang memerlukan keahlian yang tinggi untuk
menafsirkan
dibuat
data
massal
dan
mengenali
protein [1316]. Jumlah kecil peptides unik yang disebut
proteotypic peptides merupakan masalah tambahan untuk
mengatasi, untuk menentukan anggota tertentu dari
keluarga ini ada dalam contoh.
Sejauh ini, hanya beberapa pendekatan proteomic telah
dijelaskan di jalan menganalisis rambut manusia protein.
Studi pertama pada ker- atin protein adalah berdasarkan
electrophoresis pemisahan dan telah dilakukan pada bulu
domba keratins [17]. Studi-studi serupa melaporkan pada
rambut manusia keratins yang dikenali oleh dua dimensi
gel electrophoresis (2-DE gel) dan analisis pemaaf Barat
menggunakan anti- badan-badan khusus untuk setiap
anggota keluarga [5,6,14]. Dalam 2-DE gel dari hu- rambut
manusia keratins menunjukkan pola yang serupa dengan
corak dari bahan wol keratins, dengan kereta api yang
panjang dari protein dalam 62-area kDa antara titik
isoelectric (pI) 5 dan paku 7, yang setara dengan type II
kera- kaleng, dan sebuah gugus protein dengan biaya yang
lebih psaya dan berat molekul (MW), yang sesuai untuk
mengetikkan aku anak (paku 4-5, MW = 45 kDa). Akantipikal ini sisi 2-DE pola gel, beberapa bintik-bintik lain
muncul di bagian bawah MW bagian dari gel.
Namun, kebanyakan dari dua dimensi (2D) studi gel
pada poros rambut manusia telah menunjukkan hanya
yang kuat expres- siryon dari beberapa jenis I keratins
(K31, K33a, K33b, K34, dan K35) dan ketikkan II keratins
(K81, K82, K83, K85, dan K86) tanpa MS identifications [18].
Sebagai
metode
alternatif
untuk
menganalisis rambut manusia protein, Lee dan rekan kerja,
mengusulkan protein multidimensi teknologi identifikasi
(MudPit). Pendekatan ini di- volved memisahkan ikatan
peptida campuran kompleks akibat dari pencernaan
protein rambut total mengekstrak oleh metal dan kuat
keluaran- Mengubah (SCX) chromatography diikuti oleh
fasa membalik nano-liquid chromatography ditambah

untuk tandem MS (nanoLC- MS/MS) [19,20]. Pendekatan ini,

yang menghapuskan solubility (tali)- lems dan penindasan
sinyal karena tingginya jumlah gener- ated peptides,
diizinkan para penulis untuk mengenali keratins rambut,
KAPs, dan banyak protein yang terlibat dalam pembentukan
dan struc- tural organisasi poros rambut. Selain itu, Lee dan
coworkers
menunjukkan
bukti
posttranslational
methylation, dimethylation, dan trimethylation pada rambut
protein [21].
Dalam studi saat ini, kita menyelidiki sebuah pendekatan
berdasarkan kombinasi gel 2D dan 2D LC diikuti oleh
nanoLC-MS/MS untuk meningkatkan identifikasi rambut
manusia protein.

Metode dan bahan-bahan

Ekstraksi Protein
Semua bulu sampel yang digunakan dalam riset ini
membentuk dalam serangkaian- ing akibat rambut kepala
dari 3 individu. Prosedur ekstraksi berbeda diterapkan
sesuai dengan metode analisa yang digunakan. Sebelum
pengambilan sampel rambut, telah delipidated oleh serat
perendaman
dalam
ethanol
dan
kemudian
di
cyclohexane.
Ekstraksi protein untuk 2D LC
Contoh rambut telah diekstrak mengikuti proce
eksperimental- dure dijelaskan oleh Lee dan rekan
kerja [21]. Waktu singkat setelah delip- idation, protein
telah diekstrak di sebuah solusi yang berisi 2% dodecyl
sulfat natrium (SDS), 50 mM natrium fosfat (pH 7.8), dan
20 mM DL-dithiothreitol (DTT) dan telah incubated
kemaren
malam
pada
65 terwujudnyaC.
Setelah
Sentrifugasi, bahan chelat telah disampaikan kepada
sebuah prosedur ekstraksi berulang (6 kali) seperti yang
dijelaskan, akhirnya memberikan dua contoh-contoh:
sebuah chelat dan bahan
bahan larut air.
Ekstraksi protein untuk 2D jeli dalam
Protein telah diekstrak di sebuah solusi yang berisi 7
M, 2 M thiourea urea, 50 mM Tris-HCl, 50 mM DTT, dan
0,1% Triton X-100 untuk 18 h di 37 terwujudnyaC. Protein
mengekstrak
dikumpulkan
melalui
dan
kemudian
alkylated penyaringan dengan solusi 1 M iodoacetamide
dan 3 M Tris-HCl pada pH 8.4 untuk 10 mnt dalam gelap
pada suhu kamar. Solusinya adalah dengan 3500-MWCO
dialyzed (berat molekulnya) pemutusan kaset dialisis
(Pierce, Rockford, IL, USA) terhadap air selama 48 jam.
Solusi ini kemudian lyophilized dan membekukan-contoh
kering telah disimpan dalam sebuah -80 C freezer.
Pemisahan dan MS/MS analysis
Pencernaan protein dan ikatan peptida pemisahan oleh
SCX chromatography

Kedua soluble dan chelat-mengekstrak incubated

rambut untuk 1 h di 57 terwujudnyaC di 2% DTT SDS, 20
mM, dan 50 mM disodium fosfat hidrogen (Na 2HPO4) untuk
mengurangi
semua
kelompok-kelompok
cysteine.
Mengurangi cyste- ines kemudiannya alkylated dengan
menambahkan 40 mM iodoacetamide untuk 1 h dalam
gelap. Protein adalah dengan tergesa-menambah volume
2,5 ethanol dan dicuci dua kali dengan 70% ethanol untuk
menghapuskan SDS, DTT, Na2HPO4, dan iodoacetamide
kelebihan. Akhirnya, protein adalah resus- pended dalam
100 mM amonium bikarbonat (NH 4HCO3) dan 2 M urea dan
telah dicerna kemaren malam pada 37 C dengan
menambahkan dimodifikasi porCine trypsin dalam rasio 1 bagian dari berat enzim untuk
20 Bagian-bagian pro- tein yang berat.
Kedua tryptic campuran peptida adalah fractionated
dengan air 625 LC System (Air, Milford, MA, USA) dengan
menggunakan PolySULFOETHYL sebuah kolom (100 2,1 mm, 5 lm saya.d., 300 "ukuran
pori, PolyLC,
Columbia, MD, USA) bekerja dengan laju aliran 200 ll/mnt.
Setelah
Contoh-contoh ini dimuat, sebuah 15-min isocratic
menjalankan dengan 100% pelarut sebuah (5 mM
KH.2PO4 dan 25% acetonitrile, pH 3.0) dilakukan. Pep-pasang surut eluted menggunakan dua langkah-berupa
arsiran dari (i) 0 hingga 25% dari sol- tutup lubang B (5
mM KH.2PO4, 350 mM KCl, dan 25% acetonitrile, pH 3.0)
dalam 30 menit untuk (ii) 25-100% dari pelarut B di 20 mnt
dua menit pecahan interval dikumpulkan, yang terpusat
oleh penyedot sentrifugasi, dan desalted menggunakan tip
Pipette ZipTip C18 (Millipore, Bedford, MA, USA). Total 35
pecahan dari masing-masing soluble dan chelat tryp- tic
bahan pencernaan dikumpulkan untuk sebuah dimensi
kedua
pemisahan
pada
tahap
membalik
nanoLC
dipasangkan dengan MS.
Pemisahan Protein oleh 2-DE gel dan dalam tryptic gel
pencernaan
Contoh Protein (400 lg) telah ditangguhkan dalam
rehidrasi buf- fer yang terdiri dari 7 M, 2 M thiourea urea,
2% Chaps, dan 0,5% amphOlytes (pH 3.0-11,0) dan solusi rehidrasi DeStreak (GE
perawatan kesehatan, Uppsala, Swedia) dan telah
incubated dengan IPG

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421
(2012) 43-55

(penusukan pH berupa arsiran) soket ekstensi (pH 3.011,0) dari GE perawatan kesehatan dalam PROTEAN
isoelectric memusatkan perhatian sel (Bio-Rad) selama 16
jam. Isoelectric memusatkan perhatian dilakukan oleh
tegangan bijak bertambah sampai mencapai- ing 14,400
Vh. Sebelum menjalankan dimensi kedua, soket ekstensi
telah equilibrated dalam solusi 6 M, 2% SDS urea, dan 0,5
M DTT dan kemudian dimuat pada 7 cm NuPAGE 10% BisTris
jeli
(Invitrogen,
Cergy
Pontoise,
Prancis).
Electrophoresis dilakukan di 200 V untuk 40 mnt pada
Novex sel mini dari Invitrogen sistem. Semua jeli telah
dinodai oleh Coomassie (SimplyBlue biru, Invitrogen).
Dua dimensi bintik-bintik gel menarik adalah tambang
utama dan di- gested. Di-dilakukan pencernaan gel dengan
sebuah protein otomatis
Sistem pencernaan, stasiun MassPREP (Air). Bintik-bintik
gel dibasuh
dua
kali
dengan
100 ll
25
mM
NH4HCO3)/acetonitrile rasio
(1:1).
Kelompok-kelompok
cysteine yang mula-mula berkurang dengan 50 ll 10
mM DTT pada 57 C untuk 1 h dan kemudian alkylated
menggunakan 50 ll
55 mM iodoacetamide pada suhu kamar selama 20 menit
setelah
Dehidrasi dari band gel dengan acetonitrile, protein
pasif di-- gested semalaman dalam gel dengan 15 ll dari
12,5 ng/ll dimodifikasi porcine
Trypsin (Promega, Madison, WI, USA) dalam 25 mM
NH4HCO3) pada suhu kamar. Dibuat-peptides telah
diekstrak dengan 60% ace- tonitrile di 5% asam format
(HCOOH) diikuti dengan melepaskan kelebihan acetonitrile.
NanoLC-Chip-MS/MS analisis SCX pecahan dan 2D bintikbintik gel
Dalam tryptic mencerna dari fraksi masing-masing dari
SCX chromatogra- phy atau 2D dianalisis oleh nanoLC
bintik-bintik-MS/MS menggunakan Agilent 1100 series
performa tinggi Liquid Chromatography (HPLC)--Chip MS
system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) ditambah
ke sebuah HCT Ultra perangkap ion (Bruker Daltonics,
Bremen, Jerman). Untuk Semua percobaan-percobaan, air
telah ditahirkan dengan menggunakan-Q langsung dari
Milli- pori, dan acetonitrile (HPLC kelas) dibeli dari Carlo
Erba Reactifs-SDS (Val De Reuil, Prancis). Sistem pelarut
terdiri dari 2% (v/v) acetonitrile dan 0,1% (v/v) asam
format dalam air (pelarut sebuah) dan 2% (v/v) air dan
0,1% (v/v) asam format dalam acetonitrile (sol- tutup
lubang B). Peptides telah dipisahkan dengan tahap dengan
piramidal C18 KoloseUmn (Zorbax 300SB-C18, 75 lm 150 mm, 5 lm
saya.d.) menggunakan
Acetonitrile berupa arsiran dari 8 sampai 40% pelarut B
dalam 30 menit dengan laju aliran 300 nl/mnt. Sebuah
spectrometer massal telah beroperasi dalam mode ion
positif, dan tegangan yang diterapkan ke tutup kapiler
karbon adalah- mized untuk -1850 V. MS/MS percobaanpercobaan yang dilakukan oleh colli- siryon proses disosiasi
yang diinduksi oleh (CID), dan sistem ini dilaksanakan
dengan automatic switching antara MS dan MS/MS mode
(mode dengan Pengaturan). Tiga paling berlimpah
peptides dan lebih banyak berganda ion bermuatan terpilih
pada setiap spektrum MS untuk isolasi lebih lanjut dan
fragmentasi. MS/MS memindai dilakukan dengan mode
resolusi ultrascan pada pemindaian tingkat 26.000 m/z per
detik. Total 6 scan rata-rata-untuk mendapatkan MS/MS
spektrum. Sistem lengkap sepenuhnya dikontrol oleh
ChemStation (Agilent Technologies) dan Kontrol Bruker
Daltonics Esquire (perangkat lunak).
Identifikasi protein dan
validasi 2D LC-MS/MS data

45

Data yang dikumpulkan selama nanoLC Massal-MS/MSanalisis proCessed,

diubah
menjadi .mgf
file,
dan
dianalisa
menggunakan Maskot
Algoritma 2.2.0 (Matrix Ilmu Pengetahuan, London, Inggris).
Spectra telah mencari dengan toleransi massal dari 0,3 Da
untuk MS dan MS/MS data, sehingga maksimal satu
cleavage tidak dijawab, tryptic peptides dengan proline
sebagai C-terminal asam amino dari situs cleavage dan
dengan carbamidomethylation dari cysteine, N-acetylation
di N terminus protein, dan oksidasi methionines ditetapkan
sebagai modifikasi variabel. Spectra mula-mula mencari
dalam target-versi database UniProtKB decoy (versi 14.8, 17
Februari 2009, entri 165,400). Semua file yang terkait ke
salah satu mengekstrak ini digabungkan

Dengan menggunakan perangkat lunak buatan sendiri

(concatene.exe) dan telah mencari dalam target samadecoy database UniProtKB digambarkan dalam gel 2D
identifikasi protein bagian menggunakan Maskot
algoritma pencarian. Toleransi massal untuk MS dan
MS/MS ion juga ditetapkan pada
0,3 Da. Parameter pencarian database yang sama seperti
de- scribed sebelum, dan mencari dilakukan dalam dua
tahap. Dur- ing langkah pertama, protein menganalisa
dianggap sebagai betul apabila satu ikatan peptida yang
terdeteksi (<10 poin di bawah ini sebagai maskot
ambang batas, skor ion identitas di 95% tingkat
kepercayaan dan skor ion lebih dari 15, 61 protein, 0
untuk terbalik total mengekstrak dan 45 protein, 0 untuk
cortical terbalik mengekstrak). Selama tahap kedua,
spectra yang tidak memenuhi kriteria ini diekspor
menggunakan Scaf- melipat 2.2.0 (perangkat lunak
perangkat lunak Proteome, Portland, atau, USA) dan
mencari terhadap database decoy dibatasi dengan variable modifikasi seperti sebelumnya. Protein-menganalisa
vali- bertanggal saat satu ikatan peptida yang terdeteksi
(<22 poin di bawah ini sebagai maskot ambang batas,
skor ion dan skor ion lebih dari 15, 14 pro- teins, 0 untuk
terbalik total mengekstrak dan 25 protein, 0 untuk
terbalik korintus- lidah letaknya mengekstrak).
2-DE gel LC-MS/MS data
Menganalisa Protein dianggap sebagai yang berlaku
pada saat satu pep- gelombang dengan kualitas tinggi
MS/MS spectra (<8.1 poin di bawah ini sebagai maskot
ambang batas, identitas-skor pada 95% tingkat
kepercayaan dan skor ion lebih dari 20) yang terdeteksi
(37 protein, 0 reverse). Semua spectra yang tidak
memenuhi kriteria ini diekspor menggunakan Tampilan
Scaffold dan mencari dalam target yang sama-decoy
dibatasi database untuk ker- atin dan intermediate
komponen filamen (606) dengan entri kriteria yang sama
yang dijelaskan di bawah ini selain variabel berikut
modifikasi: methylation (H, K), dimethylation (K),
sekuritas <trimethyla- (K), dan ke asam sulfonic oksidasi
(C). Protein-menganalisa divalidasi dengan sama ambang
batas telah disetel sebelumnya (23 pro- teins, 0 reverse).

2-DE gel LC-MS pemetaan peptida dan pengukuran

kelimpahan relatif
Total 12 bintik-bintik-bunga reanalyzed dalam nanoLCMS dan -MS/MS
untuk
pemetaan peptida
pada
nanoACQUITY
UPLC
(ultra-Performance
Liquid
Chromatography) Anda dipasangkan dengan SYNAPT
hybrid quadrupole orthogonal waktu akselerasi-terbang
(TOF)) tandem spectrometer massal (Air) dilengkapi
dengan nano- sumber ion semprotan dan sebuah sistem
massal kunci dalam mode ion positif. Dalam mencerna
telah terjebak pada simetri C18 precolumn
(20 0.18 mm, 5 lm, Air), dan peptides telah terpisah
Pada sebuah
ACQUITY UPLC BEH130 C18 kolom
(75 lm 200 mm,
1,7 lm ukuran partikel, air). Sistem pelarut terdiri dari
0,1% asam format dalam air (A) dan 0,1% asam format
dalam acetonitrile (B). Penangkapan dilakukan selama 3
menit di 5 ll/mnt dengan 99% Sebuah
Dan 1% B. Elution dilakukan dengan laju aliran 400 nl/mnt
menggunakan 6-40% B di atas 45 mnt pada 45 C diikuti
oleh 65% B di atas 5 mnt tegangan kapiler yang telah
ditetapkan pada 3.5 kV, dan tegangan kerucut telah
ditetapkan pada 35 V. kalibrasi massal dari TOF) yang telah
dicapai
menggunakan
asam
phosphoric
(H3PO4)
dalam m/z jangkauan 50-tahun 2000. Online pembetulan
kalibrasi ini dilakukan dengan mengunci-mode. Untuk LCMS experi- nyata, pemindaian diperoleh setiap 600 ms.
Kapasitas puncak untuk sistem LC adalah lebih besar dari
200. Untuk MS/MS percobaan-percobaan, sistem ini
dilaksanakan dengan automatic switching antara MS dan
MS/MS modus (MS = 0,5 s/scan m/z jangkauan dari 250
hingga 1500, MS/ MS = 0,7 s/scan m/z jangkauan 50-tahun
2000). Dua ion paling berlimpah-limpah (ambang batas
intensitas = 40 menghitung mundur/s), sebaiknya dua kali
lipat dan tri- ion bermuatan kayu lapis, dipilih pada setiap
spektrum MS untuk isolasi lebih lanjut dan CID fragmentasi
dengan dua energinya disetel menggunakan sebuah
kolose- lision profil energi dan kemudian dikeluarkan untuk
20 s. Ikatan Peptida iden- tifications diperoleh setelah
pencarian maskot pada MS/MS data sebagai

46
(2012) 43-55

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421

Dijelaskan sebelumnya digunakan untuk mengekstrak

intensitas ion corre- sponding peptides pada LC-MS akan
dijalankan.

Hasil dan diskusi

Kajian rambut manusia ekstrak protein dicerna oleh 2D
offline chromatography (SCX-RP-MS/MS)
Pendekatan MudPit yang telah diterapkan dengan
protein diekstrak menggunakan prosedur yang dijelaskan
oleh Lee dan rekan kerja [21]. Strategi yang menunjukkan
ekstraksi tertentu dari lapisan penglihatan meninggalkan
cangkang tetap utuh, seperti yang ditunjukkan dalam
memindai microscopy elektron melihat (Fig. 1). Sebagai
keluaran- pected, dua pecahan diperoleh: sebuah soluble
satu dan sebuah chelat satu, setara dengan cortical dan
cuticular
extracts,
masing-masing.
Kedua-duanya
diserahkan kepada tryptic pencernaan, dan telah
dijalankan untuk dimensi pertama pemisahan melalui
sebuah kolom SCX diikuti oleh dimensi kedua pada dengan
piramidal kolom tahap terkopling ke MS/MS analisis.
Pecahan yang dianalisis oleh nanoLC-MS/MS, memimpin
untuk identifikasi 56 protein, termasuk 34 keratins dan PSP
pro- teins tercantum dalam Table 1. Protein utama jenisjenis I dan II keratins, dengan 13 dari 15 keratins rambut
dari bentuk peralihan filamen diidentifikasi: 5 type II
keratins (K81, K82, K83, K85, dan K86) dan 8 jenis I
keratins (K31, K32, K33a, K33b, K34, K35, K36, dan K37).
Urutan tertinggi adalah memperoleh jangkauan K81, K85,
K86, K31, K33a, dan K33b, menyarankan bahwa keratins
ini adalah yang paling berlimpah rambut. Mengenai KAPs,
kita telah mengidentifikasi 13 dari mereka dengan
peptides tertentu (KAPs 24.1, 11.1, 3.1, 3.2, 3.3, 13,2,
19,5, 9.6, 9.7,
4.3, 4.4, 4.7 dan 4.9) dan 10 dengan peptides lain untuk
umum sebuah psp keluarga (PSP 4.6/4hk dengan 2
peptides, PSP 9.2/9.9 dengan 2

Gbr.1. Memindai microscopy elektron serat rambut setelah ekstraksi

protein. Gambar yang menunjukkan bahwa soluble cortical proteinprotein diekstrak, meninggalkan cangkang tetap utuh.

Peptides, PSP 10.1/10.3/10.7 dengan 2 peptides, dan PSP

2.1/2.3/2.4 dengan 4 peptides).
2D LC-MS mendekati antara soluble dan chelat
mengekstrak kurang lebih sama memberikan hasil
identifikasi protein. Jangan sekali-kali- theless, kita dapat
menganggap bahwa protokol ini membawa kepada
pengambilan beberapa cangkang protein, sebagaimana
disarankan oleh kehadiran cuticular K32, K82, PSP 10, dan
PSP 24.1 [22,23], sedangkan semua identi lain- fied KAPs
mempunyai asal-usul cortical. Kita juga catatan kehadiran
lebih
peptides
dari
protein-protein
dalam
chelat
mengekstrak.
Selain itu, kita telah mengidentifikasi 22 minor
protein yang dapat diklasifikasikan ke dalam kelompokkelompok yang berbeda (Table 2): desmosomal protein
(desmoglein-4
dan
junction
plakoglobin),
yang
memainkan sangat penting

Tabel 1
Keratin protein dikenali setelah 2D offline chromatography: nomor penerimaan, nama protein, jangkauan urutan, dan jumlah peptides unik.
Nomor
penerimaan

Protein

Ya43790
P78386
Q14533
P78385
P9NSB4
Q15323
Ya76009
Q14525
Ya76011
Q92764
Ya76013
Q14532
Ya76014
P9BYU5
P8IUC1
Q07627
P9BYR8
P9BYR7
P9BYR6
P52LG2
P9BYQ4
A8MTY7
A8MVA2
P3LI72
P9BYR4
P9BYR3

Keratin type II K86

Keratin type II K85
Keratin type II K81
Keratin type II K83
Keratin type II K82
Keratin ketikkan aku
K31
Keratin
ketikkan aku
K33a
Keratin ketikkan aku
K33b
Keratin ketikkan aku
K34
Keratin ketikkan aku
K35
Keratin ketikkan aku
K36
Keratin ketikkan aku
K32
Keratin ketikkan aku
K37
Psp 2.1, 2.3, atau 2.4
Psp 11.1
Psp 1.1
Psp 3.1
Psp 3.2
Psp 3.3
Psp 13,2
Psp 9.2 atau 9.9
Psp 9.7
Psp 9.6
Psp 19,5
Psp 4.3
Psp 4.4

Chelat

Soluble

Jangkauan urutan (%)

Jumlah peptides unik

Jangkauan urutan (%)

Jumlah peptides unik

74
73
65
63
25
64
75
68
48
33
7
18
16
42
29
0
17
17
17
7
19
19
9
22
7
0

18
38
3
4
7
8
28
7
8
7
1
2
4
4
4
0
1
1
1
1
2
1
1
1
1
0

70
70
59
58
9
68
76
71
48
36
0
16
0
27
16
7
17
17
17
7
24
0
0
21
13
15

19
38
2
4
1
11
29
6
9
7
0
2
0
4
3
1
2
1
1
1
3
0
0
1
2
2

P9BYQ5
P9BYR0
P9BYQ8
P60331
P60369
P60409
A8MUX ADALAH0
P3LI83

Psp
Psp
Psp
Psp
Psp
Psp
Psp
Psp

4.6/4HK
4.7
4.9
10.1
10,3
10.7
10-seperti
24.1

10
0
22
5
10
6
2
5

2
0
2
2
3
3
1
1

27
12
0
0
0
0
0
5

5
1
0
0
0
0
0
1

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421
(2012) 43-55

47

Tabel 2
Protein-protein lain dikenali setelah 2D offline chromatography: nomor penerimaan, nama protein, jangkauan urutan, dan jumlah peptides unik.
Melepaskan arealtox
Jangkauan
tox
K31/K32/K34
LEC
Melepaskan areal
EINTYR.S
numberProteinSeque
ILDELTLC
K.S
K31/K33a/K33b/K34
K33a/K33b

Melepaskan areal LASYLEKdmVR.Q

Melepaskan areal

tox ILDELTLC

K33a/K35

Melepaskan areal

tox SDEAQVESLKEELLC

R.S
Lukas Q

Catatan: Tabel menunjukkan ke mana protein urutan-urutan dapat sama.

Untuk masing-masing diidentifikasi ikatan peptida, asam amino yang
dimodifikasi menggarisbawahi dengan jenis modifikasi dalam superscript.
tox, trioxidation; dm, dimethylation; Akulah, carbamidomethylation;
lembu, oxidation; m, methylation; tm, trimethylation.

Peran dalam keratinocyte monosit ke sel-sel tetangga;

protein struktural seperti histones H2A, H2B, dan H4;
kalsium mengikat protein protein seperti S100-A3 dan
kalmodulin-seperti protein 3, yang mengikat ion kalsium
yang diperlukan untuk fungsi

Tabel 3
Daftar peptides dikenalpasti dengan PTMs oleh 2D offline pendekatan
kromatografi dilakukan pada dicerna total ekstrak rambut.
Protein

Dimodifikasi ikatan peptida dikenalpasti

K81/K83/K86

Akulah

K81/K83/K85/K86

Akulah

K81/K83/85/K86

K.KtmDVDCamAYRL.K

K81/K86

Akulah

tox

areal
K86

LEAAVAQSEQQGEAALSDAR.C

ISAC AFSC melepaskan

GPRPGR.C
GDLC GGVVC melepaskan

ASTTAPVVSTR.V
Melepaskan arealISDTSVVV VLQSH m.K

K85/K86
tox

akulah

LC EGCGSVNVC
K81/K83/K85/K86

Melepaskan areal
VSSSR.G

KanakdmEEINELNR.M
K85
GGVSC

dm

AYLR K.K dm DVDC.K

Akulah

tox

areal
K86

QLSK K.C

Melepaskan areal Taman KanakMelepaskan areal

tox

GGLSYSTTPGR.Q

K85

Akulah

K81/K83/K85/K86

Prof.dr.K.LAELEGALQK

K81/K83/K85/K86

R.C

K81/K85/K86

Melepaskan areal

lembu

tox

NLGSC SLC

tox

tox melepaskan areal

dm

GPR.Saya

AK.Q

KLAELEGALQK.Sebuah

DLNM
DC IIAEIK.Sebuah
K81/K83/K85/K86

Melepaskan arealtox EAECVEADSGR.L

K81/K83/K85/K86

Melepaskan areal FAAFIDKdmVR.F

K81/K83/K85/K86

Melepaskan arealLLETK dm FLEQQNK.W

K81/K83/K85/K86

Melepaskan areal FLEQQNK LLETK.W

K81/K83/K85/K86
dm
K81/K83/K85/K86

Melepaskan arealK.K LASELNHVQEVLEGYK

K81/K83/K85/K86

Prof.dr.K.AKQDMACtoxLIR.E.

K81/K83/K86
SVC (.Sebuah
K81/K83/K86

Melepaskan areal

GLTGGFGSHSVC

tm

Prof.dr.K.AKdmQDMACakulahLIR.E.

Melepaskan areal

akulah

tox

GGFR. K31/K33a/K33b/K34/K35 Melepaskan

arealtox ARLECEINTYR.S K31/K33a/K33b/K34/K35

GGFR GLTGGFGSH m

Protein desmosomal; stabilisasi citra protein (kejutan

panas and cognate 71 kDa protein); terlibat dalam
signaling protein (14-3-3 sigma protein); enzim
proteolytic (lysozyme g-seperti protein 2 dan bleomicin hydrolase); sebuah and antimicrobial ikatan
peptida (dermcidin precur- sor), yang dikenal untuk
melindungi permukaan epitel; selenium- protein
mengikat 1 terlibat dalam intra-badan Golgi transport
protein; sial- idase-2, yang hydrolyzes senyawa
sialylated;
lysosome-associated
glikoprotein
membran 1 dan 2; hadir dalam sel-sel epitel protein
(Serpin B5 pendahulu); dan Nesprin-1 yang terlibat
dalam pemeliharaan organisasi nuklir dan integ- rity
struktural. Protein-protein ini dikenalpasti dengan
sedikit peptides (1-3), yang tidak mengejutkan. Yang
terakhir adalah mungkin nonresidual frag- nyata yang

mencerminkan aktivitas selular masa lalu. Akhirnya,

identifikasi TGase-3 dengan satu ikatan peptida dapat
dihubungkan ke beberapa interpro- tein cross-link yang
dijelaskan dalam poros rambut [2427].
Hasil dari MS menunjukkan bahwa semua dilokalisasi
PTMs dapat diidentifikasikan dari keratin peptides (Table
3). Pengubahan cysteine oksidatif untuk sulfonic acid
(+47.985)
telah
dikenali,
sedangkan
methylation
mengaitkannya-ketikkan modifikasi, telah disebutkan pada
rambut kera- tin [21], adalah sulit untuk menunjukkan tak
dapat dibantah.
Strategi
decoy-target
yang
digunakan
untuk
menetapkan PTMs tidak keluaran- terlebih dulu kita dari
pemeriksaan berhati-hati dari MS/MS spectra untuk setanstrate keabsahan penafsiran kita. Untuk setiap methylated
ikatan peptida, langkah-langkah tambahan dari analisis
spectra, telah dilakukan untuk mempertimbangkan banyak
hal-hal yang meragukan dari isoforms dan asam amino
isobaric memimpin untuk menutup MW untuk orang tua
ion.
Sebagai kesimpulan, pendekatan MudPit memungkinkan
tiga PTMs berbeda untuk dipelihara: oksidasi cysteine
untuk sulfonic, dimethyla asam--sekuritas <Lisin, dan
methylation dari histidine. Kita telah mengidentifikasi 15
pep- surut dengan sulfonic amino, 9 peptides dengan
dimethylated lysines, 2 peptides dengan trimethylated
lisin, dan 2 peptides dengan methyl- ated histidine. Walau
demikian, semua PTMs dipelihara tidak dapat ditetapkan
ke sebuah protein diberikan karena beberapa dimodifikasi
peptides telah dipakai bersama dengan beberapa keratins.
Dalam beberapa kasus, kita telah mengidentifikasi modifi
berbeda--kation urutan peptida yang sama, misalnya,
FLEQQNKLLETK dan GLTGGFGSHSVCGGFR (Table 3).
Modifikasi yang dipelihara sebagian besar pada type II
keratins dasar dengan cysteine teroksidasikan yang lebih
dari pada tipe I keratins asam. Kenyataannya, kebanyakan
non-PTM oksidasi sistein- teine dikenal untuk terjadi
setelah pengobatan kimia rambut [2,28]. Con- sidering
studi yang dilakukan pada area yang tidak terkena sinar
rambut, mungkin hanya oksidasi hasil dari paparan UV
yang dikenal untuk mendorong oxida- tive stress.

48

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421 (2012) 43-55

62 kDa
42 kDa

PI11

KetikkanAkuAnak

PI 3
Massal Molekuler

KetikkanII ANAK

85 84 83

80

7978

77

38 kDa

53

28 kDa

71

48 47 45 44

63
60 59
61

62
65
43

54

51
26 25

41
46
37

24

42

2322

14

56
58
38
39

40
32

19

21

10

28
27

17

20

11

29

31 30

18

13

55

57

35 34

36

33

17 kDa
14 kDa

72

74
49
50

52

67 64

68
70 6966

73

75

76

8281

16
9

15

12
5

6 kDa

Gbr.2. 2-DE gel rambut cortical mengekstrak dan bintik-bintik sampel yang dipilih untuk belajar. Gel ini adalah mewakili triplicates.

Rambut manusia protein dikenalpasti oleh 2-DE gel

diikuti oleh nanoLC-MS/ MS analysis
Meskipun menggunakan sebagai metode yang luwes,
banyak tantangan yang diperlukan untuk dapat diatasi
untuk mendapatkan 2-DE jeli dalam kualitas yang dapat
diterima dari Samuel- ples seperti rambut. Kesulitan dalam
pengambilan pro- teins struktural, insolubility, kisaran
dinamis besar, dan salib luas--link fitur-fitur yang
diperlukan untuk dipertimbangkan. Biasanya, migra-sekuritas <rambut manusia protein ini ditandai oleh
sebuah pola keratins rambut, dijelaskan oleh Langbein dan
rekan kerja [5,6], menunjukkan sebuah kereta panjang dari
protein dalam 62-area kDa antara paku 4 dan paku 7,
yang setara dengan keratins type II, dan sebuah gugus
protein padaAku, yang p rendah sesuai untuk mengetikkan
keratins saya. Identifikasi KAPs dengan 2-DE gel tetap lebih
sulit. Ini menjelaskan mengapa, sampai kami tahu, tidak
menjelaskan 2-DE gel profil peta KAPs manusia telah
dilakukan, namun.
Dengan
memperbaiki
parameter
migrasi
dan
meningkatkan
jumlah
pemuatan
untuk
berpotensi
mendeteksi protein-protein lain dikenalpasti dengan
pendekatan MudPit, khususnya psp keluarga, kami dapat
memperoleh 2-DE pola gel dengan yang baru dari sebuah
grup kaya sidik jari bintik-bintik-(Fig. 2). Bintik-bintik tidak
terdeteksi untuk loadings contoh
Di bawah 50 lg (tidak diperlihatkan). Dalam area ini,
beberapa adalah latar belakang ob-

Disajikan, mungkin karena kelebihan beban takaran pasangannyarial protein. Kita memilih sebuah sampling bintik-bintik 59 (dari 27 ke
85 dalam Fig. 2) terutamanya dalam 28- untuk 42-zona kDa dan 26
bintik-bintik (dari 1 sampai 26) di zona di bawah 28 kDa, barangkali
di mana KAPs mungkin dilokalisasi. Total 26 protein ini dikenalpasti
oleh nanoLC-MS/ MS dan dicantumkan dalam Table 4.
Hasil mengungkapkan bahwa diidentifikasi utama protein adalah
type II dan ketikkan keratins saya. Kita telah mengidentifikasi 4 dari
6 type II keratins (K81, K83, K85, dan K86) dan 7 dari 9 jenis I
keratins (K31, K32,

K33a, K33b, K34, K35, dan K36). 5 Yang paling

menonjol protein dikenali adalah K81, K85, dan
K86 untuk tipe II keratins dan K31 dan K33a
untuk mengetikkan keratins saya. Karena
mereka juga hadir di bawah MWs diharapkan
mereka, kami menafsirkan kehadiran mereka
sebagai hasil dari penurunan yang dapat terjadi
di dalam serat atau selama prosedur sekuritas
<extrac-. Untuk mengkonfirmasi tafsiran ini,
urutan yang diperoleh pada setiap spot
jangkauan
diselidiki.
Menariknya,
profil
jangkauan keratin peptides dikenalpasti dalam
beberapa nampaknya bintik-bintik fungsi lokasi
spot. Akibatnya, bintik-bintik dikelompokkan ke
enam keluarga menurut jangkauan urutan.
Keluarga-keluarga
ini
menunjukkan
pola
distribusi di beberapa wilayah gel, sebagaimana
digambarkan dalam Fig. 3A. Namun demikian,
kehadiran peptides dari N- dan C-terminal bagian
dari urutan protein di mayoritas bintik-bintik
cenderung untuk menyangkal hipotesis dari
spesies melekat dan harus diperiksa.

Mengenai jenis I keratins (Fig. 3C), kita menemukan

mayoritas peptides di wilayah asam-rendah diselidiki di
bawah keratin ketikkan aku bintik-bintik gugus (13, 14, dan
23-26), yang juga dapat menunjukkan melekat spesies.
Terlepas dari asam paku protein-protein, beberapa jenis I
keratin peptides telah diidentifikasi dalam wilayah dasar
yang telah dijelaskan sebelumnya.
Mengenai KAPs (Fig. 3B), hanya 6 dapat dikenali (KAPs
1.5, 3.1, 3.2, 3.3, 11.1, dan 13,1) dengan 1 atau 2 dan 3
KAPs peptides tertentu dari keluarga-keluarga 2, 4, dan 9
dengan 1 ikatan peptida untuk umum satu keluarga.
Walaupun kurang tertutup dan kurang banyak dari hasil
MudPit, menganalisa ini menunjukkan kemungkinan
mengidentifikasi-pro- teins dengan 2D strategi berbasis
gel. Namun demikian, yang tak terduga re- melalui sult
yang dapat menekankan adalah identifikasi KAPs dalam
bintik-bintik dilokalisasi pada area tertinggi dari gel di
mana type II keratins tidak dikenali. Sebenarnya, hanya
PSP 3.1, 1.5, dan 4 keluarga yang ditemukan di daerahdaerah yang sejalan dengan MWs mereka.

Tabel 4
Dari 20 protein distribusi dikenalpasti dalam 85 tambang utama dari 2 bintik-bintik-DE gel cortical rambut mengekstrak.
Nomor penerimaan dikenalpasti protein

Q14533
P78385
P78386
Ya43790
2273845
41515
Q15323Ker
atin,

MW (kDa) paku

Keratin, ketikkan II
Keratin, ketikkan II
cuticular K83
Keratin, ketikkan II cuticular K85
Keratin, ketikkan II cuticular K86

Nomor penerimaan dikenalpasti protein

83 84 85

Keratin, ketikkan II cuticular 55

K81
Keratin, ketikkan II cuticular 54
K83
P78386
Keratin, ketikkan II cuticular K85

11 11
8 99
11
11
Q15323
Keratin, ketikkan aku
47
Ya43790
II cuticular K86
cuticularketikkan
K31
Ya76009
Keratin,
aku
46
cuticularketikkan
K33a
Q14525
Keratin,
aku
46
cuticular
K33b
Ya76011
Keratin, ketikkan
aku
49
cuticular
K34
Q92764
Keratin, ketikkan
aku
50
cuticular
K35
P9BYS1
Keratin dikaitkan protein 1- 18
5
P9BYU5
Keratin
protein terkait
14
2-1, 2-3 atau 2-4
P9BYR8
Keratin protein yang
11
berhubungan
P9BYR7
Keratin
proteindengan
yang 3-1
10
berhubungan
P9BYR6
Keratin
proteindengan
yang 3-2
10
berhubungan
A8MTL4
Keratin proteindengan
yang 3-3
17
berhubungan
P9BYQ4
Keratin proteindengan
yang 4-X
18
berhubungan
9-2
atau 9-9 dengan
Keratin dikaitkan 11-1
protein protein yang
Keratin
berhubungan
dengan
Protein
S100-A8

56
53

MW (kDa) paku

Q14533
P78385

P3LI55
P8IUC0
P05109
P06702

55
54

5.5
5.3

Spot Bilangan

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
41 42 43
5.5
1 1
1 1
1 2 2
1
5.3
1
6.3 2 3 4
5.6 2 1

2533 5
24
11

1881
25

81
1883 2152 3

4
7
36 72
4
4

9 3623 12 52 5
3 23 24 34 474

3 4

44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82

56 6.3 4 5 8 9 7 9 8 11 9 11 5 4

1 21

4.9
53 5.6 4 8 5 3 4 9 6 4 11 12 2 3 3 2
4.8
1
4.8
4.7
4.8
6.6
8.3
1

15 3
1 1

6.0
5.4
5.4
8.3
8.2

1
1

8 8

1
7

112 11

868

3 6 11 6 1

4 413 4 213 1 3 4 1 5 3 4 512 2 5 8

2 1 2
2
1 2 1 1

32
1

5 5 63
7
1 2 3

2 2
1

22 233
1

9 9

3 3
23 4
2 836
2 2 2 4 1

699

1 11

1 1 2
2 2 2

4
2

1 1 1

1 1

1 1
1

1
1

1
1

1 1
1

1 1 1

1 1

1 1

1 1 1

1
1
1 1

1 1
1
1 1

1
1
1

1 1 1
1
1 1 1

1 1

Al
a
t
b
a
n
t
u
P
r
o
t
e
o
m
ic
u
n
t
u
k
r
a
m
b
u
t
m
a
n
u
si
a
p
r
o
t
ei
n
/
N

17
18
11
13

8.3
1 1
1
1
8.5
1
6.5
1 1 1
1 1 1 1 1 1
1
1 1 1
1 1
Protein S100-A9
5.7
1 1 1 1 1
2
1
Catatan: Bilangan menunjukkan peptides unik untuk protein yang teridentifikasi. Tanda bintang menunjukkan jumlah dimodifikasi peptides protein. Protein utama dikenali adalah jenis manusia II dan
ketikkan aku keratins dan KAPs.

4
9

50
(2012) 43-55

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421

Gbr.3. Distribusi menganalisa protein pada 2-DE gel untuk K85, KAPs, dan K31. (A) Identifikasi untuk K85 menunjukkan pola peptida tertentu,
tergantung pada lokasi spot. Urutan enam pola jangkauan (I-VI) digambarkan dan yang ditunjukkan dengan warna yang berbeda. Peptides
dikenalpasti dalam wilayah yang berbeda dari urutan keratin secara sistematis hilang atau yang ada pada pola keluarga. (B) Ringkasan PSP
identifikasi 2-DE gel. KAPs 3 (dengan warna kuning) yang diharapkan pada kira-kira 10 kDa dan ditemukan dalam bintik-bintik 10, 11, dan 13 untuk
15. Bintik-bintik berwarna lain: PSP 1-5 dikenali (spot 16) di bawah diharapkan MW (~18 kDa) dan pada yang tak terduga psaya menghargai
(diharapkan 6.6); PSP 4 dikenalpasti dalam keluarga spot 6 diharapkan dari 13 hingga 22 kDa; zona gel tertinggi (di atas spot 28) menunjukkan suatu
jumlah besar bintik-bintik berisi terutama PSP 3 (kuning), PSP 2 (kain ungu muda), dan PSP 9 (brown). (C) Lokasi melekat peptides dari jenis keratins
saya.

75000

75000

75000

Sebuah
65000

Ketikk
an II

65000

65000
Ketikkan II

55000

Ketikkan II

55000

55000
Ketikkan Saya

45000

Ketikk
an
Saya

KAPs 10seperti

KAPs 1
KAPs 9

Psp 24.1

25,00
0 EKS

KAPs 4
KAPs 9

KAPs 1

seperti

35000

KAPs 10

25,000 EKS

KAPs 12
15000

KAPs 3

KAPs 6

KAPs 2

KAPs 13

KAPs 1
KAPs 9

15000

KAPs 2

KAPs 2

5000

KAPs 19

5000

KAPs 3

KAPs 6

KAPs 19

5000

4.5

5.5

6.5

7.5

8.5

Psp 24.1

KAPs 4

KAPs 13KAPs 19

KAPs 11.1

15000

KAPs 12

Psp 24.1

35000

KAPs 4
KAPs 13

KAPs 3

Ketikkan Saya
KAPs 10-

KAPs 10
KAPs 10

35000

25,000 EKS

45000

KAPs 10-seperti

45000

9.5

4.5

5.5

6.5

7.5

8.5

9.5 10,5 11.5

12,5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

Gbr.4. 2 teori-DE peta cortical dan cuticular anak dan KAPs diharapkan setelah gel MS analisis. Memperkirakan 2-DE pola penggunaan komputer
(dengan paku/MW tool tersedia online pada server proteomic ExPASy): (A) TANPA alkylation pada cysteine; (b) cysteine alkylation dengan
iodoacetamide (digunakan dalam studi ini); (C) cysteine alkylation dengan asam iodoacetic. Sumbu x: paku; sumbu y: MW.

Ketiadaan bintik-bintik focalized untuk protein-protein

ini dapat menjadi re- melalui sult dari beberapa faktorfaktor. Pertama, staining dengan teknik saat ini, seperti
noda perak dan biru Coomassie, nampaknya tidak
menguntungkan untuk deteksi KAPs, barangkali karena

asam amino yang tidak lazim komposisi protein-protein

ini. Dalam keadaan terbaik untuk mengungkapkan HSPs
dan UHSPs adalah labeling dari jumlah cysteine tinggi
14
dalam
urutan
protein
ini
dengan C-berlabel
iodoacetamide
atau
asam
iodoacetic [4],
tetapi

memerlukan peralatan khusus dan perhatian. Kedua,

beberapa keluarga, seperti KAPs 4 dan 9, adalah anggota
keluarga multigenic. Sedikit heterogeneity yang dicetuskan
oleh lusin protein dengan perbedaan rendah dalam urutan
dalam keluarga juga dapat menyebabkan pembubaran
sinyal protein sebanding dengan gugus untuk tipe I atau
ketikkan II keratins pada 2-DE gel. Ketiga, asam amino

Komposisi beberapa keluarga dapat menjelaskan ekstrim

mereka paku val- ues di yang sulit untuk mengatasi oleh
electrofocusing. Bulu- thermore, bahan-bahan alkilasi
reagent digunakan untuk menghindari reoxidation dari
jumlah cysteines tinggi dapat mendorong variasi kuat dari
pI. Sebagai contoh masalah ini, kita precomputed-paku
dari masing -masing diharapkan keratin dan PSP protein
dengan bahan-bahan alkilasi umum reagent digunakan
dalam studi ini, iodoacetamide. Untuk mensimulasikan
asam atau sifat dasar grup alkylation, kita digunakan untuk
menggantikan cysteines dengan asam-asam amino dari
properti yang sama seperti asam glutamic untuk asam
iodoacetic dan glutamin untuk iodoacetamide reagent.
Misalnya, PSP 4.2 telah secara teoritis pI sebsesar 8.30
tanpa alkylation yang meningkat
12.18 dengan glutamin substitusi dan berkurang untuk
3,90 glutamic asam dengan penempatan. 2D teoritis peta
keratins dan KAPs

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421
(2012) 43-55

51

Tabel 5
Daftar peptides dikenalpasti dengan PTMs dan spot jumlah cortical rambut mengekstrak 2-DE gel di mana mereka terdeteksi.
Protein

Urutan dimodifikasi ikatan peptida

K81/K86

Prof.dr.K.LAELEGALQK

K81/K86

Melepaskan areal

K81/K83/K86
K81/K85/K86
K85
K85
K85
K85
K85

dm

akulah

AK.Q

GGFR GLTGGFGSH m

Dikenalpasti dalam nomor spot

23
29/30/31/32/41/43

R.K SDLEANVEALIQEIDFLR.R
Melepaskan arealLLETK dm FLEQQNK.W

76/80

Melepaskan arealSAVAPK NFSSC

dm
akulah TGNR.C
Melepaskan
arealSAVAPK NFSSC
tm
tm
akulah TGNR.C
Prof.dr.K.LLETK WQFYQNQR.C

55/56/57/58/59/60/61/62/64/69/70/71/72/73/76/78/80

tm

tm

K.K YEEEVALR.Sebuah
Melepaskan areal

56/58/85
56/57/62/71/76
58/73
62
83/84/85

Catatan: Untuk masing-masing diidentifikasi ikatan peptida, dimodifikasi asam-asam amino akan menggarisbawahi dengan jenis modifikasi dalam
superscript. tox, trioxidation; dm, dimethylation; Akulah, carbamidomethy- lation; lembu, oxidation; m, methylation.

Gbr.5. Ilustrasi dari kelimpahan ion pada beberapa aliran ion dari protein secara bersamaan dikenalpasti dalam spot 78. Dalam percobaan nanoLC-MS
dilakukan pada QTOF spectrometer massal. Analisis pertama dari titik ini dengan nanoLC-MS/MS dan sebuah perangkap ion spectrometer secara
bersamaan dikenalpasti K81, K85, K86, K31, K33a, PSP 2, dan PSP 3. Intensitas kapak merupakan orang yang sama untuk semua chromatograms. (a)
chromatogram ion puncak dasar dari tryptic mencerna dari spot 78 reanalyzed dalam LC-MS untuk pemetaan peptida. Mencatat peaks setara dengan
2+ atau 3+ terisi penuh untuk K85 peptides menurut hasil pemetaan. (b) Diekstrak chromatogram ion peralatannya () untuk m/z 931.409. Tanda
panah yang menunjukkan posisi 2+ ion bermuatan terkait ke PSP 3.1 ikatan peptida SCamSVPTGPATTFCamSFDK. (c) untuk
peralatannya m/z 869.394. Tanda panah yang menunjukkan posisi 2+ ion bermuatan terkait ke PSP 3.3 ikatan peptida GCamSVPTGPATTICamSSDK.
(d) untuk peralatannya m/z 622.337. Tanda panah yang menunjukkan posisi 2+ penuh ion untuk K31 terkait QLVESDINGLR peptida. Pemeriksaan
peralatannya menyarankan K85 sebagai protein utama di titik ini. Ion tertentu dari K83, PSP2, dan K33sebuah protein adalah di bawah batas deteksi.
Methylation diamati dengan perangkap ion pada K85 tidak terdeteksi, menyarankan tingkat rendah modifikasi ini.

Diperoleh tanpa atau dengan alkylation seperti yang

ditunjukkan dalam Fig. 4 sebagai gambar konsep ini.
Keempat, yang sebagian alkylation tidak lengkap dari
perkiraan- imately 40 hingga 70 cysteines dalam urutan
protein dapat mendorong mengisi heterogeneity dari
rantai lateral, sehingga akan meningkatkan pembubaran
protein-protein di gel. Akhirnya, perubahan seperti
deamidation dan trioxidation dari cysteine untuk cysteic
juga dapat meningkatkan asam heterogeneity ini.
Dalam kondisi-kondisi seperti ini, electrophoresis pada
pH terus-menerus, seperti sebelumnya dipekerjakan
sebelum memperkenalkan penusukan pH dalam dimensi
pertama gradien dan deteksi fluorimetric, nampaknya
lebih diadaptasi untuk carboxymethylated HSP dan migrasi
UHSP dan deteksi. Strategi ini dipimpin ke bintik-bintik
besar terkait dengan protein diharapkan [4,29,30].
Pencarian PTM yang sama yang digunakan untuk
pendekatan MudPit dilakukan pada MS/MS data-data
analisis spot. Sebuah Maskot mencari menunjukkan bahwa
hanya type II keratins K81, K83, K85, dan K86 telah
dimodifikasi, dengan identifikasi 7 PTMs dalam bintik-bintik
gel dari 28- untuk 42-wilayah kDa dan 2 PTMs dalam
bintik-bintik gel dari 14- untuk 28-kDa wilayah tersebut.

Peptides yang dimodifikasi yang telah diidentifikasi

dicantumkan dalam Table 5. Ini, 5 dapat ditetapkan
mengaitkannya ke K85 keratin karena kekhususan
mereka, dan 4 lainnya tidak dapat ditentukan untuk
sebuah keratin tertentu. Fakta bahwa tidak ada PTMs
telah diidentifikasi pada jenis I keratins dapat
dijelaskan dengan fakta bahwa

Bintik-bintik adalah kurang meluas dalam gel dibandingkan

dengan type II keratin bintik-bintik, walaupun PTM masih
challeng identifikasi- ing dalam studi proteomic tugas. Oleh
karena itu, ia adalah mungkin yang lebih PTMs ada dalam
keratins ini, khususnya dengan arah asidosis pI. Bahkan jika kita
telah mengidentifikasi beberapa PTMs pada type II keratins, results ini tidak menjelaskan massal tinggi dan paku peralihan
protein-protein pada 2-DE gel.
Signifikans biologi methylations terdeteksi pada keratins
adalah sulit untuk memahami. Tidak ada N-methyltransferases
yang ditemukan di tempat kita menganalisis, dan kegiatan
enzim ini agak dijelaskan pada histones dan berada di dalam
inti [31]. Kita dapat membuat suatu hipotesis dari nonspecific
minor kegiatan inti N-methyltrans- ferases pada rambut utama

keratins selama tahap akhir dari cortical kematian sel

untuk menjelaskan perubahan protein tak terduga ini.
Mengenai psaya dan MW peralihan, KAPs terletak di
bintik-bintik
yang
sama
seperti
keratins
dapat
menyarankan bahwa lembaran-lembaran itu kemudian
saling bertumpuk ada antara keratins dan KAPs, sehingga
menghasilkan giliran kerja ini. Memang, KAPs adalah
protein dasar dengan Low MW yang juga dapat membuat
paku peralihannya. Misalnya, PSP 2.4, yang memiliki MW
dari 13,5 kDa dan psaya kira -kira 8.3, diidentifikasi di
banyak bintik-bintik dalam 30- kDa wilayah. Jika PSP ini
mengikat ke keratin yang lebih tinggi, psaya perubahan
dalam wilayah dasar dapat terjadi untuk fragmen keratin
disertai dengan MW perubahan dalam massa yang lebih
tinggi untuk PSP. Walaupun keratins

52
(2012) 43-55

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421

Sebuah

C1b C1b
11 12

Spot 69 C1b 14

C1b 11

C1b 12

Spot 78

L12
1C1b
14

C2
3

MissingC2 3

MissingL12 1

L12 1

C1b 11
LowC2 3

C1b 14
C1b 12

Spot 80

L12 1
C1b 11

C1b 14

C2 3

C1b 12

Spot 52
LTAEVENAK
C2
11 K86/K83/K
81

LLEGEEQR
C2
17 K86/K83/
K81

AkuENAK
LTAE C2
11 K85

Tingkat sama K85

Dan K86/K83/K81 Cter fragmenfragmen

LLEGEEHR
C2 17
K85

AkuENAK
LTAE C2 11
K85

Spot 47

LLEGEEHR
C2 17
K85

Tingkat lebih
tinggi dari K85
fragmen Cter

LLEGEEQR
LTAEVENAK
C2 17
C2
K86/K83/K81
11 K86/K83/K
81

Gbr.6. Diekstrak chromatograms ion (EICs) digunakan untuk pemahaman komposisi spot. (A) Lima EICs dengan sebuah jendela toleransi massal dari
0.05 Da menurut K85 peptides dekat linker 12 di bintik-bintik 69, 78, dan 80. Masing-masing dan menurut nomenklatur kita: C1b 11 =
ATAENEFVVLK, m/z 610.83 (z = 2); C1b 12 = DVDCAYLR, m/z 506.23 (z = 2); C1b 14 = LYEEEIR, m/z 476.24 (z = 2); L12 1 =
VLQAHISDTSVVVK, m/z 503.96 (z = 3); C2 3 = DLNMDCIIAEIK, m/z 717.85 (z = 2). Dalam hal ini, peptides dari kepala ke akhir rolled 1 K85 telah
diidentifikasi dalam setiap spot. Dalam spot 80, 5 peptides yang terdeteksi sebagai berlimpah; intensitas sinar ion relatif dari peptides ini digunakan
sebagai referensi untuk membandingkan dengan ion yang bersangkutan dalam bintik-bintik lainnya. Dalam spot 78, intensitas relatif lebih rendah

untuk C2 3 ikatan peptida menunjukkan pelanggaran fragmen keratin dekat segmen ini, yang disahkan oleh peptides Cter hilang lain blok. Dalam
spot 69, kurangnya sinyal dari untuk L12 1 dan C2 3 peptides menunjukkan sebuah situs cleavage pada L12, yang disahkan oleh Cter hilang peptides
lainnya. (B) perbandingan antara dua proteotypic peralatannya peptides K urutan85 dan peralatannya dari 2 setara peptides dari isoform K86, K83,
atau K81 antara bintik-bintik 52 dan 47. Penurunan dalam intensitas K86/K83/K81 ikatan peptida menunjukkan tingkat rendah protein yang terkait
fragmen yang spot 47.

Dan KAPs diketahui untuk self-mengaitkan melalui

hubungan disulfide, ia tidak dapat dikaitkan untuk bisa
diuraikan obligasi disulfide bahawa hal-mengekstrak
diperlakukan dengan DTT dan iodoacetamide sebelum
migra- pada 2-sekuritas <DE gel untuk melekat disulfide
hubungan
dan
mencegah
pembentukan
mereka.
Hubungan lain telah dijelaskan pada rambut dan

Protein wol seperti lanthionine atau lysinoalanine cross-link

generated
setelah
pengobatan
alkaline [28] atau
dityrosine [32]. Aktivitas minase Transgluta- juga telah
dijelaskan pada rambut dan dapat mendorong hubungan
antara lisin dan glutamin rambut protein [27]. Unreducible
cross-link ini dapat menghasilkan mesin pembakaran
yang abnormal-

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421
(2012) 43-55

53

Gbr.7. Ringkasan dipetakan peptides untuk K85 dan K86 dalam diselidiki bintik-bintik. Setelah pertimbangan ikatan peptida intensitas ion tertentu
untuk setiap isoform, kami telah memberikan kontribusi fragmen yang terutama ke spot intensitas (zona bergaris bawah). Warna merah
menunjukkan ikatan peptida (proteotypic tertentu), dan warna biru menunjukkan peptides dipakai bersama oleh dua atau lebih isoforms. Perkiraan
psaya dan MW fragmen-fragmen yang terkait dihitung. Zona dalam boks yang sesuai dengan mengamati zona kelemahan keratin helical segmen.

Bintik-bintik-keunggulan dan identifikasi tak terduga gel

ini. Bagaimana pun- kurang, bukti potensi ini cross-link
tidak ditemukan oleh-MS/MS percobaan-percobaan saja.
Oleh karena itu, penyidikan akan harus dilakukan untuk
memahami-attributions tak terduga dari gel ini.
Pemetaan peptida dan kelimpahan ion analisis 2-DE
bintik-bintik gel
Untuk mendapatkan lebih banyak informasi menyeluruh
tentang identifica- dan jangkauan urutan bintik-bintik
diperoleh dari 2-DE gel dikaitkan dengan MS/MS, 12 titik
dicerna reanalyzed dengan nanoLC-QTOF (quadrupole
TOF) Sistem). Sambungan ini mengambil keuntungan
besar akurasi massal dibandingkan dengan sistem
perangkap ion. Setelah MS/MS dijalankan, untuk kedua LCMS analysis adalah per- dibentuk untuk memperoleh
sebuah
ikatan
peptida
pemetaan
dianalisis
spot
sebelumnya. Intensitas setiap chromatographic puncak
untuk setiap ikatan peptida dikenalpasti oleh MS/MS dinilai

untuk membawa infor- mation tambahan pada jenis protein

utama yang terkandung dalam setiap spot. Berkat MS
intensitas setiap ikatan peptida, kita memperoleh estimation dari kelimpahannya terkait spot. Studi pada waktu
penahan dan akurat pengukuran
massal
diizinkan
identifikasi berpotensi peptides tidak dipilih selama autoMS/
MS.

Hanya type II keratins dan tidak ada psp peptides telah

diidentifikasi dengan-MS/MS percobaan. Kita seharusnya
yang psp peptides hadir dalam terlalu rendah kelimpahan
dan ion yang bersangkutan tidak dapat memicu
autoMS/MS
percobaan.
Untuk
conhipotesis
ini
perusahaan, kami mencari di Psp, ion sebelumnya dikenal
pasti dengan nanoLC sinyal-Chip-MS/MS percobaanpercobaan sebagai PSP 3.1 berkat pengambilan jejakjejak
massal
ion
yang
bersangkutan.
Diekstrak
chromatograms ion menunjukkan sinyal yang sangat
rendah dibandingkan dengan sinyal peptides ion utama
dari type II keratins (Fig. 5, chromatograms a-c). Hasil ini
con- menguat dalam diselidiki lainnya, yang ditunjukkan
dalam bintik-bintik pres- ence dari KAPs pada tingkat
yang sangat rendah yang banyak dibandingkan

dengan type II keratin peptides dalam focalized bintikbintik. Jika mayoritas spot intensitas yang secara luas
dikaitkan kepada keratin KAPs peptides, dapat dilihat
sebagai pencemaran kecil yang ada dalam latar belakang
migrasi.
Strategi yang sama telah dilakukan pada jenis I keratins.
Kenyataannya, ion untuk beberapa jenis-peptides aku
keratins yang ditemukan dengan sinyal lemah (Fig. 5,
chromatogram d). Sinyal dari peptides dimodifikasi dengan
methylation tidak ditemukan, mungkin karena kelimpahan
rendah mereka.
Sebuah tatanama type II keratin tryptic peptides adalah
elabo- diperingkatkan untuk memetakan, dan extractions
ion untuk paling giat pep-

54
(2012) 43-55

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421

Pasang surut telah dilakukan untuk tipe II keratins K85,

K86, K81, dan K83. Dalam kasus multi-identifikasi type II
keratins dalam sama, intensitas spot peptides unik
memberikan informasi mengenai protein utama dalam
spot, sebagaimana digambarkan dalam perbandingan
peptides tertentu dari bintik-bintik 47 dan 52 (Fig. 6B).
Setelah unambig- uous deteksi sinyal peptida tertentu,
diharapkan peptides tryptic lain yang dicari. Ion kuat
secara abnormal rendah dari adja- persen keratins
peptides untuk menunjukkan kehadiran rantai disruption, yang telah ditafsirkan sebagai fragmentasi
protein di bintik-bintik 69, 78, dan 80 (Fig. 6A). Dalam
beberapa kasus, kita dikenalpasti dalam situs cleavage
berkat MS/MS dari spesies melekat (data tidak
diperlihatkan). Dalam kasus bintik-bintik 47, 51, 52, dan
60, ia lebih sulit untuk memahami pemetaan peptida
karena identifikasi Nter secara simultan dan segmen Cter
dari beberapa keratins de- walaupun rantai mereka
deteksi gangguan. Untuk mengisyaratkan secara tegas
menetapkan keratin fragmen dalam bintik-bintik, kita
menyelidiki kehadiran keratin proteotypic peptides terkait
dan melakukan kelimpahan, yang berdasarkan estimasi
pada intensitas pengukuran sinyal. Akibatnya, kami dapat
mendirikan comi- gration dari beberapa fragmen-fragmen
secara bersamaan berisi Nter dan Cter fragmen-fragmen
dengan kelimpahan serupa di titik yang sama. Information tentang fragmen-fragmen ditemukan dalam
memberikan pandangan bintik-bintik diselidiki dari lebih
banyak terjadi pada spesies mengiringi type II keratins
(Fig. 7). Kita menemukan bukti dari sebuah situs cleavage
istimewa antara tengah-rolled 1B dan tengah-rolled 2
menurut subseg- nyata yang dijelaskan dalam Ref. [33].
Kejadian-kejadian alam-min- atau fragmen dalam area
yang tidak terkena sinar serat rambut tidak dapat
dijelaskan dengan pasti, dan perilaku ini dapat akibat
waduk serat- usia sebelum atau selama pengambilan.
Namun demikian, hal ini menunjukkan suatu zona
kelemahan di segmen ini. Properti ini tampaknya yang
identik sama keratins tipe I, yang mungkin menjelaskan
cemar gugus di bawah jenis biasa saya cluster. Lokasi
cleavages tertentu dapat akibat pengaturan keratin ke
microfibrils didasari oleh keratin dimer berkumpul. Kepala
obligasi dengan ekor antara keratins dengan disulfide
linkage dapat mendorong lebih
Ketahanan wilayah-wilayah ini dari helical bagian.
Tafsiran
paling
fragmen-fragmen
menjelaskan
jumlah dipelihara bintik-bintik. Namun demikian, bintikbintik berbeda menunjukkan fragmen-fragmen dengan
distribusi peptida yang sama, yang membawa pada
pertanyaan tentang nilai-nilai yang berbeda ini aku p.
Kenyataannya, cleavage bisa dilokalisasi pada peptida
pertama tidak terdeteksi dalam ikatan peptida pergantian
rantai ana- lyzed. Pangkas dapat terjadi antara setiap
peptidic bond dalam urutan peptida ini. Jika urutan berisi
beberapa basic atau asam amino asam, paku peralihan
pada spesies yang berbeda dapat yang cukup untuk
memperoleh pemisahan berbeda berkat dimensi-pertama
electrophoresis,
meskipun
panjang
rantai
serupa.
Pemerhatian modifikasi deamidation dalam beberapa
fragmen-fragmen membawa ke mungkin penjelasan
tambahan biaya heterogeneity. Penjelasan lain untuk
bintik-bintik berbeda dengan distribusi peptida yang sama
dapat kehadiran conformational asam amino tangan kanan
Isomer tangan, seperti disarankan oleh pekerjaan Paton
dan rekan kerja [34]. Hasilnya mengecualikan hipotesis
mengenai poten- si lahan cross-link antara spesies protein
dikenalpasti sebelumnya. Migrasi yang abnormal proteinprotein di gel mungkin bisa dijelaskan oleh sebuah efek
barisan misil. Efek ini mungkin telah terjadi di kedua-dua
dimensi pertama dan kedua sebagai akibat penggunaan
kelebihan
beban
jumlah
contoh
dalam
prosedur

eksperimental kita. Hal ini dapat menjelaskan latar belakang

gel pada bintik- bintik dianalisis.

Kesimpulan
Kedua pendekatan yang dijelaskan dalam karya ini
memberikan informasi pelengkap tentang protein struktural
dari rambut manusia dan khususnya- terutama tentang
korteks yang dipisahkan dari cangkang.
Dalam pendekatan MudPit nampaknya lebih diadaptasi
untuk kajian KAPs dari pendekatan berbasis gel, yang
mungkin menyebar sinyal mereka

Secara spasial karena polymorphism tertentu serta physical dan properti kimia dari protein-protein ini. Metode 2D
LC diizinkan kita untuk mengenali lebih KAPs dengan
peptides tertentu (21 berbeda- protein tht) dibandingkan
dengan 9 ketika melakukan hanya 2-DE percobaan gel.
Strategi ini nampaknya lebih sesuai untuk studi masa
depan pada multigenic ini keluarga yang wujud pada
tingkat protein belum sempurna didirikan.
Namun demikian, 2-DE jeli dalam memimpin kepada
kajian type II keratin migraHeterogeneity sekuritas <dan mengusulkan kelemahan
istimewa wilayah pada sebuah-helix bagian-bagian hard
keratin. Informasi ini dapat
Tidak dapat diperoleh dengan pendekatan MudPit. Hasil
menunjukkan signifikans menggunakan ikatan peptida
intensitas ion selain MS/MS percobaan untuk membentuk
protein utama spesies yang memberikan kontribusi
kepada focalization dan deteksi pada 2-DE gel spot.
Menggunakan MS/ MS hanya data dapat membawa
informasi equivocal, khususnya bila spectrometer massal
menyediakan deteksi yang disempurnakan dinamika.
Studi awal ini menawarkan kita perspektif menarik
untuk
fusementara
temperatur
pembakarannya
penyelidikan. Ia memberikan kita dengan pandangan
baru dari struktur organisasi dan rambut protein.
Perbaikan akan perlu membawa kepada aspek-aspek
kualitatif dibanding kuantitatif dan KAPs keratins untuk
memahami prevalensi mereka dan untuk belajar apakah
hubungan yang ada dengan aspek turut terkodekan
kualitas rambut atau bentuk.
Pernyataan
Para penulis terima kasih Bruno A. Bernard dan
Christine Carapito untuk membaca artikel ini kritis, Franck
Zerbib untuk melakukan 2D jeli, dan Marcelle Huart untuk
menyediakan memindai microscopy elektron gambar. Kita
juga terima kasih Habel Bernot dan Yann Barilly untuk
mengedit teks Bahasa Inggris.
Referensi

[1] C. Popescu, H. Hocker, rambut yang paling canggih material

komposit biologi, Chem. Soc. Wahyu 36 (2007) 1282-1291.
[2] R. Dawber, Rambut: strukturnya dan respons untuk persiapan, Clin
kosmetik.
Dermatol. 14 (1996) 105-112.
[3] L.J. Wolfram, rambut Manusia: sebuah physicochemical unik gabungan,
J.. Acad.
Dermatol. 48 (2003) S106-S MENYASARKAN.
[4] R.C. Marshall, D.F. Referensi lengkap Orwin, Gillespie, struktur dan
biokimia mamalia hard keratin, Microsc elektron. Wahyu 4 (1991)
47-83.
[5] L. Langbein, gelar M.A., Rogers H. musim dingin, S. Praetzel, U.
Beckhaus, H.R. Rackwitz, J. Schweizer, katalog dari rambut manusia
keratins: I. Ekspresi sembilan anggota tipe I dalam folikel rambut, J.
Biol. Chem. 274 (1999) 19874-19884.
[6] L. Langbein, gelar M.A., Rogers H. musim dingin, S. Praetzel, J.
Schweizer, katalog dari rambut manusia keratins: II. Ekspresi enam
type II anggota dalam folikel rambut dan katalog gabungan dari jenis
manusia I dan II keratins, J. Biol. Chem. 276 (2001)
35123-35132.
[7] L.N. Jones, struktur rambut anatomi dan anatomi perbandingan, Clin.
Dermatol.
19 (2001) 95-103.
[8] D.A. Menangkis kritikan, S.V. Strelkov, mukasurat Burkhard, U. Aebi, H.
Herrmann, menuju keterangan molekuler peralihan struktur filamen
dan jemaah, Exp. Res. Sel 313 (2007) 2432-1799.
[9] J.W. Hearle, protein serat-serat: mekanik struktural dan peluang
masa depan, J. Almamaternya. Sci. 42 (2007) 8010-8019.
[10] gelar M.A., L. Langbein Rogers, S. Praetzel-Wunder, H. musim dingin, J.
Schweizer, rambut manusia keratin-dikaitkan protein (KAPs), Int.
Wahyu Cytol. 251 (2006) 209-263.
[11] J.W. Hearle, sebuah tinjauan kritis dari mekanik struktural dari wol
dan fibres rambut, Int. J. Biol. Macromol. 27 (2000) 123-138.
[12] R.D. Fraser, D.A. Menangkis kritikan, Unit Macrofibril dalam
trichocyte (hard alfa-) keratins, J. Struct. Biol. 142 (2003) 319-325.
[13] D.A. Menangkis kritikan, T.A. Smith, gelar M.A., J. Schweizer Rogers,
rambut manusia keratin- dikaitkan protein: Urutan Keteraturan
Empriris dan implikasi struktural, J. Struct. Biol. 155 (2006) 361369.
[14] L. Langbein, J. Schweizer, Keratins dari rambut manusia folikel, Int.
Wahyu Cytol.
243 (2005) 1-78.
[15] T.A. Smith, D.A. Menangkis kritikan, Urutan menganalisis dari tipe I
dan ketikkan rantai II di rambut manusia dan keratin intermedia
epitel filamen: wajib heterodimers rambang, ketikkan II template
untuk pembentukan molekul, dan alasan untuk pembentukan
heterodimer, J. Struct. Biol. 158 (2007) 344-357.
[16] J.E. Pembajak, W.G. Bryson, L.M. Flanagan, T.W. Yordania, masalah
yang terkait dengan identifikasi protein di dalam keluarga homolog:
bulu keratin keluarga sebagai studi kasus, mengelompok. Biochem.
300 (2002) 221-229.
[17] J.E. Pembajak, L.M. Flanagan, L.N. Paton, A.C. Fitzgerald, N.I. Joyce,
W.G. Bryson, efek oksidasi atau alkylation pada pemisahan wol keratin

Alat bantu Proteomic untuk rambut manusia protein / N.R. Barthlemy et al. / Mengelompok. Biochem. 421
(2012) 43-55
Protein oleh dua dimensi gel electrophoresis, Proteomics 3 (2003)
773950.
[18] J.E. Pembajak, S. Deb-Choudhury, A. Thomas, S. Clerens popular,
Cornellison, Olah Referensi lengkap Grosvenor, Dyer, yang
dilakukan kelimpahan wol rendah protein melalui teknik ekstraksi
diferensial novel, Electrophoresis 31 (2010) 1937-1946.
[19] M.L. Referensi lengkap Fournier, Gilmore, S.A. Martin-Brown, M.P.
Washburn, pemisahan shotgun berbasis Multidimensi proteomics,
Chem. Wahyu 107 (2007) 3654-3686.
[20] D.A. Wolters, M.P. J.R. Washburn, Yates 3Rd, sebuah protein
multidimensi otomatis teknologi identifikasi untuk shotgun
proteomics, mengelompok. Chem. 73 (2001) 5683-5690.
[21] Y.J. Lee, R. Beras, Y.M. Lee, analisis Proteome poros rambut
manusia:
dari
identifikasi
protein
untuk
posttranslational
modifikasi, Mol. Sel. Proteomics 5 (2006) 789-800.
[22] gelar M.A., Rogers H. musim dingin, L. Langbein, A. Wollschlager, S.
Praetzel-Wunder, L.F. Jave-Suarez, J. Schweizer, Penyifatan PSP24.1
manusia,
sebuah
rambut
cuticular
keratin
protein
yang
berhubungan dengan dengan komposisi asam-asam amino yang
tidak biasa dan ulangi struktur, J. berinvestasi. Dermatol. 127
(2007) 1197-1204.
[23] gelar M.A., L. Langbein Rogers, H. musim dingin, I. Beckmann, S.
Praetzel, J. Schweizer, Rambut keratin dikaitkan karakterisasi
protein: detik high sulphur psp domain gen pada 21 kromosom
manusia, J. berinvestasi. Dermatol. 122 (2004) 147-158.
[24] J.E. Folk, J.S. Finlayson mengatakannya, e-(c-glutamyl)lisin crosslink
dan peran yang telah dirumuskan
Dari transglutaminases, Adv. Chem protein. 31 (1977) 1-133.

55

[25] K. Yoneda, M. Akiyama, K. Morita, H. Shimizu, S. Imamura, S.Y. Kim,

Ekspresi transglutaminase 1 di rambut manusia follicles, kelenjar
sebaseus, dan kelenjar peluh, Br. J. Dermatol. 138 (1998) 37-44.
[26] S. Thibaut, E. Candi, V. Pietroni, G. Melino, R. Schmidt, gelar B.A.
Bernard, Transglutaminase 5 ekspresi dalam rambut manusia folikel, J.
berinvestasi. Dermatol. 125 (2005) 581-585.
[27] S. Thibaut, N. Cavusoglu, E. de Becker, F. Zerbib, A. Bednarczyk, C.
Schaeffer, A. van Dorsselaer, gelar B.A. Bernard, enzim
Transglutaminase-3: sebuah diduga pelaku rambut manusia poros
penggerak perancah?, J berinvestasi. Dermatol. 129 (2009) 449459.
[28] H. Zahn, H.G. Gattner, Rambut belerang analisis asam amino, EXS 78
(1997) 239-258. [29] REFERENSI LENGKAP R.C. Gillespie, Marshall,
perbandingan protein-protein dari normal dan trichothiodystrophic rambut
manusia, J. berinvestasi. Dermatol. 80 (1983) 195 202.
[30] R.C. Marshall, karakterisasi protein-protein dari rambut manusia
dan gantungan yang dipasang kuat-kuat oleh electrophoresis, J.
berinvestasi. Dermatol. 80 (1983) 519-524.
[31] Y. Zhang, D. Reinberg, Transkripsi peraturan oleh histone
methylation: interaksi antara covalent berbeda modifikasi pada inti
ekor histone, Gen Dev. 15 (2001) 2343-488.
[32] K. Stewart, P.L. Spedding, M.S. Otterburn, D.M. Lewis, lapisan
permukaan dari bahan wol: I. sintesis Dityrosine dan karakterisasi,
J. Hukum <. Polym. Sci. 66 (1997) 886- 2363.
[33] Mukasurat Coulombe, M. Omary, prinsip-prinsip yang keras dan
lunak menentukan struktur, fungsi, dan peraturan keratin
intermediate filamen, Curr. Opin. Biol sel. 14 (2002) 110 122.
[34] L.N. Paton, J.A. W.G. Gerrard, Bryson, penyelidikan terhadap isi
heterogeneity dari bahan wol filamen peralihan protein, J.
Proteomics 71 (2008) pada 513 sebelum-529.