PENDAHULUAN

Latar Belakang

Asam sitrat adalah asam organik yang secara alami terdapat pada buah-buahan seperti
jeruk, nenas dan pear. Asam sitrat pertama kali diekstraksi dan dikristalisasi dari buah jeruk,
sehingga asam sitrat hasil ektraksi dari buah-buahan ini dikenal sebagai asam sitrat alami.
Wehner (1893) pertama kali melaporkan produksi asam sitrat sebagai hasil sampingan
pada fermentasi produksi asam oksalat dengan menggunakan Penicillium glaucum. Tahun 1917,
Currie juga melaporkan bahwa Aspergillus niger dapat menghasilkan asam sitrat pada medium
pH rendah dengan kadar gula tinggi. Sejak saat itu asam sitrat diproduksi secara komersial
dengan menggunakan kapang A. niger.
Dewasa ini telah diketahui banyak jenis kapang yang dapat menghasilkan asam sitrat,
seperti A. niger, A. awamori, A. fonsecaeus, A. luchuensis, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, A.
clavatus, A. fumaricus, A. phoenicus, Mucor viriformis, Ustulina vulgaris dll. Selain kapang,
beberapa bakteri dan kamir juga dapat memproduksi asam sitrat, diantaranya : Brevibacterium,
Corynebacterium, Arthrobacter dan Candida.
Kapang A. niger merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh dan banyak digunakan
secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan beberapa enzim seperti
pektinase dan amilase (Broekhuijsen et al. 1993; Okada 1985). A. niger mampu mensintesis asam
sitrat dalam medium fermentasi ekstraseluler dengan konsentrasi yang cukup tinggi, jika
dibiakkan dalam media yang kadar garamnya rendah dan mengandung gula sebagai sumber
karbon (Hang et al. 1977; Ji et al. 1992).

Asam sitrat (C6H8O7) banyak digunakan dalam industri terutama industri makanan, minuman,
dan obat-obatan. Kurang lebih 60% dari total produksi asam sitrat digunakan dalam industri
makanan, dan 30% digunakan dalam industri farmasi, sedangkan sisanya digunakan dalam
industri pemacu rasa, pengawet, pencegah rusaknya rasa dan aroma, sebagai antioksidan,
pengatur pH dan sebagai pemberi kesan rasa dingin. Dalam industri makanan dan kembang gula,
asam sitrat digunakan sebgai pemacu rasa, penginversi sukrosa, penghasil warna gelap dan
penghelat ion logam. Dalam industri farmasi asam sitrat
digunakan sebgai pelarut dan pembangkit aroma, sedangkan pada industri kosmetik
digunakan sebagai antioksidan (Bizri & Wahem 1994).
Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus kreb (siklus asam trikarboksilat).
Lintasan reaksi katabolik yang mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah
lintasan glikolisis dan lintasan Entner-Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam piruvat
yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar (80%) dari glukosa
diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami dekarboksilasi dan
berikatan dengan koenzim-A membentuk asetil-CoA dan selanjutnya masuk kedalam siklus krebs
untuk bergabung dengan oksaloasetat membentuk asam sitrat. Piruvat juga bisa langsung masuk
ke siklus krebs dengan bantuan enzim piruvat karboksilase yang mengubah piruvat menjadi
oksaloasetat.
Pada A. niger, fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat (tanpa
melalui piruvat) oleh enzim fosfoenol piruvat karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan ATP
sebagai sumber energi, Mg2+, atau Mn2+, dan K+, atau NH4+. Judoamidjojo & Darwis (1992)
menyatakan bahwa apabila sumber karbon bukan glukosa, misalnya asam asetat, atau senyawa
alifatik berantai panjang (C9 C23), maka isositrat liase akan terinduksi sehingga isositrat diubah
menjadi glioksilat, selanjutnya glioksilat diubah menjadi malat oleh sintetase. Bila glukosa
ditambahkan siklus tersebut akan terhambat.
Asam sitrat merupakan metabolik primer, seperti halnya pertumbuhan mikroba secara
umum, pertumbuhan mikroba dalam fermentasi dibatasi oleh ketersediaan beberapa unsur
kelumit (P, Mn, Zn). Peranan ion logam dalam proses ini belum diketahui secara menyeluruh.
Nilai pH optimum sekitar 1,7 2,0. Jika pH lebih tinggi (alkalis) menyebabkan pembentukan
asam asam oksalat dan glukonat dalam jumlah banyak. Karenanya pengendalian kondisi proses
secara cermat merupakan prasyarat untuk mempertahankan keteraturan metabolik dan
mendukung pembentukan asam sitrat yang lebih banyak. Kondisi yang sesuai tersebut
memungkinkan stimulasi glikolisis untuk penyediaan aliran karbon yang tidak terbatas ke dalam
metabolisme antara. Akumulasi sitrat selanjutnya tergantung pada pemasokan oksaloasetat
(Mangunwidjaja & Suryani 1994).
Mangunwidjaja & Suryani (1994) juga menjelaskan bahwa kekurangan mangan akan
menurunkan aktivitas enzim dalam siklus asam trikarboksilat yang diikuti oleh penurunan
anabolisme. Gangguan metabolisme ini menyebabkan perbedaan tingkat ion amonium
intraselluler yang dapat membantu menghilangkan penghambatan enzim fosfofruktose oleh sitrat.
Mangan juga terlibat dalam biokimia permukaan sel dan morfologi hifa. Kebutuhan oksigen yang
tinggi memungkinkan reoksidasi sitoplasma NADH tanpa pembentukan ATP dan melibatkan
suatu cabang respirasi alternatif yang berbeda dari rantai respirasi normal.
Proses fermentasi asam sitrat dapat dilakukan dengan sistem terendam, fermentasi kultur
permukaan. Fermentasi kultur terendam dibagi dua yaitu dilakukan pada fermentor berpengaduk
dan pada air lift fermentor. Sedangkan pada fermentasi kultur permukaan dapat menggunakan
media cair maupun media padat. Fermentasi sistem terendam lebih sulit dilakukan dibandingkan
prosedur permukaan, tetapi dapat dilakukan secara curah, proses curah terumpani, atau
sinambung. Fermentasi curah digunakan untuk substrat glukosa, dan curah terumpani lebih layak
diterapkan untuk untuk tetes tebu. Biakan sinambung mempunyai produktivitas yang lebih tinggi
(Mangunwidjaja & Suryani, 1994).
Produksi asam sitrat pada proses fermentasi dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya
adalah jenis media, pH media, waktu fermentasi, suhu, aerasi, dan mikroorganisme yang
digunakan. Faktor yang paling menentukan adalah media tumbuh (substrat) dan mikroorganisme
yang digunakan (Friedrich et al. 1994).
Pada umumnya hasil samping pertanian dan perkebunan seperti jerami padi, onggok,
bagas, dan kulit kakao masih mengandung lignoselulosa. Limbah ini masih mengandung pati,
protein, lemak, dan senyawa kimia lainnya. Dengan teknologi fermentasi, hasil samping ini dapat
dimanfaatkan lebih lanjut menjadi produk lain yang berguna seperti pangan, pakan ternak, pelarut
organik, asam-asam organik seperti asam sitrat dan lain-lain (Judoamidjojo et al. 1989).

Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk melatih mahasiswa untuk dapat melakukan isolasi kapang
penghasil asam sitrat dari berbagai sumber seperti buah-buahan busuk, dari tanah, serta
menyeleksi isolat-isolat potensial untuk digunakan sebagai isolat penghasil asam sitrat.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel buah-buahan busuk (tomat busuk), sampel tanah,
medium agar cawan Prescott (Lampiran 1), medium agar cawan Prescott + 0,1% KH 2PO4, larutan
garam fisiologis steril (9 ml dalam tabung steril), alkohol 95%, agar miring PDA, onggok
tapioka, dedak, Tween 80, NaOH 0,1 N, indikator Fenolftalein, air aquades, Asam sitrat anhidrat,
larutan Piridin.

Alat-alat yang digunakan adalah Lup inokulasi, pisau/skapel, batang penyebar, pipet 1 ml,
inkubator, labu erlemenyer 250 ml, labu ukur 50 ml, tabung reaksi, biuret, gelas piala 100 ml,
kertas saring Whatman No. 40,Vortex, Spektrofotometer.
Cara Kerja
Isolasi dari Buah-buahan Busuk dengan Metode Tanam Langsung
Sampel buah-buahan yang telah busuk (Tomat) dipotong-potong dengan ukuran 1x1x1 cm 3,
kemudian diletakkan potongan tersebut pada medium agar cawan Prescott. Diinkubasi pada suhu
300C selama 2-5 hari. Mengamati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada
medium. Koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama. Isolat murni
disimpan di dalam agar miring PDA. Kemudian menentukan genus kapang berdasarkan
mikroskopi morfologi struktur konidianya (menggunakan metode teknik solatif transparan agar
struktur konidia tidak rusak).
Isolasi dari Buah-buahan Busuk dengan Metode Sebar

Sampel buah diblender sebanyak 10 g dan dicampur dengan 90 ml larutan garam fisiologis,
diencerkan secara serial (diencerkan 10-3). Pencawanan dengan metode cawan sebar 0,1 ml dari
pengenceran 10-1 sampai 10-3 pada medium agar cawan Prescott. Diinkubasi pada suhu 30 0C
selama 2-5 hari. Mengamati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada medium.
Koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama. Isolat murni disimpan
di dalam agar miring PDA. Kemudian menentukan genus kapang berdasarkan mikroskopi
morfologi struktur konidianya (menggunakan metode teknik solatif transparan agar struktur
konidia tidak rusak).
Seleksi Isolat berdasarkan Nilai Satuan Asam (Acid Unitage/AU)

Medium cawan Prescott yang telah disiapkan ditambahkan 0,1% KH 2PO4, kemudian
inokulasikan isolat uji di tengah-tengah medium agar cawan tersebut. Inkubasikan pada suhu
300C selama 3 hari (72 jam). Diukur diameter zona asam dan diameter koloni kapangnya. Lalu
dihitung nilai AU-nya dengan rumus :

Isolat-isolat yang memiliki nilai AU relatif besar untuk percobaan selanjutnya disimpan pada
media agar miring PDA.
Fermentasi Padat Produksi Asam Sitrat
Onggok basah (segar) diperas sampai kadar airnya 65%, disiapkan dedak halus dengan kadar
12%, dan dicampur merata onggok dan dedak dengan perbandingan 5:1. Kemudian ditambahkan
air aquadest sehingga kadar air campuran onggok dedak 65%, masukkan 30 g campuran tersebut
ke dalam erlemenyer 250 ml kemudian sterilkan. Medium tersebut diinokulasikan dengan 1 ml
suspensi konidia (7-8 x 10-5 konidia/ml) dari isolat terpilih secara merata (isolat terpilih tomat).
Inkubasikan pada suhu kamar selama 4 hari dengan posisi erlemenyer dimiringkan. Diaduk
secara merata hasil fermentasi tersebut. Sebanyak 10 g contoh dimasukkan ke dalam erlemenyer
300 ml. Ditambahkan aquades sehingga total volumenya 200 ml (20 x pengenceran), diaduk dan
dipanaskan sampai campuran tersebut mendidih. Lalu disaring dengan kertas saring Whatman
No. 4 dan didinginkan pada suhu kamar. Filtrat 10 ml at yang telah ditetesi larutan Phenolphtalein
(PP) sebanyak 1-2 tetes, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Kemudian dihitung total asam
sebagai asam sitrat monohidrat dengan rumus :

Keterangan :
a = bobot bahan (mg)
b = volume larutan NaOH yang digunakan (ml)
c = Normalitas larutan NaOH (0,1N)
210 = bobot molekul asam sitrat monohidrat
20 = pengenceran 20 kali
3 = banyaknya ion H+ yang dilepaskan oleh asam sitrat