Judul : Isolasi dan karakterisasi protein terlarut dari mikroalga hijau Tetraselmis sp

Metode :
1. Preparasi isolasi protein terlarut dari alga
a. Pasta alga mengandung 24 gr kering/100 gr pasta, diencerkan 1:1 (w/v) dengan 100 mM
Tris/buffer HCl, pH 8, 1mM EDTA, 50 mM DTT, dan 5 mM MgCl2
b. Untuk menghancurkan sel suspensi alga dimasukkan ke dalam ruang penggilingan
(grinding chamber) selama 30 menit dengan kecepatan 1,5L/menit
c. 0,3 L ruang penggilingan (grinding chamber) di isi maksimum (sekitar 65% v/v)
d. Air didinginkan sampai suhu 5oC yang terus berputar dimantel pendingin dari grinding
chamber untuk menghindari suhu tinggi di dalam ruangan
e. Diluar grinding chamber suspense alga disimpan pada suhu 5oC
f. Supernatan didialisis dengan buffer potassium phosphate 35 mM, pH 7,6 pada suhu 4oC
g. Protein terikat dielusi dengan menggunakan 400 mL buffer yang sama yang mengandung
2M NaCl
h. Bahan penyerap dibersihkan dan diregenerasi menggunakan 1 M NaOH
i. Eluate pertama didialisis dengan air dan buffer potassium phosphate 35 mM, pH 7,6 pada
suhu 4oC untuk menghasilkan crude algae soluble protein isolate (CASPI)
j. Dekolorisasi dari isolat yaitu dari 400 mL CASPI dengan mengatur pH sampai 3,5 dengan
menggunakan HCl 1 M pada suhu kamar
a. Sampel diasamkan disimpan pada suhu 4oC selama kurang lebih 1 jam
b. Disentrifuse pada 4700 gr pada suhu 4oC selama 10 menit
c. Pellet dicuci dengan 200 mL air dan disentrifuse lagi di bawah kondisi sama
d. Pellet dilarutkan dalam 200 mL air dengan menyesuaikan pH 7,6 dengan 0,1 atau 1 M
NaOH pada suhu kamar dan diperoleh Algae Soluble Protein Isolate (ASPI) telah beku-
kering
2. Analisis
Semua sampel beku-kering sebelum dianalisis kecuali aliquot ditentukan kadar airnya.
Semua hasil analisis dihasilkan secara berat kering, dengan asumsi kadar air sisa 10% setelah
beku-kering. Kadar air dan kadar abu ditentukan secara gravimetri. Penentuan kadar air,
sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 80oC semalam, diteruskan selama 3 jam pada suhu
100oC. Kadar lipid ditentukan secara gravimetri setelah ekstraksi dari sampel beku-kering
dilakukan. Ekstraksi soxhlet menggunakan pelarut kloroform/metanol (2:1 v:v).
2.1. Komposisi asam amino dan kandungan protein
BSA digunakan sebagai standar, semua protein ditentukan setidaknya dilakukan
dalam rangkap dua.
2.2. Nitrogen total dan faktor konversi nitrogen to-protein
2.3. Komposisi gula dan kandungan asam uronat total
Sampel dikeringkan pada suhu 40 C di bawah vakum dengan menggunakan P 2O5
dan dihidrolisis dengan HCl 2 N dalam metanol kering selama 16 jam pada suhu 80 C
diikuti dengan penguapan dan selanjutnya hidrolisis dengan TFA 2 M pada suhu 121 C
selama 1 jam. Gula monomer dianalisis dengan menggunakan high-performance anion-
exchange chromatography-pulsed amperometric detection (Dionex, Sunnyvale, CA,
USA). Kadar asam uronat total ditentukan setelah pra-hidrolisis dalam air 72% (b/b)
H2SO4 (1 jam, 30 C) dan selanjutnya dihidrolisis dalam H2SO4 1 M (3 jam, 100 C)
menggunakan m-Hydroxydiphenyl (Ahmed dan Labavitch, 1978). Kurva standar asam
galacturonic (12,5-100 g/mL) digunakan untuk kuantifikasi. Analisis dilakukan dalam
rangkap dua.
2.4. Analisis spektrofotometri
Kehadiran senyawa berwarna dari ekstrak alga diukur dalam larutan yang
disentrifugasi selama 5 menit pada 16,100 g pada suhu 20 C dan mengandung
konsentrasi protein dari 5 mg / mL dalam air Milli-Q. Spektrum UV tercatat dari 350 ke
750 nm, dimasukkan ke dalam kuvet kuarsa 1 cm menggunakan UV-1601 Shimadzu
spektrofotometer dan UV Probe 2.00 software (Shimadzu, Kyoto, Jepang).
2.5. SDS-PAGE dan immunoblotting
2.6. Kelarutan protein

Penentuan kelarutan kekuatan ionik dari larutan protein disesuaikan terlebih dahulu.
Untuk I = 0,03 M buffer larutan protein didialisis terhadap 35 mM larutan penyangga
kalium fosfat, pH 7,6 atau protein beku-kering dilarutkan dalam buffer yang sama. Untuk
kekuatan ionic I = 0,5 M buffer dari 35 mM buffer kalium fosfat awal, pH 7,6 diatur
dengan menambahkan NaCl mencapai konsentrasi akhir 0,4 M NaCl, untuk I = 0,2 M
buffer untuk mencapai konsentrasi akhir 0,1 M NaCl. Di semua kekuatan ionik tidak ada
protein diamati pada pH 7,6. pH larutan protein alga (5 mg / mL) pada pH 7,6 buffer pada
I = 0,5, 0,2 atau 0,03 M diatur pada suhu 25 C dengan menambahkan 0,1 M HCl atau
NaOH 0,1 M untuk memperoleh nilai pH akhir mulai dari 2,5 ke 8,5 dengan interval 0.5
unit. Seperti yang ditunjukkan sebelumnya (Lakemond et al., 2000) penyesuaian pH tidak
jauh mempengaruhi kekuatan ion. Penambahan nilai-nilai pH yang sebenarnya
dikendalikan menggunakan unit pH STAT. Sampel disesuaikan pHnya dengan disimpan
pada suhu 4 C selama minimal 1 jam untuk mencegah aktivitas protease mungkin.
Setelah itu disentrifuse (10 menit; 4700g; 4 C) dan konsentrasi protein dari supernatan
ditentukan menggunakan uji protein BCA. Kelarutan protein didefinisikan sebagai
konsentrasi protein supernatan relatif terhadap konsentrasi protein awal dari pH 7,6
supernatan; maka yang terakhir ditetapkan sebagai 100%. Semua kurva kelarutan
ditentukan dalam rangkap dua dan standar deviasi ditemukan sejumlah 66% dari rata-rata.
Dalam kasus terburuk deviasi standar adalah 17%.