2. Apa yang Anda ketahui mengenai perhitungan jumlah bakteri ?

Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak
langsung) Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara
langsung. Penghitungan mikroba secara langsung antara lain:

1. Plate Count (hitungan cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel
mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah
ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah
diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau
dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.

2. Turbidimetri

Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri

dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya
sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika
mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair,
terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical
density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm
700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah
organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran
optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).

3. Hemasitometer

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung

terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi
menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi
lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi
400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang
tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah
bakteri per satuan volume dapat diketahui.

3. Apa yang Anda ketahui mengenai Hemasitometer ?

Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan

perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang
rendah. Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel
darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles Malassez.

Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume

dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki
persegi-persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm.
Jika di atas bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan
terbentuk ruangan yang tingginya 0,1 mm. Sehingga volume dari satu persegi
kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-5 mm3.
Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat
menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna
yang digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam
larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan
berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat
mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi kontaminasi.(id.wikipedia.org)

Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-

Improved.

4. Apa saja kelemahan dan kelebihan dari metode perhitungan bakteri

secara langsung ?

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan

banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:

Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup.
Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah
jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel
eukariotik, penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1
%) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel mati.
Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru
metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara
enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.

Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti

bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya
lensa obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini
biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah
dilihat.

Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup

tinggi, minimal untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang
pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung

Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan

yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut
akan mengganggu dalam perhitungan sel.

Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil
seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan
digunakannya lensa obyektif celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara
mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kadang-kadang sel
cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara
mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat
dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.

5. Bagaiman cara menghitung sel mikroorganisme dengan ruang hitung ?

Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian
supaya tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu :

Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang
diamati/dihitung.

Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang
diamati/dihitung.

6. Bagaiman metode perhitungan untuk percobaan kali ini ?

Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan

pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2
terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar
terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer digunakan di bawah mikroskop,
sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran
nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat
dihitung sebagai berikut:

Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak

Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar (1/0,02)

Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel 103

= Jumlah sel per kotak besar 25 kotak

(1/0.02)x 10^3

Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak 50 103

Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka
jumlah sel per ml sampel adalah: 12 1,25 106 = 1,5 107.

7. tujuan dilakukannya scrub pada NA miring yang berisi biakan dan tujuan
penggunaan air steril

Hal ini dimaksudkan agar spora Aspergillus niger dapat lepas dan
tersuspensi dalam air steril.

Penggunaaan air steril untuk membuat suspensi spora dimaksudkan agar

tidak terdapat mikrooba lain yang terlarut dalam suspensi. Tersuspensinya spora
dalam air steril ditandai dengan berubahnya warna air steril dari jernih menjadi
keruh.

8. Apa tujuan dilakukannya pembersihan hemasitometer menggunakan

alkohol

Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan

hemasitometer dan cover glass dengan menggunakan alkohol. Hal ini
dimaksudkan agar hemasitometer bersih dari debu dan kuman yang dapat
mengganggu perhitungan.
9. Mengapa setelah membilas, hemasitometer tidak boleh dilap dengan
menggunakan tisu biasa ?

Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan

menggunakan tisu lensa. Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-
gosokkan pada permukaan hemasitometer. Hal ini bertujuan agar garis-garis
yang terdapat pada hemasitometer tidak hilang.

10. Setelah dilakukan 2 hal di atas, apa lagi yang harus dilakukan sebelum
pengamatan ?

Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan
terlebih dahulu dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk
membersihkan debu dan kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan
mikroba.

11. besar pengamatan yang digunakan untuk pengamatan pada hemasitometer

adlh 400 kali

12. Apa sebenarnya tujuan dilakukan pengenceran ?

Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu

jumlah mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian,
kesalahan penghitungan dapat diminimalkan.

13. Langkah Kerja !

a. Dituangkan air steril sebanyak 5 mL pada media agar miring yang telah
ditumbuhi koloni Aspergilus niger hingga seluruh bagian media agar miring yang
ditumbuhi koloni terbasahi.

b. Digaruk (scrubbing) koloni Aspergilus niger pada media agar miring yang
telah terbasahi dengan menggunakan kawat ose hingga air steril dalam tabung
terlihat keruh.

c. Dibersihkan permukaan ruang hitung (hemasitometer) dengan secarik kertas

lensa yang telah dibasahi dengan setetes air suling. Dibersihkan juga kaca tutup
ruang hitung sampai tidak lagi tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya.

d. Diambil suspensi Aspergilus niger secukupnya dengan menggunakan pipet

tetes dan diletakkan pada tepi kaca tutup, maka dengan sendirinya tetesan
tersebut akan mengalir ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang hitung.

e. Ditutup ruang hitung dengan kaca penutup dan diletakkan di atas pentas
mikroskop dengan hati-hati

f. Diamati jumlah sel kapang dengan obyektif 400 kali.

g. Dilakukan perhitungan jumlah sel kapang dalam 5 persegi besar (80 persegi
kecil) sebanyak dua kali (duplo), yaitu pada bagian atas dan bawah
hemasitometer. Jika jumlah sel kapang dalam 1 persegi kecil > 10 sel dan dalam
1 persegi besar > 100 sel, maka suspensi kapang perlu diencerkan.
h. Pengenceran 1:10 dilakukan dengan cara 1 mL suspensi Aspergilus niger
diambil dengan menggunakan pipet ukur 1 mL dan diletakkan pada labu takar 10
mL. Kemudian, ditambahkan air steril hingga batas labu takar dan digoyang
hingga suspensi kapang homogen.

i. Langkah 4 sampai 7 diulangi.

j. Dihitung jumlah rata-rata sel kapang dari dua kali perhitungan tersebut.