Sebelumnya, dua peristiwa (H15 dan B20) transgenik lada (Capsicum annuum L.

) yang
meningkatkan ketahanan terhadap Mentimun mosaik virus (CMV) dengan diperkenalkannya
CMV gen protein mantel (CP) dibangun. Saat ini, single Jumlah salinan gen CP terungkap pada
H15 dan B20 oleh Bagian selatan. Untuk memprediksi kemungkinan efek yang tidak diinginkan
akibat Penyisipan transgen dalam gen endogen, kita melakukan sequencing dari daerah
genatan gen CL yang berwarna 5'dan Blastbased pencarian. Hasilnya menunjukkan bahwa
penyisipan transgen ke gen yang mengkodekan protein putatif dapat terjadi pada Acara
transgenik H15 dan B20. Rantai polimerase Mutiplex reaksi (PCR) untuk deteksi dan identifikasi
simultan Lada transgenik dilakukan dengan seperangkat sembilan primer. Kedua peristiwa
transgenik dibedakan dari non transgenik Acara dengan hadirnya 267 bp dan 430 bp produk
PCR indikatif pasangan primer gen spesifik CP dan penargetan pasangan primer gen CP dan
promotor 35S. H15 dan B20 unik masing memiliki produk PCR 390 bp dan 596 bp. Itu adanya
produk 1115 bp yang sesuai dengan lada intrinsik Gen aktin mengkonfirmasi penggunaan DNA
lada sebagai PC template. Set primer dan kondisi PCR yang digunakan saat ini memungkinkan
identifikasi yang akurat dan sederhana tahan CMV lada transgenik.

Sejak tanaman transgenik pertama kali dikomersialisasikan pada tahun 1997,

penggunaan global mereka semakin meningkat, melebihi 50- kali lipat pada tahun 2005.
Kedelai transgenik, jagung, kapas dan kanola merupakan hampir 100% dari area budidaya
transgenik tanaman, dan sisanya terdiri dari Bacillus thuringiensis nasi dan virus tahan squash
dan pepaya (James et al 2005). Sejak diperkenalkannya tanaman transgenik, Perhatian telah
diungkapkan tentang konsekuensi dari pengenalan gen transgenik yang tidak disengaja.
Pengenalan gen transgenik berpotensi mempengaruhi fungsi dari sekuens sekitarnya (insertion
effect) atau visa versa (posisi efek). Efek penyisipan DNA yang tidak diinginkan dapat diprediksi
sebagian berdasarkan pengetahuan tentang lokasi dan fungsi DNA yang dimasukkan (Kuiper et
al. 2001). Multiplex polymerase chain reaction (PCR) yang dilakukan dengan menggunakan
kombinasi beberapa pasangan primer di tabung reaksi yang sama, menghasilkan lebih banyak
informasi dalam jangka pendek waktu dari single end point PCR dengan konsumsi reagen
kurang (Germini et al 2004). Sejak deskripsi pertamanya di tahun 1988, Metode ini telah
berhasil diterapkan di berbagai bidang Uji DNA (Henegariu et al 1997). Baru-baru ini, beberapa
penelitian telah mengeksploitasi multiplex PCR agar efisien dan andal deteksi dan / atau
identifikasi tunas bit transgenik (Mannerlif dan Tenning 1997), dan dimodifikasi secara genetis
varietas jagung (Matsuoka et al 2001, James et al 2003), kanola dan kedelai (James et al.,
2003). Sebelumnya, lada transgenik menjadi penghambat patotipe baru Virus mosaik mentimun
CMVP1 dikembangkan secara genetik transformasi gen protein mantel (CP) dari CMVP0 (Lee
et al., 2009). Penelitian ini dilakukan untuk menyediakan informasi lebih lanjut tentang lada
transgenik yang baru dikembangkan peristiwa. Secara khusus, kami melakukan analisis DNA
blot untuk menentukan nomor copy transgenik, melakukan pengurutan dari daerah mengapit
DNA yang dimasukkan untuk memprediksi tidak disengaja efek pada kejadian transgenik dan
multipleks PCR yang digunakan untuk mendeteksi dua acara transgenik dan juga untuk
mengidentifikasi setiap dua acara.

Bahan dan metode

Isolasi DNA
DNA genom diisolasi dari jaringan daun non transgenik acara # 2377 (acara orang tua
dari H15) dan # 915 (orang tua acara B20), dan dari acara transgenik H15 dan B20 sebagai
sebelumnya dijelaskan (Kim dan Hamada 2005). Contoh genomik Konsentrasi DNA ditentukan
dengan mengukur ultraviolet (UV) pada 260nm dan kemurnian sudah dipastikan dengan
mengukur absorbansi protein pada 280 nm dan 230 nm, dan menghitung rasio A260 / A280 dan
A260 / A230. Semua pengukuran menggunakan spektrofotometer Beckman DU 700 UV / vis
(Beckman Instrumen, Fullerton, CA)

Analisis blot selatan

DNA genom (30g) dicerna dengan EcoR dan HindIII untuk memotong gen CP yang dimasukkan
Fragmen DNA yang dihasilkan adalah dipisahkan dengan elektroforesis pada gel agarose 0,8%
dan dilalui fragmen dipindahkan ke yang bermuatan positif membran nilon (Roche Molecular
Biochemicals, Mannhein, Jerman) dengan transfer kapiler menggunakan NaOH 0.4N. Probe
DNA untuk gen NPTII atau CMV CP cDNA diambil dari kit sintesis probe digoxigenin-PCR
(Roche Molecular Biochemicals), Pra hibridisasi, hibridisasi, dan pasca hibridisasi Prosedur
dilakukan sesuai dengan pabrikan instruksi.

PCR berbasis genom berjalan

dilakukan dengan menggunakan protokol yang diberikan oleh vendor GenomeWalker

Universal kit (Clontech Laboratorium, Palo Alto, CA). DNA genom dicerna dengan AluI,
DraI, EcoRV, HpaI, PvuII dan StuI, dan diligasi dengan adaptor GenomeWalker
(Clontech Laboratories). PCR dilakukan dengan menggunakan masing-masing enzim
yang dicerna DNA perpustakaan, 10 pM AP1 primer, 10 pM gen CP spesifik terbalik
primer, campuran 0,2 mM dNTP, 2,5 U dari EX Taq polimerase (TaKaRa Shiga,
Jepang) dan buffer 10 EX Taq (TaKaRa) di volume reaksi 50 l menggunakan
pengendali termal xp (Teknologi Bioer, Hangzhou, Cina). Kondisi bersepeda terdiri dari
5 siklus 94 untuk 25 s dan 72 selama 3 menit diikuti dengan 20 siklus 94 untuk
25 s dan 67 selama 3 menit, dengan siklus akhir di 67 selama 7 menit. Semi-
nested PCR dilakukan di bawah kondisi yang sama menggunakan 1/10 produk PCR
primer sebagai template DNA dan menggunakan primer AP2.

Multiplex PCR dan sekuensing produk PCR

Reaksi PCR multipleks dilakukan pada saat kejadian 40 ng DNA genom, 10 pM

dari lima pasangan primer, 0,2 campuran mM dNTP, 1.5U EX Taq polimerase dan 10x
EX Penyangga Taq dalam volume reaksi 50 l. Bersepeda termal itu menggunakan
siklon termal xp tersebut pada suhu 94 selama 3 menit untuk predenaturasi, 35 siklus
94 untuk 30 s, 60 selama 30 detik dan 72 selama 1 menit, dengan siklus akhir
pada 72 selama 5 menit. Itu Produk PCR yang diperkuat dipisahkan oleh
elektroforesis pada gel agarose 0,8%. Mengidentifikasi kondisi optimal multipleks PCR,
konsentrasi masing-masing primer disesuaikan tergantung pada rentang linier
amplifikasi PCR sebelumnya dilakukan. Setiap fragmen PCR dilumasi menjadi vektor T
& A (Real Biotech, Taipei, Taiwan) dan diurutkan. Yang didapat Urutan disejajarkan
dengan urutan vektor dan / atau flanking region dengan program CLC Sequence Viewer
6.0.2 (CLC bio, Katrinebjerg, Denmark) dan program kalign

Hasil dan Diskusi

Hibridisasi selatan Analisis DNA blot dilakukan dengan probe yang berasal dari gen CP
dan gen tahan kanamikin NPTII. Saat genomik DNA yang dicerna dengan EcoRI dan
HindIII dihibridisasi dengan probe spesifik NPTII, sebuah band tunggal terlihat jelas di
Kejadian transgenik H15 dan B20, namun tidak ada band yang dapat dilihat dalam
acara orang tua (Gambar 1). Hibridisasi dengan gen CP Probe spesifik juga
menghasilkan single band saat dicerna EcoRI tapi dua band terlihat jelas saat dicerna
dengan Hind AKU AKU AKU. Hal ini bisa dijelaskan karena probe spesifik gen CP
terbuat dari urutan DNA gen CP lengkap dan gen CP Dalam genom DNA tanaman
transgenik mengandung satu Hind III situs pembatasan. Flanking region dan prediksi
efek yang tidak diinginkan Dalam transformasi Agrobacterium-mediated, penyisipan
transfer DNA dengan urutan DNA genom spesifik tanaman terjadi secara acak dan
dapat menghasilkan hasil penyisipan yang tidak biasa. Perubahan yang tidak biasa dari
tanaman transgenik dapat dideteksi dengan analisis morfologi dan kimiawi, meskipun
demikian Pendekatan bisa menjadi berat dan terhalang oleh pengetahuan yang tidak
lengkap sifat tanaman yang tidak diketahui atau bahan kimia. Lokalisasi Lokasi
penyisipan merupakan pendekatan yang paling langsung untuk memprediksi dan
mengidentifikasi kemungkinan terjadinya efek yang tidak diinginkan; Hal ini dapat
dicapai dengan sekuensing langsung dari DNA yang mengapit, Meski masih terbatas
pengetahuan genom tanaman (Kuiper et al. 2001). Urutan 5'-mengapit dari transgen di
Kejadian transgenik H15 dan B20 ditentukan oleh PCR genom berjalan Urutan flanking
sekitar 3000 bp di H15 dan 1000 bp pada B20 diperoleh. Sebuah DNA 300 bp mengapit
wilayah yang berdekatan dengan daerah vektor digunakan untuk menentukan situs
penyisipan (Gambar 2). Proses ini dilakukan oleh mencari urutan DNA yang diketahui
dalam urutan yang diungkapkan tag database menggunakan algoritma BLAST
Pencarian itu terungkap bahwa transgen H15 dapat dimasukkan ke dalam atau di
sebelahnya Capsicum annuum cDNA tak dikenal (aksesi Genebank tidak. GD102816
atau CO907187). Tapi, tidak ada kesamaan yang signifikan ditemukan di database
nukleotida. Transgen B20 juga mampu memasukkan sisipan serupa yang melibatkan
ortolog di lada tomat tak dikenal atau kentang cDNA (aksesi Genebank nos. BG627797,
CV505761, BG097242, atau BI434579), dan situs penyisipan menunjukkan kesamaan
yang signifikan dengan mRNA dari akar Solanum lycopersicum. Jadi, tidak disengaja
Efek bisa dibayangkan dengan menggunakan acara H15 dan B20, dan mungkin juga
setidaknya sebagian dapat diprediksi berdasarkan pengetahuan tentang penyisipan
lokasi, didefinisikan sebagai hilangnya fungsi gen di daerah penyisipan

Multiplex PCR untuk deteksi dan identifikasi transgenik tanaman

Deteksi tanaman transgenik dapat dilakukan dengan proteinbased metode seperti
Western blot dan enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), atau metode berbasis
DNA yang disertakan Southern blot dan PCR (Ahmed 2002). Barat dan Bagian selatan
dan ELISA sangat spesifik namun menderita relatif memakan waktu, mahal dan teknis.
Sebaliknya, pendekatan berbasis PCR, terutama multipleks PCR, adalah cara
sederhana dan sensitif untuk membedakan transgenik tanaman (Yamaguchi et al
2003). Multiplex PCR telah digunakan untuk mendeteksi atau mengidentifikasi tiga
tanaman transgenik utama: kedelai (Roundup ready), jagung (MON810, Bt11, acara
176, T14 / 25 dan GA21) canola (GT73, HCN92 / 28, MS8 / RF3, Oxy235) (James et
al., 2003, Margarit et al 2005, Germini et Al. 2004, Matsuoka dkk. 2001, Yamaguchi et
al. 2003).

Dalam penelitian ini, pendeteksian dan identifikasi yang mudah dan sederhana
untuk lesi toleran virus (Lee et al. 2009) dikembangkan menggunakan sistem multiplex
PCR. Karena efisiensi Amplifikasi dipengaruhi oleh kontaminasi DNA yang dimurnikan
(Hamill et al 1991), kemurnian DNA genom yang diekstraksi itu diperiksa Hanya DNA
dengan kemurnian tinggi, yang menghadirkan A260 / A280 dan Rasio A260 / A230
yang melebihi 1,8 dan 2,7 masing-masing adalah bekas. Karena kondisi optimum untuk
multiplex PCR tampaknya lebih bergantung pada kombinasi primer (James et Al. 2003),
reaksi PCR dilakukan dengan lima pasangan primer (Tabel 1 dan Gambar 3a) untuk
memverifikasi spesifisitas masing-masing primer pasangan. Konsentrasi masing-
masing primer disesuaikan tergantung pada rentang linier amplifikasi PCR. Lima target
primer vektor digunakan untuk membedakan kejadian transgenik dari nontransgenik
peristiwa. Terutama, dua ciri khas primer, merica 15 F untuk acara H15 dan merica 20
F untuk acara B20, yang Targetkan wilayah mengapit setiap peristiwa, digunakan untuk
mengidentifikasi acara H15 dan B20. Juga, dua primer spesifik untuk intrinsik gen aktin
lada digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa DNA lada digunakan sebagai template
untuk multiplex PCR. Dalam peristiwa H15 dan B20, gen CP R2 (primer antisense)
ditargetkan gen CP dan P35S F (sense primer) yang ditargetkan Pasangan primer
promotor 35, gen CP primer gen CP dan CP primer pasang target gen CP, dan aktin
Pepper actin F dan Pepper R pasangan primer menargetkan aktin pengkodean gen,
dengan diamplifikasi Produk PCR menjadi 267 bp, 430 bp, dan 1115 bp masing-
masing. Tapi, dalam acara non transgenik, hanya 1115 bp PCR produk muncul
(Gambar 3). Selain itu, PCR 390 bp hanya terlihat dari template DNA H15. Di B20,
sebuah PCR Produk 596 bp terlihat jelas. Gen CP primer menghasilkan produk 430 bp
dengan CP gen F (diharapkan) dan 677 bp produk dengan P35S-F (tak terduga) pada
kedua peristiwa transgenik, sedangkan gen CP R2 primer menghasilkan produk 1372
bp dengan lada 15 F (tak terduga) produk hanya di acara H15. Hasil ini mengkonfirmasi
spesifisitas dua primer terbalik yang menargetkan gen CP urutan dan sebagainya
keandalan hasil kita, dan juga mengungkapkan yang lain perbedaan antara acara H15
dan B20. Kloning dan sekuensing masing-masing pita difraksinasi dengan elektroforesis
Selanjutnya dilakukan. Data urutan dikonfirmasi masing band karena primer yang
digunakan dalam penelitian ini, masing-masing Produk PCR berisi urutan vektor dan /
atau mengapit urutan kejadian transgenik (Gambar 4). Idealnya, a Sistem PCR
multipleks mampu mendeteksi tanaman transgenik target seperti promotor dan / atau
spidol seleksi yang juga mampu Mengidentifikasi acara tertentu akan menjadi user-
friendly dan mampu menyederhanakan proses deteksi tanaman transgenik dan
identifikasi (James et al., 2003). Juga, penggunaan yang spesifik pasangan primer yang
menargetkan baik transgen dan daerah mengapit Setiap peristiwa transgenik
memberikan kehandalan karena kemungkinan terjawab analisis karena secara spontan
terinfeksi virus dikecualikan
Kesimpulan Kami menggunakan pasangan primer yang menargetkan promotor
dan transgen, dan Spesifisitas primer ditargetkan pada peristiwa transgenik Deteksi dan
identifikasi yang efisien, handal dan sederhana tahan virus lada transgenik yang diraih.
Satu set dari sembilan primer dan kondisi PCR yang digunakan dalam penelitian ini
mungkin menawarkan deteksi dan identifikasi yang tepat dan sederhana tahan virus
lada transgenik.