BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Universitas Islam

Negeri Sunan Kalijaga Yogyakarta pada bulan Juli Januari 2014.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop cahaya,

mikroskop mikrofotografi, gelas benda dan gelas penutup, pinset, silet, pipet tetes,

botol flakon, oven, lemari es, hand counter, kertas label, tissue dan kotak preparat.

Adapun bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu sampel akar

Ganyong (Canna edulis) Varietas umbi merah dan umbi putih yang diperoleh dari jl.

Kaliurang, Hargobinangun, Kec. Pakem, Kab. SlemanYogyakarta. Bahan kimia yang

digunakan dalam penelitian ini adalah asam asetat 45%, 8-hydroxyquinolin 0.002 M,

asam klorida (HCl) 1 N, aceto-orcein 1%, minyak imersi, gliseril, etanol dan aquades.

C. Prosedur Kerja

1. Penumbuhan akar

Umbi ganyong (Canna edullis) ditanam di dalam pot berisi tanah gambus

yang telah diberi air. Umbi ganyong tersebut dibiarkan dalam keadaan agak lembab
selama beberapa hari hingga akarnya muncul dan ujung akar tersebut yang akan

digunakan untuk membuat sediaan.

2. Preparasi kromosom

Preparasi kromosom pada penelitian ini dibuat dengan menggunakan metode

pencet (Squash) dengan cara pemotongan ujung akar ganyong varietas umbi putih

dan umbi merah kira-kira 1,5 cm. Pemotongan ujung akar ganyong dimulai pada

pukul 02.30.00-04.30 WIB dengan interval 15 menit sebanyak 3 kali pengulangan.

Akar yang telah diambil langsung dimasukkan ke dalam botol flakon yang

telah berisi dengan 8-hydroxyquinolin 0.002 M selama 2-10 jam pada suhu 4oC.

Kemudian sampel difiksasi menggunakan larutan fiksasi (asam asetat glasial 45%)

selama 15 menit pada suhu 4oC. Menurut Styawan&Sutikno (2000), proses fiksasi

menggunakan asam asetat 45% dilakukan untuk mempertahankan sel seperti saat sel

masih hidup dengan jalan mendenaturasi protein san asam nukleat sehingga mitosis

dapat diamati tahap-tahapannya, selain itu, fiksasi juga menaikkan indeks bias

komponen sel. Setelah itu akar tersebutdicuci dengan aquades sebanyak 3 kali.

Akar yang telah dicuci dengan aquades tersebut kemudian dimasukkan

kedalam botol flakon dan dihidrolisis dengan HCl 1N (1 ml asam klorida dicampur

kedalam 11 ml akuades). Potongan akar tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

incubator pada suhu 60C selama 15 menit. Selanjutnya akar tersebut dicuci kembali

dengan akuades sebanyak 3 kali.

 Setelah akar tersebut dicuci dengan akuades, akar tersebut kemudian diwarnai

dengan aceto-orcein1% (1 gr orcein dicampur ke dalam 100 ml asam asetat 35%)

kemudian disimpan pada suhu 27C selama 3-12 jam. Setelah itu, potongan akar

tersebut diletakkan di atas gelas benda dan ditetesi dengan gliserin kemudian ditutup

dengan gelas penutup. Selanjutnya akar tersebut di pencet (Squashing) menggunakan

ibu jari dan sedikit digeserkan sehingga akar tersebut terpencet dan menyebar

sehingga memudahkan untuk diamati.

Potongan akar yang telah dibuat preparat tersebut kemudian disegel

menggunaakan cat kuku agar preparat tidak cepat kering dan bergeser. Kemudian

preparat tersebut diberi label nama dan waktu pembuatan sediaan. Selanjunya,

preparat tersebut diamati menggunakan mikroskop cahaya dari perbesaran lemah ke

perbesaran kuat.

3. Pembuatan foto preparat

Setelah didapatkan gambaran kromosom yang jelas kemudian dilakukan

dokumentasi dengan pemotretan. Pengambilan foto preparat dilakukan menggunakan

mikrofotografi dengan perbesaran 10 x 100 dan di cetak.

4. Pembuatan karyotype danpengukuran

Pembuatan karyotype dilakukan dengan memproyeksikan foto preparat

pembelahan mitosis pada tahap prometafase dengan menggunakan AutoCAD Map

2000i dan Smart Type 2.0 Panjang lengan kromosom diukur dengan menggunakan

fasilitas inquery distance pada program AutoCAD Map 2000i setelah dikonversi

pada skala m; pemisahan, pemotongan dan pengaturan kromosom menggunakan

program Smart Type 2.0. Pengukuran kromosom meliputi lengan pendek dan lengan

panjang, di ukur dari sentromer sampai dengan telomere. Penyusunan kromosom

didasarkan pada urutan panjang absolute kromosom terpanjang sampai dengan

panjang lengan absolute terpendek.

Karakterisasi kromosom dan penyusunan karyotype didasarkan kepada

jumlah kromosom, panjang lengan pendek kromosom (p), panjang lengan kromosom

terpanjang (q), panjang absolute kromosom (p+q) dan indeks sentromer (IS).

Perhitungan indeks sentromer menggunakan rumus sebagai berikut:

a. Jumlah kromosom

b. Panjang absolute kromosom

c. Panjang lengan pendek kromosom (p)

d. Panjang lengan panjang kromosom (q)

e. Indeks sentromer (levan et al, 1964)

panjang lengan pendek kromosom

IS= x 100
panjang lengan kromosom

f. Rasio lengan panjang terhadap lengan pendek (RLK)

lengan panjang kromosom

RLK =
lengan pendek

g. Rasio pasangan absolute terpanjang dengan terpendek (R)

pasangan kromosomterpanjang
R=
pasangan kromosom terpendek
Tabel 2. Nilai Indeks Sentromer dan Rasio Lengan Kromosom untuk mengelompokan bentuk
kromosom

No IS RLK Bentuk Kromosom

1 38-50 1,00-1,67 Metasentris (m)
2 26-37 1,68-3,00 Submetasentris (sm)
3 13-25 3,01-7,00 Akrosentris (st)
4 0-12 > 7,00 Telosentris (t)

D. Analisis Data

Rentang waktu mitosis dilakukan dengan preparasi kromosom ganyong yang

dilakukan pada pukul 02.30-04.30 WIB dengan interval 15 menit. Perhitungan jumlah

sel yang melakukan fase-fase mitosis dilakukan terhadap 210 sel yang diamati secara

acak. Jumlah tersebut diperoleh dengan cara mengamati 3 preparat dari akar ganyong

yang berbeda. Masing-masing preparat yang diamati berjumlah 90 sel. Berdasarkan

pengamatan dapat ditentukan persentase dan jumlah sel pada tiap-tiap fase mitosis.

Setelah itu, maka dapat diketahui waktu mitosis yang paling aktif pada prometafase

tanaman ganyong.

Data karakter-karakter kromosom ganyong dianalisis secara deskriptif dan

disajikan dalam bentuk ideogram. Panjang lengan pendek, panjang lengan panjang,

panjang absolute kromosom diukur menggunakan program AutoCAD Map 2000i.

Hasil pengukuran kromosom dengan ukuran satuan kemudian dikonversikan dalam

mikrometer. Pembuatan karyotype kromosom ganyong dilakukan dengan

menggunakan program SmartType 2.0. Pembuatan ideogram dilakukan menggunakan

aplikasi Corel Draw X5 berdasarkan panjang lengan pendek (p) dan panjang lengan

panjang (q) kromosom.