PANDUAN PRAKTIKUM

PEWARNAAN GRAM

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah selesai melakukan percobaan ini diharapkan siswa dapat :
1. Membuat olesan preparat dengan tepat
2. Memahami pewarnaan gram
3. Menentukkan kelompok bakteri berdasarkan pewarnaan gram

II. TEORI DASAR

Mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak transparan (tembus pandang) bila diamati
dengan mikroskop cahaya biasa. Hal ini dikarenakan sitoplasma sel mikroba memiliki indeks bias
yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair dan mikroba tidak
mengabsorbsi atau membiaskan cahaya.
Kontras antara sel dan latar belakang (medium) dapat diperjelas dengan cara mewarnai sel-sel
mikroba tersebut dengan zat warna.
Zat warna pada umumnya dapat dibagi menjadi 2 golongan, yaitu :
1. Zat warna bersifat basa
Pada zat warna basa merupakan bagian yang berperan dalam memberikan warna yang
dinamakan kromatofor dan mempunyai muatan positif.
2. 𝑃𝑎𝑑𝑎 𝑧𝑎𝑡 𝑤𝑎𝑟𝑛𝑎 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑏𝑎𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑏𝑒𝑟𝑝𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑒𝑟𝑖𝑘𝑎𝑛 𝑧𝑎𝑡 𝑤𝑎𝑟𝑛𝑎 𝑚𝑒𝑚𝑝𝑢𝑛𝑦𝑎𝑖 𝑚𝑢𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒
Zat warna yang bermuatan negative umumnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroba,
tetapi digunakan untuk mewarnai latar belakang sediaan perwarnaan.

Tujuan dari pewarnaan adalah :

1. Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop
2. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba
3. Melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri, seperti dinding sel dan vakuola
4. Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna.

Fungsi dari fiksasi yang dilakukan sebelum pewarnaan adalah untuk :

a. Merekatkan sel mikroba pada kaca objek
b. Membunuh mikroorganisme secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan bentuk dan
strukturnya
c. Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna
d. Membuat sel-sel mikroba lebih kuat (keras)
e. Melepaskan granuler (butiran) protein menjadi gugus reaktif (NH3+) yang akan bereaksi
dengan gugus OH- dari zat warna
f. Mencegah otolisis sel yaitu pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim-enzim yang
dikandungnya sendiri.
g. Mempertinggi sifat relative gugus-gugus tertentu.

Pewarnaan diferensial atau pewarnaan gram Penemu metode pewarnaan ini adalah Christian Gram
Pewarnaan gram memilah bakteri menjadi 2 kelompok yaitu :
a. Bakteri gram positif yang akan terlibat berwarna ungu pada akhir pengecatan
b. Bakteri gram negatif yang akan terlibat berwarna merah pada akhir pengecatan.
III. Alat dan Bahan :
Alat : Bahan :
Kaca Objek = 2 buah Tisu
Lup ose = 2 buah Alkohol 70%
Bunsen = 1 buah 2 Sampel biakan mikroorganisme
Pipet tetes = 4 buah Gram A : larutan cat Kristal violet
Mikroskop = 1 buah Gram B : Larutan mordant iogol iodine
Gram C : Larutan peluntur aseton alkohol
Gram D : larutan cat safranin

IV. PROSEDUR KERJA :

1. Mempersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Mencuci peralatan yang akan digunakan
3. Mensterilkan diri dan area kerja
4. Mensterilkan kaca objek dengan cara menyemprotkan dengan alkohol dan lewatkan diatas
nyala api Bunsen sebanyak 3x
5. Mengambil sampel biakan mikroorganisme dengan ose steril secara aseptik kemudian
meletakkan diatas permukaan kaca objek, ratakanlah dan keringkan dengan angin
6. Melakukan fiksasi dengan cara melewatkan olesan sampel diatas nyala api bunsen
7. Meneteskan larutan Gram A sebanyak 2-3 tetes pada permukaan preparat yang telah difiksasi
sampai menutup seluruh lapisan. Diamkan selama 1 menit kemudian cuci dengan air mengalir
lalu keringkan
8. Meneteskan larutan Gram B sebanyak 2-3 tetes pada permukaan preparat yang telah difiksasi
sampai menutup seluruh lapisan. Diamkan selama 1 menit kemudian cuci dengan air mengalir
lalu keringkan
9. Kemudian cuci dengan larutan peluntur yaitu Gram C sampai lapisan preparat tampak pucat
diamkan selama 30 detik kemudian cuci dengan air mengalir lalu keringkan.
10. Meneteskan larutan Gram D sebanyak 2-3 tetes pada permukaan preparat yang telah difiksasi
sampai menutup seluruh lapisan. Diamkan selama 2 menit kemudian cuci dengan air mengalir
lalu keringkan
11. Mengamati dibawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran kuat
12. Menggambar dan member keterangan bakteri yang terlihat sertab perhatikan bentuk dan
warnanya (bakteri gram positif berwarna ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah)
13. Lakukan hal yang sama pada di atas dengan sampel B.

FORMAT LAPORAN
1. TUJUAN
Tuliskan tujuan praktikum yang akan dikerjakan secara jelas dan singkat

2. TEORI DASAR
Tuliskan teori dasar dari pewarnaan gram seperti pengertian, prinsip,
pengelompokkan, tujuan, fungsi fiksasi.

3. PROSEDUR
Tuliskan alat dan bahan yang digunakan dan menuliskan prosedur percobaan
dalam bentuk diagram alir
4. PENGAMATAN, PERHITUNGAN DAN PEMBAHASAN
a. Hasil Pengamatan
(tuliskan hasil pengamatan dan menyertai poto/ gambar hasil pengamatan
berdasarkan percobaan yang telah dilakukan)
b. Pembahasan
(tuliskan pembahasan mengenai pewarnaan gram pada suatu
mikroorganisme)

5. KESIMPULAN
Tuliskan kesimpulan dari percobaan (sesuaikan dengan tujuan)

6. DAFTAR PUSTAKA
Tuliskan daftar pustaka yang digunakan