Analisa Kuantitatif sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15

ml asam sulfat pekat.

3. Panaskan semua bahan dalam labu
Analisis protein dapat digolongkan
Kjeldahl dalam lemari asam sampai
menjadi dua metode, yaitu: Metode
berhenti berasap dan teruskan pemanasan
konvensional, yaitu metode Kjeldahl
sampai mendidih dan cairan sudah menjadi
(terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi),
jernih. Tambahkan pemanasan kurang
titrasi formol. Digunakan untuk protein
lebih 30 menit, matikan pemanasan dan
tidak terlarut.
biarkan sampai dingin.
Metode modern, yaitu metode Lowry,
4. Selanjutnya tambahkan 100 ml aquadest
metode spektrofotometri visible, metode
dalam labu Kjeldahl yang didinginkan
spektrofotometri UV. Digunakan untuk
dalam air es dan beberapa lempeng Zn,
protein terlarut.
tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4%
(dalam air) dan akhirnya tambahkan
perlahan-lahan larutan natrium hidroksida
1. Metode Kjeldahl
50% sebanyak 50 ml yang telah
Metode ini merupakan metode yang
didinginkan dalam lemari es.
sederhana untuk penetapan nitrogen total
5. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera
pada asam amino, protein, dan senyawa
pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl
yang mengandung nitrogen. Sampel
perlahan-lahan sampai dua lapis cairan
didestruksi dengan asam sulfat dan
tercampur, kemudian panaskan dengan
dikatalisis dengan katalisator yang sesuai
cepat sampai mendidih.
sehingga akan menghasilkan amonium
6. Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer
sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan
yang telah diisi dengan larutan baku asam
kuat, amonia yang terbentuk disuling uap
klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator
secara kuantitatif ke dalam larutan
merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%)
penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca
Penetapan Kadar
destilator dipastikan masuk ke dalam
Prosedur :
larutan asam klorida 0,1N.
1. Timbang 1 g bahan yang telah
7. Proses destilasi selesai jika destilat yang
dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl
ditampung lebih kurang 75 ml. Sisa larutan
(kalau kandungan protein tinggi, misal
asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi
kedelai gunakan bahan kurang dari 1 g).
dengan destilat dititrasi dengan larutan
2. Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium
baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir
titrasi tercapai jika terjadi perubahan
warna larutan dari merah menjadi kuning.
Lakukan titrasi blanko.
Kadar Protein
Kadar protein dihitung dengan persamaan
berikut :
Keterangan :
Fk : faktor koreksi
Fk N : 16
2. Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa
(NaOH) lalu ditambahkan formalin akan
membentuk dimethilol. Dengan
terbentuknya dimethilol ini berarti gugus
aminonya sudah terikat dan tidak akan
mempengaruhi reaksi antara asam dengan
basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat
diakhiri dengan tepat. Indikator yang
digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila
tepat terjadi perubahan warna menjadi
merah muda yang tidak hilang dalam 30
detik.
3. Metode Lowry
Prosedur :
Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan
larutan asam fosfotungstat-asam
fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)
Pembuatan reagen Lowry B :
Campurkan 2% natrium karbonat dalam
100 ml natrium hidroksida 0,1N.
Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml
tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium
natrium tartrat 2%.
Penetapan Kadar
a. Pembuatan kurva baku
Siapkan larutan bovin serum albumin
dengan konsentrasi 300 g/ml (Li). Buat
seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal
dengan komposisi berikut :
Tambahkan ke dalam masing-masing
tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan
selama 10 menit, kemudian tambahkan 1
ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan
selama 20 menit. Baca absorbansinya pada
panjang gelombang 600 nm tehadap
blanko. (Sebagai blanko adalah tabung
reaksi no.1 pada tabel di atas)
b. Penyiapan Sampel
Ambil sejumlah tertentu sampel protein
yang terlarut misal albumin, endapkan
dahulu dengan penambahan amonium
sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari
jenis proteinnya, kalau perlu sampai
mendekati kejenuhan amonium sulfat
dalam larutan). Pisahkan protein yang
mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm
selama 10 menit, pisahkan supernatannya.
Presipitat yang merupakan proteinnya
kemudian dilarutkan kembali dengan dapar
asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml.
Ambil volume tertentu dan lakukan
penetapan selanjutnya seperti pada kurva
baku mulai dari penambahan 8 ml reagen sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari
Lowry A sampai seterusnya. jenis proteinnya, kalau perlu sampai
mendekati kejenuhan amonium sulfat
dalam larutan). Pisahkan protein yang
4. Metode Spektrofotometri Visible
mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm
(Biuret)
selama 10 menit, pisahkan supernatannya.
Prosedur :
Presipitat yang merupakan proteinnya
Pembuatan reagen Biuret :
kemudian dilarutkan kembali dengan dapar
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat
asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml.
(CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat
Ambil sejumlah L larutan tersebut secara
(KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml
kuantitatif kemudian tambahkan reagen
aquades dalam labu takar 100 ml.
Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar
Kemudian tambahkan 30 ml natrium
asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.
hidroksida 10% sambil dikocok-kocok,
Setelah 10 menit dari penambahan reagen
selanjutnya tambahkan aquades sampai
Biuret, baca absorbansinya pada panjang
garis tanda.
gelombang 550 nm terhadap blanko yang
Pembuatan larutan induk bovin serum
berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5.
albumin (BSA):
Perhatikan adanya faktor pengenceran dan
Ditimbang 500 mg bovin serum albumin
absorban sampel sedapat mungkin harus
dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml
masuk dalam kisaran absorban kurva baku.
sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li).
Penetapan kadar (Metode Biuret) :
Pembuatan kurva baku : 5. Metode Spektrofotometri UV
Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, Asam amino penyusun protein diantaranya
reagen Biuret dan aquades misal dengan adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin
komposisi sebagai berikut: yang mempunyai gugus aromatik.
Triptofan mempunyai absorbsi maksimum
Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada
pada 280 nm, sedang untuk tirosin
550 nm terhadap blanko yang terdiri dari
mempunyai absorbsi maksimum pada 278
800 L reagen Biuret dan 200 L aquades.
nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang
Cara mempersiapkan sampel :
kuat dan pada panjang gelombang lebih
Ambil sejumlah tertentu sampel protein
pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat
yang terlarut misal albumin, endapkan
digunakan untuk estimasi konsentrasi
dahulu dengan penambahan amonium
protein dalam larutan. Supaya hasilnya
lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio
adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi 280/260 menentukan faktor
absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada koreksi yang ada dalam suatu tabel.
260 nm untuk melihat kemungkinan