Isolasi DNA

Definisi Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).

Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi
terlebih dahulu dan murni kandungannya.

(Wilson, Keith and John, 2010).

Macam metode isolasi DNA

1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA
acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.
Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah
yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk
primer adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%
(Subandiyah,2006).

1. Metode CTAB

Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida
karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh
fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak
jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi
(Prasetyo, 2008).

1. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi
DNA, Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

1. Salting Out

Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan
Proteinase K untuk denaturasi protein

1. Guanidine isothiocyanate

Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk
lisis dinding sel, Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

1. Silica Gel

Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi
recovery DNA kurang (Barnum 2005).

1. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai
pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen
dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang
bersifat semi konservatif (Giri, 2004).

Tahap Isolasi DNA

1. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

1. Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan
menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi
gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk
melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi
atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

1. Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

1. Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut
kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65C. Hal tersebut
bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.
Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat
diisolasi secara utuh.

1. Presipitasi

Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-
untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan
larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan
larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan
protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5
menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas
( Fauziah, 2010)

Manfaat isolasi DNA

Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau
forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke
dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang
terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan DNA untuk
identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang),
penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Anggie, 2011).

1. 1. Teknik untuk memotong rantai mol DNA

Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang
dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan enzim restriksi atau
endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuen spesifik yang
panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan enzim restriksi atau
enzim endonuklease restriksi.

Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang
menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri) Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim
restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim
restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim
tersebut.

Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi
memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu.
Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens
pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal
oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Enzim retriksi
(Endonuklease) adalah enzim yang berasal dari bakteri, yang dapat memotong rantai DNA
(double stranded) atau RNA. Dalam bakteri enzim ini berfungsi sebagai perlindungan diri
dengan cara memotong DNA pada sisi pemotongan tertentu. Salah satu contoh enzim retriksi
adalah Enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari
bakteri Escherichia coli. Enzim Ecor! Memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah
GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal
tersebut, Enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada
bagian atau situs anara G dan A.

Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama
tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada
bagian anatara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas
ganda yang dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal
dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

Berikut adalah contoh organisme-organisme penghasil Enzim retriksi

NAMA ENZIM SEKUENS PENGENAL ORGANISME ASAL

EcoRI G AATTC Escherichia coli

HindIII A AGCTT Haemophilus influenza

HhaI GCG C Haemophilus haemolyticus

TaqI T CGA Thermus aquaticus

BsuRI GG CC Bacillus subtilis

BalI TGG CCA Brevibacterium albidum

NotI GC GGCCGC Nocardia otidis-caviarum

BamHI G GATCC Bacillus amylolyquefaciens

SmaI CCC GGG Serratia marcescens

Berdasarkan cara pemotongannya Enzim retriksi digolongkan menjadi dua :

a. Endonuklease, memtotong nukleotida dari arah dalam

b. Eksonuklease memotong nukleotida hanya pada ujung atau dari arah luar

Endonuklease dapat mengenal urutan atau sekuen nukleotida pendek, antara 4-8 nuklotida, yang
sering dikenal dengan restrictionsite atau sisi pemotongan, atau situs pemotongan yang spesifik
dan berbeda-beda. Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain dengan
enzim endonuklease memilik dua bentuk yaitu hasil pemotongan sticky end (ujung runcing dan
blund end (ujung tumpul seperti pada skema dibawah ini.

Kemampuan memotong DNA pada sisi spesifik menjadi tonggak penting dalam pengembangan
metode manipulasi DNA sekarang ini. Endonuklease restriksi merupakan enzim bakteri yang
memotong DNA dupleks pada urutan target spesifik. Enzim ini dapat diperoleh secara komersial
dari perusahaan-perusahaan produk bioteknologi. Penamaan enzim restriksi didasarkan pada
sistem sederhana yang diusulkan oleh Smith and Nathans. Nama enzim (seperti BamHI, EcoRI)
menunjukkan bahwa asal enzim, tetapi tidak menunjukkan informasi spesifisitas pemotongan.
Sisi pengenalan enzim restriksi pada umumnya adalah urutan palindromik dengan panjang 4, 5,
atau 6 pasang basa (pb) seperti AGCT (untuk AluI), GAATTC (untuk EcoRI), dan lain
sebagainya.

Masing-masing enzim restriksi memotong urutan palindrom pada sisi spesifik, dan dua enzim
berbeda dapat mempunya urutan pengenalan yang sama, tetapi memotong DNA pada titik
berbeda di dalam urutan basa tersebut. Ujung DNA hasil pemotongan enzim restriksi dapat
dikelompokkan menjadi tiga ketergori: (1) ujung tumpul, (2) ujung lengkaet 5 dan (3) ujung
lengket 3.

Agarose gel elektroforesis atau southern analisis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
berdasarkan berat molekulnya. Metode ini ditemukan oleh Ed sourthern pada tahun 1975.
Metode ini digunakan untuuk mengidentifikasi fragmen DNA yang secara menyeluruh untuk
mengetahui DNA sekuen. Sourthern hibridisasi juga disebut sourthern blotting digunakan untuk
mengetahui perbandinagn antara genome dari suatu particular organisme dan dengan gen
penanda atau gen fragmen (probe). Ini dapat menjelaskan apakah suatu organisme berisi pertikel
gen dan mengandung informasi tentang pengorganisasian dan restriction map dari suatu gen.

Langkah-langkah dalam analisis sourthern gen DNA pada organisme dipotong dengan enzim
retriksi (endonuklease) menjadi fragmen-framen DNA lalu fragmen DNA tersebut dimasukkan
pada gel agarose lalu dilakukan elektroforesis dengan mengalirkan arus listrik dari kutub
negative ke positif kemudian hasil pemisahan DNA tersebut didenaturasi dalam suatu alkali dan
ditransferkan pada membran nitroselulosa. Pada membrane fragmen DNA telah menjadi single
stranded lalu dimasukkan kedalam larutan yang mengandungDNA probe, proses ini disebut
DNA hibridisasi dengan kata lain DNA target danDNA probe membentuk suatu hybdrid
karena keduanya saling melengkapi sekuen dan juga dapat membentuk ikatan satu sama lain.
DNA probe biasanya mengandung pelabelan radioaktif dengan - [32P] dan polynucleotide
kinase sering dengan pemindahan 5 phosphate dari probe dengan menggunakan alkaline
phosphatase. Setalah itu membrane dicuci untuk menghilangkan ikatan probe yang non spesifik,
kemudian dengan memajangkannya pada film sinar X akan terbentuk warna hitam apabila positif
terbentuk ikatan antara DNA dan probe. Proses ini disebut autoradiography. Hal ini dapat
digunakan untuk mengidentifikasi ukuran DNA dan sejumlah fragmen gen kromosom dengan
kekuatan yang sama dengan fragmen gen yang digunakan oleh probe.