BAB III.

METODE

A. Alat dan Bahan

1. Alat:
Mikropipet
Tabung mikrosentrifuge
seperangkat alat elektroforesis protein
vial
tip
2. Bahan
Aquadest
Seperating buffer (1,5 M HCl pH 8,8)
stacking buffer (0,5M Tris HCl Ph 6,8)
SDS 10%
acrylamide-bisacrylamide 30%
TEMED
APS 10%
Larutan staining
Larutan destaining
Glisin
Marka protein
Protein hasil isolasi

B. Prosedur
1. Pembuatan Gel SDS-PAGE
Kaca untuk pencetakan gel di pasang pada alat cetakan. Alat cetakan dites kebocoran
dengan memasukkan aquadest di antara kedua kaca dan di biarkan beberapa saat.
Apabila tidak bocor, air di buang dan di bersihkan dengan menyerapnya
menggunakan tissue

Disiapkan separating gel 12% (b/v) dan stacking gel 4% sebanyak 5 ml dengan
komposisi sebagai berikut ini

Bahan Separating gel 12% Stacking gel 4%

Aquadest 1957l 1389 l
Separating buffer 0380 l -
 Pelet bakteri di resuspensi dengan larutan PBS ph 7,4 hingga sempurna

Sel di lisis dengan sonikasi menggunakan frekuensi 2,5-3 Hz selama 30 detik,

kemudian di hentikan selama 30 detik, selanjutnya di sonikasi lagi selama 30 detik
hingga sel pecah. Perlakuan ini di lakukan sebanyak 10 kali dalam suhu dingin.

Suspensi protein di pindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus dan di sentrifugasi

pada 10.000 rpm selama 5 menit suhu 4C
supernatan dikumpulkan untuk proses selanjutnya

Suspensi tersebut disentrifus selama 5 menit, 4Oc, 13.000 rpm. Supernatan yang di
peroleh di pindahkan dalam tabung mikrosentrifus yang baru. Sumpernatan tersebut
mengandung DNA Kromosom dan di simpan -20oC hingga digunakan untuk analisis
selanjutnya