1. Sebutkan macam-macam pewarnaan !

Pewarnaan Negatif
bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarnaan sederhana, hanya digunakan satu macam
zat warna untuk mewarnai sel-sel bakteri.
Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-
asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga
menghasilkan warna merah.
Pewarnaan Struktural atau khusus
untuk mewarnai struktur khusus dari bakteri seperti kapsul, spora, flagel dan nukleolus.
Pewarnaan Diferensial/Pewarnaan Gram
metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram
positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selnya. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853
1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
2. Mengapa bakteri gram positif bisa tewarnai biru ungu sedangkan

bakteri gram negatif terwarnai merah muda ?

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan

mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan
kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya.
Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram positif dan gram negatif
berdasarkan kemampuannya untuk menahan pewarna primer (kristal ungu) atau
kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan (safranin). Bakteri gram positif
menunjukkan warna biru atau ungu dengan pewarnaan ini (gambar I.11), sedangkan
bakteri gram negatif menunjukkan warna merah.
Perbedaan reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.
Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma dan bakteri yang tergolong bakteri tahan
asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus
Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat
lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut
relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut
tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram.
Proses pewarnaan gram dimulai setelah dilakukan fiksasi pada olesan, kemudian ditetesi
dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan
sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk
mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci
dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu
kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan
air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci
dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop.
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan
pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding
selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri,
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah
pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel
dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan lipid dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikannya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10
15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih
banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
Lapisan kaku, tidak mengandung asam
tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80
nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang
lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tunggal.
Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh
zat-zat warna seperti ungu kristal.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat
oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relative
sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih
pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih
rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin
Endotoksin
3. Contoh Bakteri gram positif dan gram negatif ?

1. Mengapa perlu dilakukan pengocokan tabung reaksi berisi biakan

sebelum diambil ?

Hal ini bertujuan agar tidak ada endapan bakteri di bagian bawah tabung.
2. Mengapa pada media padat perlu ditambahkan air steril sedangkan pada
media cair tidak?

Pada media padat, perlu ditambahkan air steril karena sel-sel pada medium padat
cenderung melekat dengan sesamanya, sehingga jika tidak diberi air steril, bakteri akan
saling tumpang tindih dan hal ini yang menyulitkan pengamatan. Sedangkan pada media
cair tidak perlu ditambahkan air steril karena sel-sel bakteri dalam medium cair dapat
bergerak bebas dan tidak melekat dengan sesamanya, sehingga tidak diperlukan lagi air
steril seperti media padat.
3. Apa yang Anda ketahui tentang fiksasi ?

Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel
mikroorganisme pada suatu posisi. Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk menonaktifkan
enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat
diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan
belum kering akan menyebabkan sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi
tidak beraturan bentuknya. Tujuan dari fiksasi adalah pelekatan bakteri supaya pada saat
pencucian, bakteri tersebut tidak ikut hilang tercuci. Fiksasi yang digunakan pada
percobaan kali ini adalah fiksasi panas, yaitu dengan cara melewatkan kaca preparat di
atas api. Fiksasi dilakukan sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada
 punggung tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena
bakteri yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan bentuk
dan penyusutan sel.
4. Apa fungsi pewarna ungu kristal dan apa konsekuensi jika proses
pewarnaan terlalu lama atau cepat ?

Zat pewarna ini berfungsi untuk memberikan warna ungu pada semua bakteri. Proses
yang dilakukan selama 1 menit, karena jika terlalu lama maka warna ungu ini akan
menembus dinding sel, sehingga akan sulit membedakan gram positif dan negatif. Tetapi
jika kurang dari 1 menit, zat warna ungu akan kurang melekat sehingga akan
menyulitkan pengamatan.
5. Apa fungsi iodin gram?

Iodine gram sering disebut dengan zat mordan. Zat mordan sendiri adalah zat yang
dapat membuat zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel dengan membentuk
kompleks iodine-violet. Selain itu, penambahan iodine gram bertujuan agar sel-sel
bakteri akan dapat diwarnai lebih intensif dan akan menyebabkan pewarna terikat lebih
kuat pada jaringan sel.
6. Apa fungsi ethanol dan apakah bisa diganti dengan zat lain , sebut
beserta alasannya ?

Penambahan etanol 95% ini berfungsi untuk memucatkan warna ungu kristal pada kaca
preparat yang sudah menempel pada olesan bakteri tersebut. Selain digunakan etanol
sebagai pemucat, dapat juga digunakan zat lain yang dapat melarutkan kompleks ungu-
iodium, contohnya aceton. Namun, aceton merupakan pemucat yang bekerja paling
cepat sehingga dikhawatirkan akan terjadi pemucatan yang berlebihan. Pemucatan ini
akan mengakibatkan bakteri gram negatif kehilangan warnanya dan kembali menjadi tak
berwarna, namun bakteri gram positif tetap berwarna ungu/ biru.
7. Apa fungsi safranin dan mekanismenya sehingga bisa dibedakan antara
gram positif dan gram negatif ?

Safranin merupakan pewarna tandingan yang akan memberikan warna merah muda
pada bakteri. Setelah digenangi dengan pewarna tandingan, olesan dibilas dengan
aquades. Bakteri gram negatif yang tidak berwarna kemudian akan menyerap warna ini
sehingga berwarna merah muda sedangkan bakteri gram positif yang telah berwarna
ungu/biru tidak akan menyerap warna ini (warna merah muda dari safranin). Hal ini
disebabkan karena adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positif dan
bakteri negatif, dimana bakteri gram positif mempunyai dinding sel yang lebih tebal dan
mengandung sedikit lipid dibandingkan dengan dinding bakteri gram negatif yang
mengandung banyak lipid. Ketika pemucatan dinding sel yang tebal pada bakteri gram
positif akan mengalami penyusutan oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi,
yang menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah terlarutnya warna ungu
kristal-iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan sel bakteri gram negatif mempuyai
 kandungan lipid yang lebih tinggi dari pada dinding selnya. Dan lipid pada umumnya
mudah larut pada pelarut yang polar seperti alkohol ataupun aseton. Dengan larutnya
lipid pada dinding sel bakteri gram negatif akan memperbesar pori-pori dinding sel
sehingga warna ungu kristal-iodium akan lebih mudah hilang pada saat langkah
pemucatan.
8. Berapakah perbesaran yang dipakai untuk pengamatan bakteri dan apa
alasannya ?

Pengamatan dilakukan dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x. Hal ini dikarenakan
ukuran bakteri yang sangat kecil, jika menggunakan perbesaran biasa, akan menyulitkan
pengamat dalam pengamatan bakteri.
9. Mengapa pada saat pengamatan perlu diberikan minyak imersi antara
preparat dan lensa objektif ?

Hal ini dikarenakan, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda,
yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu
membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang
mendekati garis normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara
dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak
imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau
identik dengan kaca.
10. Faktor-faktor apa saja yang dapat membuat bakteri gram positif dapat
menjadi gram negatif begitupun sebaliknya !

a. Metode dan teknik yang digunakan Pemanasan yang berlebihan selama fiksasi,
dekolorisasi yang berlebihan dengan alkohol, dan bahkan pembilasan dengan air yang
terlalu banyak pada tiap langkah dapat menyebabkan bakteri gram positif kehilangan
kompleks kristal violet-iodine.
b. Umur dari biakan Biakan dengan umur lebih dari 24 jam akam kehilangan kemampuan
untuk menahan kompleks kristal violet-iodine.
c. Organisme itu sendiri Beberapa bakteri gram positif lebih dapat menahan kompleks
kristal violet-iodine dibandingkan dengan lainnya.
d. Perubahan keasaman. Bila pH turun kemungkinan bakteri gram positif dapat berubah
menjadi gram negatif. Sebaliknya bila pH naik ada kemungkinan bakteri-bakteri gram
dapat berubah menjadi gram positif.
e. Faktor medium Misalnya bakteri-bakteri gram positif yang lemah bila terlalu lama
ditumbuhkan dalam medium yang mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat
berubah menjadi gram negatif.
f. Kerapatan sel pada olesan Semakin rapat suatu sel bakteri akan semakin sukar
hilangnya warna ungu kristal pada saat langkah pemucatan, oleh karena itu pada saat
diberi warna tandingan sel bakteri tetap berwarna ungu, padahal bakteri tersebut
merupakan bakteri gram negatif.