Protokol Penelitian

A. Judul Penelitian

Uji Aktivitas Antibakteri Infusa Buji Buah Langsat (Lansium domesticum Cor.)
terhadap Streptococcus pneumoniae

B. Latar Belakang
Pengobatan tradisional adalah pengobatan dan/atau perawatan dengan cara,
obat dan pengobatnya yang mengacu kepada pengalaman, keterampilan turun
temurun, dan/atau pendidikan/pelatihan, dan diterapkan sesuai dengan norma
yang berlaku dalam masyarakat (Keputusan Menteri Kesehatan RI, 2003). Obat
tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan,
bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran bahan
tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan
berdasarkan pengalaman (Peraturan Menteri Kesehatan RI, 2012).
Tanaman obat merupakan salah satu pengobatan tradisional yang semakin
menunjukan peran dan eksistensinya dalam mewujudkan kesehatan global.
Tanaman obat berperan dalam strategi pengobatan severe acute respiratory
syndrome (SARS) di China (WHO). Hingga saat ini pengobatan tradisional
masih dipertahankan sebagai pengobatan primer oleh 80% penduduk di Negara
berkembang di dunia (Verma dan Singh, 2008).
Indonesia adalah negara yang sangat potensial untuk mengembangkan
tanaman obat (Korompis et al., 2010). Hutan tropis Indonesia merupakan tempat
tumbuh 80% dari tanaman obat yang ada di dunia (Pribadi, 2009). Langsat
(Lansium domesticum Cor.) merupakan salah satunya. Data empiris menunjukan
air rebusan batang, daun, biji, kulit buah dan kulit kayu langsat (Lansium
domesticum Cor.) digunakan sebagai obat disentri, antidiare, penurun panas,
obat cacing, antikolik, dan malaria oleh masyarakat Jawa, Kalimantan, dan
Malaya (Arbiastutie dan Muflihati, 2008 dan Lim, 2012). Pemanfaatannya
sebagai obat disentri mengindikasikan langsat memiliki aktivitas antibakteri.

1
 Antibakteri adalah senyawa yang digunakan untuk pengobatan penyakit
infeksi yang disebabkan oleh bakteri (Oktavianti, 2009). Identifikasi metabolit
sekunder dalam ekstrak biji langsat (Lansium domesticum Cor.) menunjukan
adanya kandungan alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan saponin yang memiliki
daya antibakteri dengan aktivitasnya pada dinding sel, membran sel, protein,
metabolism sel, dan sintesis asam nukleat (Tanaka et al., 2002; Arbiastutie dan
Muflihati, 2008; Dong et al., 2010). Ekstrak etanol biji buah langsat memiliki
aktivitas antibakteri terhadap Escericia coli, Vibrio cholera, dan Staphylococcus
aureus (Korompis et al., 2010). Penelitian lain membuktikan ekstrak etanol biji
buah langsat hasil pengeringan memiliki aktivitas antibakteri lebih kuat
dibanding ampisilin terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella typhii serta
aktivitas antibakteri yang kuat melawan Bacillus cereus walaupun tidak sebaik
ampisilin (Chaisawadi). Keterbatasan eksplorasi pada bakteri gram positif serta
belum dilakukannya uji terhadap bakteri patogen pada sistem pernapasan
menjadi ketertarikan tersendiri untuk melakukan uji terhadap Streptococcus
pneumoniae.
Streptococcus pneumoniae adalah bakteri gram positif penyebab tersering
infeksi saluran pernapasan oleh bakteri yang terjadi di komunitas, meningitis,
bakteremia, dan otitis media khususnya pada anak di bawah 2 tahun dan lanjut
usia (WHO, 2011). Beragam dan beratnya penyakit yang ditimbulkan
dikarenakan oleh faktor virulensi yang bervariasi yang terdapat pada struktur
kapsul, dinding sel, maupun komponen protein intraselular (Velasco, et al.,
1995). Maka dari itu, untuk melawan infeksi diperlukan substansi yang dapat
bekerja pada komponen virulensi tersebut.
Beban penyakit, resistensi, dan efek samping antibiotik untuk terapi
Streptococcus pneumoniae merupakan masalah besar lain yang menjadi
tantangan. Centre for Disease Control and Prevention (CDC) melaporkan
hingga tahun 2000 terdapat 100.000-135.000 pasien dirawat karena pneumonia,
6 juta karena otitis media, dan 60.000 karena penyakit invasif termasuk 3.300
karena meningitis (CDC, 2008). Terdapat 151,8 juta kasus baru pneumonia
setiap tahunnya. Kawasan dengan jumlah kasus baru per tahun terbanyak adalah
South East Asia Region (SEAR) sebanyak 60,95 juta kasus. Sekitar 74% (115,3
 juta) kejadian pneumonia terkonsentrasi pada 15 negara, termasuk di dalamnya
Indonesia (6 juta kasus baru per tahun) menduduki peringkat ke lima setelah
India, China, Bangladesh dan Nigeria (Rudan, 2008). Pneumonia adalah
penyebab kematian tertinggi kedua setelah diare diantara balita (15,5%) dan
selalu menduduki 10 besar penyakit terbanyak di Indonesia (Buletin Jendela
Epidemiologi, 2010). Beban ekonomi yang harus ditanggung akibat resistensi
Streptococcus pneumoniae terhitung EUR 150 juta per tahun (Norrby, 2009).
Disamping itu, resistensi terhadap penisilin dan antibiotik golongan -laktam
lainnya telah ditemukan sejak tahun 1967 dan tahun 1978 telah berkembang
multi drug resistant Streptococcus pneumoniae yang resisten terhadap makrolid
dan beberapa golongan antibiotik lainnya (Chiou, 2006). Penemuan agen
terapeutik juga semakin urgen seiring efek samping antibiotik pilihan yang
menimbulkan efek samping seperti hipersensitivitas, diare, nefritis, dan hepatitis
kolestatik (Golan et al., 2008 dan Pharm et al., 2009).
Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antibakteri infusa biji buah
langsat (Lansium domesticum Cor.) yang berasal dari daerah Kalimantan Barat
terhadap Streptococcus pneumoniae yang belum pernah diteliti sebelumnya,
yang menjadi masalah kesehatan dunia akibat beban penyakit, ancaman
resistensi, efek samping antibiotik pilihan. Pemilihan pelarut akuades
dilatarbelakangi oleh penggunaan biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.)
sebagai obat di masyarakat dengan cara rebusan. Pemilihan biji dilakukan
berdasarkan pertimbangan kandungan zat aktif yang telah teridentifikasi,
penyediaan bahan dasar yang mudah, dan adanya fungsi pemanfaatan limbah.

C. Rumusan Masalah
1. Apa saja metabolit sekunder yang terkandung dalam infusa biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.)?
2. Apakah infusa biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.) memiliki
aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus pneumoniae?
D. Hipotesis

Senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam biji buah langsat

(Lansium domesticum Cor.) adalah alkaloid, terpenoid, flavonoid, dan saponin.
Kandungan metabolit sekunder membuat infusa biji buah langsat (Lansium
domesticum Cor.) memiliki aktivitas antibakteri yang bersifat bakterisid terhadap
Streptococcus pneumoniae. Setiap pemberian konsentrasi infusa biji buah
langsat (Lansium domesticum Cor.) memiliki hubungan yang tidak searah
dengan pertumbuhan koloni bakteri Streptococcus pneumoniae.

E. Tujuan dan Manfaat Penelitian

1. Tujuan
a. Mengetahui kandungan metabolit sekunder infusa biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.).
b. Mengetahui aktivitas antibakteri infusa biji buah langsat (Lansium
domesticum Cor.) terhadap Streptococcus pneumoniae.

2. Manfaat
a.Bagi masyarakat:
Memberikan informasi pembuktian tentang potensi infusa biji buah
langsat (Lansium domesticum Cor.) sebagai tanaman obat yang diyakini
masyarakat memiliki aktivitas antibakteri.
b. Bagi lembaga pendidikan:
1) Memperkaya khasanah penelitian tanaman obat endemik Kalimantan
Barat, terutama tanaman yang memiliki aktivitas antibakteri.
2) Memperkaya literatur penelitian tanaman langsat (Lansium
domesticum Cor.) yang dapat dijadikan acuan penelitian selanjutnya.
c.Bagi penulis:

1) Membuka wawasan akan tanaman sebagai sumber obat, terutama

antibakteri, yang potensial.
2) Memperkaya pengalaman penelitian dalam pengembangan tanaman
obat sebagai antibakteri.

F. Kerangka Teori Dan Kerangka Konsep

 1. Kerangka Teori

Biji buah langsat

Menghambat sintesis protein

Menghambat sintesis dinding Alkaloid

Terpenoid
Mekanisme Kerja Flavonoid
Mengganggu keutuhan membran
Saponin

Antibakteri Mengganggu metabolisme

Menghambat sintesis/merusak asam nukleat

Spektrum Luas (Broad) Potensi Antibakteri

Sempit (Narrow)

Toksisitas Selektif Bakteriostatik Potensi antibakteri infusa

Bakterisid
2. Kerangka Konsep

KHM KBM
 Variabel bebas:
Variabel terikat:
biji buah langsat 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,19%
Pertumbuhan bakteri Streptococcus pneumonia

Variabel terkendali:
Suhu inkubasi
Waktu
pH
Media
Sterilitas
G. Metodologi Penelitian

1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni (true experimental
design) dengan rancangan postest only control group design yang dilakukan
di laboratorium (Imron, 2010).
Rangkaian penelitian meliputi pembuatan infusa biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.), skrining fitokimia, dan uji aktivitas antibakteri
terhadap Streptococcus pneumoniae. Variabel yang diukur dalam penelitian
ini adalah pertumbuhan bakteri pada setiap konsentrasi infusa yang diberikan
untuk kemudian dianalisis secara statistik. Selain itu, melalui metode dilusi
ditetapkan pula konsentrasi hambat minimum (KHM) dan konsentrasi bunuh
minimum (KBM).

2. Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu : Desember 2012 sampai dengan Juli 2013
Tempat : Laboratorium Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas
Tanjungpura, Unit Laboratorium Kesehatan Pontianak, dan Laboratorium
Mikrobiologi Jurusan Analis Poltekes Pontianak
3. Alat dan Bahan Penelitian
a. Instrumen yang digunakan adalah pisau, ember, blender, wadah,
panci infusa, kain flannel, timbangan, vial steril, rak tabung, kertas
saring, ose, bunsen, penjepit, sarung tangan, masker, desikator, cawan
porselen, colony counter, oven listrik, inkubator, lemari asam, autoklaf,
laminary airflow, biosafety cabinet, lemari es, dan seperangkat alat kaca.
b. Bahan yang digunakan adalah buah langsat, tanaman anakan langsat,
daun langsat, biji buah langsat, akuades steril, silica gell, agar darah,
Mueller Hinton Broth, larutan NaCl 0,9%, FeCl3 5%, CH3COOH glasial,
serbuk magnesium, HCl pekat, H2SO4 pekat, FeCl3 1%, pereaksi Mayer,
kloroform, biakan murni Streptococcus pneumoniae, dan larutan standar
(Mc Farland 0,5).

4. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi penelitian ini yaitu bakteri Streptococcus pneumoniae,
sedangkan sampel penelitian adalah biakan Streptococcus pneumoniae murni
yang didapat dari Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia.

5. Perhitungan Pengulangan Percobaan

Kelompok perlakuan dalam penelitian ini berjumlah 10 kelompok yaitu

pemberian infusa dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%,
3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,19%. Kelompok kontrol terdiri atas kontrol
negatif, kontrol positif, dan kontrol pelarut. Pengulangan minimal dalam
penelitian ini dapat dihitung dengan rumus Frederer sebagai berikut
(Supranto, 2000):

(t-1) (r-1) 15
(15-1) (r-1) 15
14 (r-1) 15
14 r 14 15
14r 15+14
r 29:14
r 2,07
6. Variabel dan Definisi Operasional
a.Variabel
1) Variabel bebas: konsentrasi infusa biji buah langsat (Lansium
domesticum Cor.) yang terdiri atas 10 kelompok.
2) Variabel tergantung: pertumbuhan bakteri uji dalam satuan colony
forming unit per ml.
3) Variabel terkendali: suhu inkubasi, waktu, sterilitas, dan media.
b. Definisi Operasional
1) Konsentrasi infusa biji buah langsat: terdiri atas 12 konsentrasi yaitu
200%, 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25 %, 3,125%, 1,56%, 0,78%,
0,39%, 0,19%, dan 0,095%. Konsentrasi infusa berupa skala
kategorik.
2) Pertumbuhan bakteri: bakteri yang tumbuh pada setiap konsentrasi,
dihitung secara manual dengan colony counter, dinyatakan dalam
colony forming unit. Pertumbuhan bakteri berupa skala numerik.
3) Konsentrasi hambat minimum: konsentrasi terkecil yang
memperlihatkan kejernihan.
4) Konsentrasi bunuh minimum: konsentrasi terendah yang tidak ada
pertumbuhan bakteri.
5) Kontrol positif: sebagai kontrol kekeruhan dan pertumbuhan bakteri.
6) Kontrol negatif: sebagai kontrol kejernihan dan tidak adanya
pertumbuhan bakteri.
7) Kontrol pelarut: kontrol aktivitas antibakteri pelarut.

7. Cara Penelitian
a.Determinasi Tanaman
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Rosidae
Ordo : Sapindales
Famili : Meliaceae
 Genus : Lansium
Spesies : Lansium domesticum Cor.

b. Pemanenan
Pemanenan dilakukan di pagi hari saat buah dipastikan matang yaitu
saat usia buah enam bulan, terhitung sejak bunga mekar (Lim, 2012).
Langsat (Lansium domesticum Cor.) diambil dari kebun yang terletak di
Jl. Parit Banjar, Desa Punggur, Kecamatan Sei Kakap, Kalimantan Barat.

c.Pembuatan Simplisia
1) Sortasi basah, dilakukan pembebasan buah langsat dari tangkai atau
bagian tanaman lainnya, dari kotoran, dan benda asing lainnya
(Gunawan, 2004).
2) Pengupasan kulit dan daging buah, dilakukan sebelum pencucian
(Gunawan, 2004)
3) Pencucian dilakukan menggunakan air PAM (Gunawan, 2004).
4) Pengubahan bentuk (perajangan), dilakukan dengan pisau atau mesin
perajang khusus sehingga diperoleh irisan tipis atau potongan dengan
ukuran tertentu (Agoes, 2009).
5) Pengeringan, dilakukan degan teknik pengeringan di bawah sinar
matahari selama tiga hari dari pukul 10.00 hingga 15.00 (Mamun et
al., 2006).
6) Sortasi kering, dilakukan dengan membebaskan dari biji-biji yang
gosong saat pengeringan (Gunawan, 2004).
7) Penggilingan, dilakukan untuk memperluas permukaan. Ukuran
simplisia diperkecil, namun tidak sampai menjadi serbuk (Agoes,
2009).
8) Pengepakan menggunakan plastik bersih (Gunawan, 2004).

d. Sterilisasi Alat dan Bahan

1) Alat-alat kaca disterilkan dengan metode sterilisasi udara panas.
Proses tersebut dilakukan dengan udara yang dipanaskan dalam
sterilisator udara panas (oven) pada suhu 1800C selama 1 jam
(Kusuma, 2012).
 2) Media dan bahan-bahan berupa larutan disterilisasi dengan metode
sterilisasi uap. Penanganannya dilakukan dengan uap air jenuh
bertekanan tinggi dalam sterilisator uap, tekanan sebesar 15 dyne/cm3
(1 atm) dan suhu sebesar 121oC selama 20 menit (Kusuma, 2012).
3) Ose dibakar dengan nyala bunsen (Silaban, 2009).

e.Pembuatan Infusa
Langkah pembuatan infusa adalah sebagai berikut (Syamsuni, 2006;
Saputra, 2012; Pratiwi, 2012):
1) Masukan 10 gr serbuk simplisia ke dalam tabung Erlenmeyer.
2) Tambahkan akuades steril sebanyak 100 ml. penambahan jumlah
akuades adalah hingga dua kali bobot simplisia.
3) Panaskan di atas water bath selama 15 menit terhitung mulai suhu
mencapai 90C sambil sesekali dikocok.
4) Saring air rebusan dengan menggunakan kertas flannel steril selagi
panas ke dalam tabung Erlenmeyer steril lainnya.
5) Jika infusa yang dihasilkan kurang dari 100 ml, maka ditambahkan
akuades steril hingga 100 ml sehingga konsentrasi infusa yaitu 100%.
6) Tutup tabung dengan kapas dan aluminiom foil yang sebelumnya
telah disterilkan sampai infusa digunakan dalam pengujian.
7) Infusa 200% dibuat dengan perbandingan 20 gr simplisia dalam 100
ml akuades. Langkah pembuatan sama seperti di atas.

f. Skrining Fitokimia
1) Pemeriksaan Alkaloid
Sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu
ditambahkan 5 tetes kloroform dan beberapa tetes pereaksi Mayer.
Terbentuknya endapan putih mengindikasikan adanya alkaloid
(Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan alkaloid dilakukan triplo.

2) Pemeriksaan Fenol
Sampel sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan beberapa tetes air panas dan beberapa tetes pereaksi
 FeCl3 1%. Perubahan warna larutan menjadi warna hijau, biru atau
ungu menunjukkan adanya senyawa fenol (Atmoko dan Maruf,
2009). Pemeriksaan fenol dilakukan triplo.

3) Pemeriksaan Flavonoid
Sampel sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan dengan serbuk Mg sebanyak 1 gram dan larutan HCl
pekat. Perubahan warna larutan menjadi warna kuning menandakan
adanya flavonoid (Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan flavonoid
dilakukan triplo.

4) Pemeriksaan Saponin
Sampel sebanyak 2 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan 10 mL air, setelah itu dikocok dengan kuat selama 10
menit. Buih yang terbentuk menunjukkan adanya saponin (Lailatul et
al., 2010). Pemeriksaan saponin dilakukan triplo.

5) Pemeriksaan Steroid dan Terpenoid (uji liebermann-burchard)

Sampel sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan dengan 1 mL CH3COOH glasial dan 1 mL larutan
H2SO4 pekat. Jika warna larutan berubah menjadi biru atau ungu,
menandakan adanya kelompok senyawa steroid, jika warna larutan
berubah menjadi merah menunjukkan adanya kelompok senyawa
terpenoid (Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan steroida dan terpenoida
dilakukan triplo.

6) Pemeriksaan Tannin
Sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan beberapa tetes FeCl3 5%. Bila terbentuk warna biru tua
menunjukkan adanya tanin (Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan tanin
dilakukan triplo.

g. Pembuatan Media
1) Tryptic Soy Broth
 a) Timbang 0,75 gr media tryptic soy broth lalu masukan ke dalam
tabung Erlenmeyer.
b) Tambahkan 25 ml akuades yang sudah disaring.
c) Homogenkan media dan akuades dengan menggunakan water
bath hingga larutan menjadi jernih.
d) Masukan ke dalam 5 tabung reaksi yang masing-masing berisi 5
ml.
e) Tutup tabung reaksi dengan menggunakan kapas dan aluminium
foil.
f) Ikat penutup tabung dengan menggunakan karet gelang.
g) Letakan tabung pada rak tabung dan masukan ke dalam autoklaf.
h) Sterilkan media dengan metode sterilisasi uap.
i) Setelah dingin media dapat segera digunakan atau disimpan
dalam lemari pendingin untuk penggunaan berikutnya.
2) Mueller Hinton Agar dengan 5% Darah Kambing
a) Timbang 38 gr media mueller hinton agar lalu masukan ke dalam
tabung Erlenmeyer.
b) Tambahkan 1 liter akuades yang sudah disaring.
c) Homogenkan media dan akuades dengan menggunakan water
bath hingga larutan menjadi jernih.
d) Tutup tabung reaksi dengan menggunakan kapas dan aluminium
foil.
e) Ikat penutup tabung dengan menggunakan karet gelang.
f) Sterilkan media dengan metode sterilisasi uap.
g) Keluarkan media dari autoklaf dan dinginkan hingga suhu
mencapai 40-50oC.
h) Masukan 50 ml darah kambing yang telah didefibrinasi ke dalam
larutan media.
i) Tuang media ke dalam plate steril dengan cara asepsis, dilakukan
di dalam laminary air flow cabinet. Masing-masing plate berisi
20 ml media.
 j) Ratakan penyebaran media di dalam plate dengan cara digoyang
di atas lantai yang rata.
k) Biarkan media membeku.
l) Setelah beku, balik plate, bungkus dengan menggunakan kertas
koran dan plastik untuk kemudian disimpan di lemari pendingin
untuk penggunaan di kemudian hari.
3) Cation Adjusted Mueller Hinton Broth (CAMHB) dengan 2-5%
Lysed Horse Blood
a) Saring 200 ml akuades dan masukan ke dalam tabung Erlenmeyer
bervolume 250 ml.
b) Larutkan 3 gram ekstrak daging ke dalam 200 ml akuades
tersebut.
c) Tambahkan kasein sebanyak 8,75 gram dan starch sebanyak 0,75
gram.
d) Panaskan dengan menggunakan water bath sambil sesekali
dikocok hingga larutan menjadi homogeny dan jernih.
e) Sterilkan media Mueller Hinton Broth dengan metode sterilisasi
uap.
f) Keluarkan media dari autoklaf dan biarkan mendingin.
g) Buat larutan kation Mg+2 dan Ca+2 dengan cara sebagai berikut:
Timbang 0,1672 gr MgCl2.6H2O menggunakan gelas arloji
steril dan masukan ke dalam tabung berisi 10 ml akuades
steril. Kandungan akhir larutan ini adalah Mg+2 dengan kadar
2 mg per ml.
Timbang 0,0736 gr CaCl2.2H2O menggunakan gelas arloji
steril dan masukan ke dalam tabung berisi 10 ml akuades
steril. Kandungan akhir larutan ini adalah Ca+2 dengan kadar
2 mg per ml.
h) Setelah media Mueller Hinton Broth dingin, tambahkan 1 ml
larutan Mg+2 dan 2 ml larutan Ca+2 dengan cara asepsis.
i) Tambahkan 2-5% lysed horse blood yang dibuat dengan cara:
Sediakan 50 ml darah kambing segar yang telah terdefribinasi
di dalam tabung Erlenmeyer 250 ml.
Secara aseptic, tambahkan 50 ml akuades steril sehingga
konsentrasinya menjadi 50%.
 Dinginkan dan cairkan larutan darah kambing lisis 50%
tersebut sehingga lisis sempurna, sekitar 5 hingga 8 siklus.
Lakukan sentrifugasi pada kecepatan 12000 x g selama 20
menit.
Tuang supernatant dan lakukan sentrifugasi ulang jika
diperlukan.

j) Periksa pH medium Mueller Hinton II Broth (Cation Adjusted

Mueller Hinton Broth) dengan 2-5% Lysed Sheep Blood.

h. Penyiapan Bakteri Uji

1) Penyiapan Inokulum
a) Pilih minimal 3 koloni Streptococcus pneumoniae dari agar
biakan dengan cara menyentuh puncak dari setiap koloni dengan
ose steril, kemudian pindahkan ke dalam tabung yang berisi 5 ml
media tryptic soy broth.
b) Inkubasi larutan dalam tabung pada suhu 35 2oC hingga
kekeruhannya mencapai atau melebihi standar 0,5 Mc Farland.

c) Samakan kekeruhan dengan standar Mc Farland 0,5 sehingga

jumlah koloni dalam inokulum setara dengan 5x108 CFU/ml.
2) Pembuatan Suspensi
a) Siapkan inokulum yang telah terstandardisasi dan biarkan selama
15 menit.
b) Masukan 0,1 ml inokulum standar ke dalam 14,9 ml media
Mueller Hinton Broth sehingga jumlah koloni yang digunakan
dalam pengujian menjadi 1x106 CFU/ml dan koloni akhir
menjadi 5x105 CFU/ml ketika ditambahkan pada volume akhir
pengujian

i. Pengujian Antibakteri
1) Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)
a) Siapkan sebanyak 13 tabung, labeli, dan susun pada rak tabung
seperti gambar berikut:
20 10
0 0
% %
500%

Kontrol -
12,5%

6,25%
25%

3,125%,
1,56%

0,78%

0,39%,

0,19%

0,095%

Kontrol +

K. pelarut
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Gambar 3.1 Susunan Tabung

b) Masukan infusa biji langsat (Lansium domesticum Cor.) 200%

sebanyak 1 ml ke dalam tabung ke-1 dan ke-2.
c) Masukan akuades steril sebanyak 1 ml ke dalam tabung ke-2
sehingga didapatkan konsentrasi pada tabung ke-2 adalah 100%
sedangkan konsentrasi pada tabung pertama tetap 200% (Saputra,
2012).
d) Pengenceran secara seri dilakukan dari tabung ke-2 sampai
tabung ke-12, dengan cara memindahkan 1 ml larutan pada
tabung ke-2 ke dalam tabung ke-3. Tabung ke-3 dihomogenkan,
diambil 1 ml kemudian dipindahkan ke tabung nomor 4.
Demikian seterusnya sampai tabung ke-10 diambil 1 ml,
dipindahkan ke tabung ke-12 (Ramadanti, 2008 dan Saputra,
2012).
e) Tabung ke-13 (kontrol positif) berisi 1 ml Mueller Hinton Broth
dan 1 ml suspensi bakteri.
f) Tabung ke-14 (kontrol negatif) berisi 1 ml infusa biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.) dan 1 ml Mueller Hinton Broth.
g) Tabung ke-15 (kontrol pelarut) berisi 1 ml akuades dan 1 ml
suspensi bakteri.
h) Inkubasi semua tabung pada suhu 37C, selama 18-24 jam
(Ramadanti, 2008 dan Saputra, 2012).
 i) Keluarkan tabung dari dalam inkubator dan biarkan selama
beberapa waktu dalam suhu kamar.
j) Nilai KHM dengan cara mengamati ada tidaknya pertumbuhan
kuman dengan membandingkan tabung uji dengan kontrol positif
dan negatif (Saputra, 2012).
k) Langkah 1 sampai 7 diulang hingga 3 kali.

2) Penentuan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)

a) Tabung-tabung pada pengujian KHM yang tidak memperlihatkan
pertumbuhan bakteri disubkultur pada agar darah dengan cara
streaking (Khunaifi 2010 dan Saputra, 2012).
b) Kadar bunuh minimal akan ditunjukkan dengan tidak ada
pertumbuhan atau pertumbuhan maksimal 99,9% dari inisial
inokulum pada medium agar dengan konsentrasi terendah (Sacher
et al., 2004).

8. Alur Kerja Penelitian

Survey Pemanenan tanaman langsat

ketersediaan
tanaman
Pembuatan simplisia
Pengambilan
sampel Pembuatan infusa Sterilisasi alat dan bahan
determinasi
Penyiapan bakteri
Pemeriksaan infusa (uji
(subkultur dan
Determinasi fitokimia)
pembuatan suspensi)
tanaman

Taksonomi Pengujian Aktivitas Antibakteri

Tanaman

Dilusi Subkultur tabung inokulum

KHM KBM Colony

Pengolahan dan Analisis Data

Skema 3.1 Alur Penelitian

H. Personalia Penelitian

Maret April Juli

Kegiatan I II II IV
I II III IV I II III IV
I

Penyiapan simplisia *
 Pemeriksaan kadar
*
air
Skrining fitokimia * *

Penyiapan alat, media,

* *
bakteri uji
Pengujian antibakteri * * *

Pembuatan laporan *
penelitian

Keterangan:
Mei dan Juni tidak ada jadwal penelitian dikarenakan harus mengantre untuk
penggunaan laboratorium periode II.

1. Nama Peneliti : Suci Purnamasari

Nim : I11109023
Jurusan : Program Studi Pendidikan Dokter
Peran : Peneliti
Lembaga : Fakultas Kedokteran

Jumlah Waktu : Penelitian dimulai bulan Maret 2013 hingga Juli 2013

2. Pembimbing I
Nama : Isnindar, S. Si., M. Sc., Apt.
NIP : 19780911 200801 2 011
Bidang Ilmu :
Program Studi/Fakultas : Farmasi/ Kedokteran

Universitas : Tanjungpura

3. Pembimbing II
Nama : dr. Ita Armyanti
NIP : 19811004 200801 2 011
Bidang Ilmu : Farmakologi
Program Studi/Fakultas : Pendidikan Dokter/ Kedokteran
Universitas : Tanjungpura
 LEMBAR PENGESAHAN

Demikianlah protokol penelitian ini kami ajukan dan kami bertanggung

Mengetahui, Pontianak, 17 jawab terhadap
Juli 2013
pelaksanaan penelitian tersebut
Pembimbing I di atas sesuai dengan protokol penelitian.
Peneliti Utama

Isnindar, S. Si., M. Sc., Apt. Suci Purnamasari

NIP. 19780911 200801 2 011 NIM. I11109023