Review Jurnal : The Power of real-time PCR

Pendahuluan
REAL-TIME Polymerase Chain Reaction (PCR) muncul sebagai metodologi kuat
dan banyak digunakan untuk penyelidikan biologi karena dapat mendeteksi dan mengukur
jumlah yang sangat kecil dari sekuens asam nukleat yang spesifik.REAL-TIME Polymerase
Chain Reaction ( PCR) didasarkan pada metode revolusioner PCRyang dikembangkan oleh
Kary Mullis pada tahun 1980, metode ini memungkinkanpeneliti untuk memperkuat
potongan DNA spesifik lebih dari satu miliarkali lipat. Real-time PCR merupakan
inovasiberbasis PCR yang berkembang secara luas seiring dengan perkembangan jaman,PCR
real-time memberikan sesuatu yang menarik untuk ilmu biomedis (terutama diagnostic
molekuler dan fisiologi molekuler) dan bidang pendidikan kimia.
PCR hanya mengacu pada penguatan fiksasi DNA (PCR) yang dipantau selama
proses amplifikasi. Manfaat dari kemampuan real-time yaitu memudahkan peneliti untuk
mengetahui atau menentukan jumlah DNA dalam sampel sebelum proses amplifikasi dengan
PCR.Saat ini real-time dan kuantitatif, sering digunakan secara bergantian atau dalam
kombinasi, karena real-time PCR menjadi metode pilihan untuk mengukur jumlah asam
nukleat.

Tujuan PCR real-time

Tujuan dasar PCR real-time adalah membedakan secara tepat dan mengukur urutan
asam nukleat spesifik dalam sampel walaupun hanya ada jumlah yang sangat kecil. PCR real-
time memperkuat urutan target spesifik dalam sampel kemudian memantau kemajuan
amplifikasi menggunakan teknologi neon. Selain itu, produk akhir dapat dikarakterisasi lebih
lanjut dengan menundukkannya pada kenaikan suhu untuk menentukan kapan produk
terdampar ganda "meleleh."

Apa itu PCR?

Intinya, teknologi PCR real-time menggunakan PCR konvensional. PCR adalah
prosedur dimana DNA dapat disalin dan diperkuat. Seperti ditunjukkan pada Gambar.2, PCR
mengeksploitasi polimerase DNA untuk memperkuat potongan DNA tertentu dengan
menggunakan oligonukleotida sekuens spesifik seketika yang ditambahkan pada reaksi untuk
bertindak sebagai primer. Yang pertama dan paling umum digunakan dari enzim ini adalah
Taq DNA polimerase (dari Thermus aquaticus), sedangkan DNA polimerase Pfu (dari
Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaannya lebih tinggi saat menyalin
DNA.
Meskipun enzim ini sangat berbeda, keduanya memiliki dua kemampuan dasar yang
membuat mereka berguna untuk PCR: 1) mereka dapat menghasilkan untaian DNA baru
dengan menggunakan templat dan primer DNA, dan 2) tahan panas. Atribut yang terakhir
diperlukan karena setelah setiap putaran penyalinan DNA, DNA beruntai ganda (dsDNA)
harus "dilelehkan" menjadi untai tunggal dengan suhu tinggi di dalam tabung reaksi (95°C).
Reaksi tersebut kemudian didinginkan untuk memungkinkan primer oligonukleotida menjadi
anil pada DNA tempel berpendirian tunggal dan mengarahkan enzim polimerase DNA untuk
memulai pemanjangan dengan menambahkan nukleotida pelengkap tunggal untuk membuat
untaian DNA lengkap yang baru. Dengan demikian dsDNA dibuat. DsDNA baru ini
kemudian harus dilebur sebelum siklus penyalinan berikutnya dapat terjadi. Oleh karena itu,
jika reaksinya bekerja dengan efisiensi sempurna, akan ada dsDNA spesifik dua kali lebih
banyak setelah setiap siklus PCR. Pada kenyataannya, reaksi tidak menjaga efisiensi
sempurna karena reaktan dalam PCR dikonsumsi setelah banyak siklus, dan reaksinya akan
mencapai dataran tinggi (Gambar 3).
Selain itu, self-anil produk akumulasi juga dapat berkontribusi pada "efek dataran
tinggi". Sebenarnya, atribut PCR inilah yang membuat teknologi PCR real-time sangat
dibutuhkan. Karena reaksi tersebut dapat secara efisien memperkuat DNA hanya sampai
jumlah tertentu sebelum efek dataran tinggi, tidak ada cara untuk menghitung dengan tepat
jumlah DNA awal dengan menghitung jumlah produk pada saat penyelesaian PCR. Artinya,
tidak peduli berapa banyak urutan DNA target yang ada sebelum PCR, ada sejumlah DNA
diperkuat yang serupa setelah PCR, dan ada korelasi yang jelas antara jumlah mulai dan
jumlah akhir yang hilang. PCR real-time mengatasi masalah ini dengan memanfaatkan fakta
bahwa amplifikasi DNA terjadi secara efisien pada awal proses reaksi dan oleh karena itu,
mengukur pembentukan produk selama fase eksponensial ini (Gambar 3). Pengukuran ini
berkorelasi dengan jumlah DNA awal spesifik, dengan memungkinkan kuantifikasi.
Gambar.2

Gambar.3
Memeprluas Kegunaan PCR real-time
Batasan utama polimerase DNA (dan PCR sendiri) adalah bahwa mereka umumnya
harus menggunakan DNA sebagai templatenya. Mereka tidak bisa mengamplifikasi RNA
dengan cara yang sama. Masalah ini bisa diatasi dengan enzim lain, reverse transcriptase,
yang menghasilkan DNA komplementer (atau cDNA) dari template RNA. Reverse
transcriptases adalah enzim yang digunakan di alam oleh retrovirus, termasuk virus
imunodefisiensi manusia dan virus hepatitis C, untuk menghasilkan DNA dari virus RNA.
DNA yang diturunkan dari virus tersebut kemudian dapat dimasukkan ke dalam genom
inang.
Di laboratorium, reverse transcriptase digunakan untuk mengubah RNA menjadi
cDNA yang kemudian dapat digunakan untuk berbagai keperluan termasuk aplikasi berbasis
PCR. Ada beberapa reverse transcriptase yang umum digunakan, termasuk virus avian
myeloblastosis reverse transcriptase, virus Moloney murine leukemia reverse transcriptase,
atau enzim rekayasa yang meningkatkan aktivitas polimerase atau mengurangi aktivitas
nuklease yang tidak diinginkan (misalnya Omniscript, PowerScript, StrataScript, Superkript
II, dll. ). Di bawah kondisi reaksi yang tepat, jumlah relatif dari cDNA yang diberikan yang
dihasilkan oleh transkripsi terbalik sebanding dengan jumlah relatif tempelan RNAnya. Jika
ini tidak terjadi, pengukuran jumlah cDNA tidak memiliki relevansi dengan RNA. CDNA
yang dapat diimunisasi dapat digunakan sebagai bahan baku PCR real-time, sehingga
memanfaatkan ketepatan dan kepekaannya untuk menentukan perubahan ekspresi gen (yaitu,
tingkat RNA). Ini disebut RT-PCR real-time dan telah menjadi metode yang paling populer
untuk mengukur tingkat mRNA yang diperkuat.

Hal ini paling sering digunakan karena dua alasan:

 Baiksebagaialatinvestigasiutamauntukmenentukanekspresi gen, atau

 Sebagaialatsekunderuntukmemvalidasihasilmikroarray DNA.

Karena ketepatan dan kepekaan RT-PCR real-time, bahkan perubahan ekspresi gen
yang halus pun bisa terdeteksi. Jadi PCR real-time dapat digunakan untuk menilai tingkat
DNA dan RNA dengan sensitivitas dan presisi yang tinggi.

Senyawa Kimia pada PCR real-time

 Kunci PCR real-time adalah kemampuan untuk memantau kemajuan amplifikasi
DNA secara real time. Hal ini dilakukan oleh beberapa ahli kimia dan instrumentasi.
Umumnya, senyawa kimia yang terdiri dari probe fluoresen khusus pada PCR (Gambar 4).
Ada beberapa jenis probe , masing-masing jenis probe harus menghubungkan perubahan
fluks ke pengamplifikasi DNA. Semakin besar jumlah dsDNA yang ada dalam tabung reaksi,
semakin besar jumlah ikatan DNA dan sinyal fluoresen dari SYBR green I. Jika ada dua atau
lebih puncak, ini menunjukkan bahwa lebih dari satu sekuens ampli diperoleh, dan
amplifikasi tidak spesifik untuk target DNA tunggal.

Dalam hal struktur, probe hidrolisis adalah sekuens oligonukleotida berpori dengan
fluksorofor. Ketika quencher dan reporter berada dalam jarak dekat, keduanya sama-sama
terikat pada oligonukleotida pendek yang sama, quencher sinyal dari reporter. Ini adalah
contoh transfer energi resonansi fluoresen (juga disebut transfer Fo¨rster) dimana energi
dipindahkan dari "donor" (reporter) ke "akseptor" (quencher ) fluksorofor. Penghancuran atau
hidrolisis oligonukleotida menyebabkan peningkatan sinyal reporter dan sesuai dengan
penguat DNA yang spesifik. Sebagai tambahan, probe hidrolisis dapat mengidentifikasi
mutasi titik sederhana dalam amplikon dengan menggunakan analisis kurva leleh. Ada
beberapa variasi lain pada reporter-quencher, termasuk molekular beacon, sunrise primer, dan
scorpion primer. Yang masing-masingnya berfungsi untuk menjaga reporter dan quencher
sebelum amplifikasi sambil memisahkannya dan menghasilkan sinyal fluoresen selama
amplifikasi. Probe hibridisasi, menggunakan donor dan akseptor fluorophores, sedangkan
PNA yang mengandung fluorophores oranye tiazol (disebut probe ringan) juga memancarkan
sinyal lebih besar pada pengikatan DNA.

Instrumentasi PCR real-time

 Persyaratan paling utama pada teknologi pcr real-time adalah kemampuan mendeteksi
sinyal fluorescent. Karena fluoresen kimia membutuhkan masukan energi khusus untuk
eksitasi dan mendeteksi emisi panjang gelombang tertentu, instrumentasi harusnya mampu
melakukan keduanya secara bersamaan dan pada panjang gelombang yang diinginkan.
Dengan demikian senyawa kimia dan instrumentasi saling berhubungan satu sama lain.
Saat ini, ada tiga cara dasar di mana real-time instrumentasi dapat memasok energi
eksitasi untuk fluorophores: dengan lampu, light-emitting diode (led), atau laser (gambar 5).
Lampu diklasifikasikan sebagai perangkat emisi spektrum luas, sedangkan led dan laser
adalah spektrum sempit. Instrumen yang memanfaatkan lampu (tungsten halogen atau kuarsa
tungsten halogen) mungkin juga termasuk filter untuk membatasi cahaya yang dipancarkan
pada panjang gelombang eksitasi tertentu. Instrumen yang menggunakan lampu termasuk
terapan biosystem's abi prism 7000, stratagene's mx4000 dan mx3000p, dan iq-iq izycler.
Sistem led termasuk roche's lightcycler, cepheid's smartcycler, corbett's rotor-gene, dan mj
research's dna engine opticon 2. Abi prism 7900ht adalah satu-satunya mesin untuk
menggunakan laser untuk eksitasi
Untuk mengumpulkan data, energi emisi juga harus terdeteksi pada panjang
gelombang yang sesuai. Detektor termasuk charge-coupled kamera, tabung photomultiplier,
atau jenis lainnya photodetectors. Panjang gelombang sempit filter atau saluran umumnya
hanya digunakan untuk panjang gelombang yang diinginkan lolos ke photodetektor yang
akan diukur. Biasanya, banyak panjang gelombang diskrit yang dapat diukur sekaligus, yang
memungkinkan untuk multiplexing, yaitu menjalankan beberapa tes dalam tabung reaksi
tunggal.
 Bagian lain dari instrumentasi terdiri dari thermocycler yang digunakan untuk
melakukan pcr. Mengatur suhu real-time di antara semua sumuran sampel sangatlah penting,
karena perbedaan suhu dapat menyebabkan efisiensi amplifikasi pcr yang berbeda. Hal ini
dilakukan dengan menggunakan blok pemanas (peltier berbasis atau resistif), udara panas,
atau kombinasi keduanya. Blok pemanas umumnya mengubah suhu lebih lambat dari udara
yang dipanaskan, sehingga menghasilkan thermocycling yang lebih lama. Misalnya model
penggunaan lightcycler milik roche, udara panas bisa melakukan 40 kali siklus dalam 30
menit, sedangkan terapan biosistem abi prism 7900ht menggunakan pemanasan berbasis
peltier blok yang memakan waktu 1 jam 45 menit.
Instrumentasi real-time tidak akan lengkap tanpa perangkat keras komputer, sumber
data yang tepat dan perangkat lunak analisis. Platform software mencoba menyederhanakan
analisis data pcr real-time dengan menawarkan output grafis hasil pengujian meliputi
amplifikasi dan disosiasi (pencairan titik) kurva (gambar 3). Kurva amplifikasi memberikan
data mengenai kinetika amplifikasi dari urutan target, sedangkan kurva disosiasi
menunjukkan karakteristik dari produk akhir amplifikasi.

Kelebihan dan Kekurangan Kuantisasi PCR real-time

Ada banyak metode dalam biologi molekuler untuk mengukur jumlah urutan asam
nukleat. Namun, sebagian besar dari metode ini memiliki kekurangan: memerlukan waktu
yang lama, tenaga kerja intensif, kurang sensitif, non-kuantitatif, memerlukan penggunaan
radioaktivitas, atau kemungkinan besar terjadi kontaminasi silang. Metode ini tidak hanya
terdapat pada hibridisasi Southern dan northern, HPLC, pendekatan assay, PCR-ELISA,
perlindungan assay RNAse, hibridisasi in situ, dan berbagai gel elektroforesis sistem PCR.
 PCR real-time memiliki keuntungan yang berbeda dibanding metode-metode
sebelumnya, seperti kemampuannya dalam mengukur asam nukleat melalui rentang dinamis
yang luas (< 5 unit log). Hal ini ditambah dengan sensitivitas yang ekstrim, yang
memungkinkan deteksi kurang dari lima eksemplar (mungkin hanya satu salinan dalam
beberapa kejadian) dari urutan target, sehingga memungkinkan untuk menganalisis sampel
kecil seperti biopsi klinis. Dengan standar internal dan perhitungan yang tepat, rata-rata
koefisien variasinya adalah 1-2%, analisis direproduksi dari ekspresi gen pada ekspresi
tingkat rendah. Selain itu, semua platform real-time relatif cepat, dan menghasilkan
otomatisasi yang tinggi. Sehingga, PCR real-time dilakukan reaksi dalam bejana tertutup
yang tidak memerlukan manipulasi pasca-PCR, sehingga dapat meminimalkan kemungkinan
kontaminasi silang di laboratorium.
Namun, ada beberapa kekurangan metode PCR real-time. Yang secara mayoritas
terdapat dalam semua teknik berbasis PCR atau RT-PCR. PCR real-time rentan terhadap
penghambatan PCR oleh senyawa yang terdapat dalam sampel biologis tertentu. Sebagai
contoh, penggunaan klinis dan forensik untuk PCR real-time dapat dipengaruhi oleh inhibitor
yang dapat ditemukan dalam cairan tubuh tertentu seperti hemoglobin atau urea.
Pengaplikasian makanan mikrobiologi mungkin mengalami inhibitor organik dan fenolik.
Untuk mengatasi masalah ini, polimerase DNA alternatif (misalnya, TFL, PWO, TTH, dll)
yang tahan terhadap inhibitor tertentu dapat digunakan. Keterbatasan lainnya terutama
menyangkut analisis berbasis PCR real-time dari ekspresi gen. Karena penggunaan yang
diperlukan dari RNA memerlukan tambahan enzimatik, memungkinkan lebih banyak
masalah terjadi. RNA sangat labil dibandingkan dengan DNA, oleh karena itu isolasi harus
dilakukan secara hati-hati untuk memastikan kedua integritas RNA itu sendiri dan
penghilangan nuklease yang mencemari DNA genom, dan RT atau inhibitor PCR . Ini bisa
menjadi masalah pada sumber sampel, tetapi sampel klinis menjadi perhatian khusus karena
inkonsistensi dalam ukuran sampel, koleksi, penyimpanan, dan transportasi dapat
mempengaruhi kualitas variabel RNA template.
Kemungkinan kekurangan PCR real-time tidak terdapat dalam teknologinya
melainkan terdapat pada kesalahan pengguna seperti: pengembangan assay yang tidak benar,
data analisis yang tidak benar, atau kesimpulan yang tidak beralasan. Pengalaman peneliti
menggunakan PCR real-time untuk analisis ekspresi gen, primer PCR real-time set harus
dirancang dan sesuai dengan kriteria/ syarat yang sudah disahkan, untuk memastikan
spesifisitas dan akurasi hasil (Gbr. 3). Untuk mikrobiologi, positif palsu atau negatif palsu
harus dipertimbangkan ketika merancang sebuah tes untuk mendeteksi patogen. Amplifikasi
dan kurva seharusnya diperiksa secara visual, perhitungan berdasarkan kurva ini harus
diperiksa dua kali untuk akurasinya. Analisis ekspresi gen PCR Real-time mengukur tingkat
mRNA dan hanya menunjukkan kemungkinan perubahan di tingkat protein. Dan meskipun
ada hubungan erat antara ekspresi gen dan fungsi produk gen, hal ini tentu tidak selalu
terjadi, dan demonstrasi resmi mungkin diperlukan untuk proyek penelitian tertentu.
Berdasarkan data yang diperoleh dari PCR real-time, yang terbaik digunakan ketika konteks
biologis dapat dipahami dengan baik.

Aplikasi umum untuk PCR rel-time

1. Kuantisasirelatifdanmutlakekspresi gen.
Setelahisolasi, RNA linear diubahmenjadicDNA, yang digunakanuntuk real-
time PCR. AmplifikasiKurvayang
digambarkanolehperangkatlunakuntukmembantumenentukan“waktusiklus” di
manafluoresensimencapaiambangbatas(CT; Gambar 3.). Nilai CT
iniberbandingterbalikdenganjumlah sekuens DNA
tertentudalamsampelasli.Keduakuantisasirelatifdanmutlakekspresi
genmemanfaatkannilai CT
mendugajumlahcDNAdandengandemikianmenentukanekspresi gen. Dalam PCR
sempurnaefisien, jumlahprodukdiperkuatgandasetiapsiklus.
Kuantisasirelatifmengukurperubahan tingkatdari gen yang diinginkanterhadap gen
kontrolinvariate
2. Validasihasil DNA microarray.
Arraydigunakankarenamemungkinkanpenelitiuntukmelihatbagaimanamanipul
asieksperimentaldapatmempengaruhisalahsatudariribuan gen hadirpada array.Real-
time PCRdapatmembedakanurutantertentudaricampurankompleksDNA.Oleh karena
itu,
halinibergunauntukmenentukankehadirandankuantitasurutanunikpatogentertentuatau
patogen laindalamsampel.
3. Identifikasimutasi
Real-time PCRcocokuntukanalisismutasi,
termasuknukleotidatunggalpolimorfisme(SNP), seringmenggantiteknik
lainsepertisequencing,
untaitunggalteskonformasipolimorfisme,dananalisisfragmenrestriksipanjangpolimorfi
sme.Untukmendeteksimutasipadaurutannya, analisiskurva
 secaraotomatisdilakukanpadaprodukyang diperkuat (amplikon)segerasetelah PCR
thermocyclingdanpengukuran fluoresensi.

Aplikasi pada masa depan Prespektif

Dalam industri makanan komersial dan pertanian, PCR real-time digunakan untuk
mendeteksi dan identifikasi mikroba, parasit, atau organisme hasil rekayasa genetika.
Forensik mendapatkan keuntungan dari sensitivitas, spesifisitas, dan kecepatan PCR real-
time, terutama karena waktu untuk investigasi kriminal dan ukuran spesimen mungkin
terbatas. Mengurangi biaya dan meningkatkan portabilitas untuk diagnosis penyakit di daerah
terpencil bersamaan dengan studi epidemiologi di tempat dan dapat memfasilitasi pengalihan
teknologi ilmiah yang dibutuhkan ke negara-negara berkembang. Karena permintaan untuk
mengukur ekspresi gen tidak mungkin berkurang dan ilmu biomedis berkembang, generasi
baru mesin PCR real-time kemungkinan besar akan dikembangkan. Pengajaran PCR realtime
dapat digunakan baik sebagai platform untuk mengenalkan konsep kunci dalam biologi.
PCR real-time menghasilkan tampilan terfokus pada "transkriptom," yang
memungkinkan peneliti untuk lebih memahami program transkripsi yang mendasari fisiologi,
patofisiologi, dan perkembangan. Memahami ekspresi gen dan mempersempit kesenjangan
pengetahuan antara "petunjuk" (genom) dan "fungsi" (produk gen) biologi.
Gambar. 6. Contoh analisis PCR real-time. Tikus menerima obat yang secara khusus
mengaktifkan berbagai reseptor hormon nuklir (tercantum pada sumbu x).

Contoh aplikasi PCR real-time untuk kuantitasi relatif ekspresi gen

Peroksisom proliferator-activated receptor (PPAR)-α, -β (δ), dan -γadalah anggota
dari superfamili reseptor nuklir dan diketahui diaktifkan oleh asam endogen jenuh dan rantai
panjang lemak tak jenuh, eikosanoid, dan prostaglandin. Selain itu, dua kelas agen
antidiabetes diketahui pengikatan PPARs: fibrat (misalnya, fenofibrate, yang dikenal secara
klinis sebagai Lofibra atau Tricor) mengikat PPAR-α , sedangkan thiazolidinediones
(misalnya, rosiglitazone, yang dikenal secara klinis sebagai Avandia) mengikat PPAR-γ.
Pengikatan obat ini mengaktifkan faktor transkripsi masing-masing untuk meningkatkan
transkripsi gen target dan efek respon fisiologis.
Karena aktivasi PPAR-αmembantu oksidasi asam lemak di jaringan (terutama hati
dan jantung), dapat meningkatkan sensitivitas insulin dengan mengurangi akumulasi asam
lemak intraseluler. Aktivasi PPAR-αmembantu penyimpanan lipid dalam jaringan adiposa,
sehingga melindungi sisa tubuh dari kelebihan lipid dan resistensi insulin (15). Aktivasi
PPARs juga dapat meningkatkan sensitivitas insulin dengan cara lain. Adiponektin dianggap
menjadi “adipocytokine” karena dibuat secara eksklusif oleh jaringan adiposa dan kemudian
disekresikan ke dalam sirkulasi. Reseptor adiponektin 1 (AdipoR1) dinyatakan dimana-mana
tapi paling spesifik di otot rangka, sedangkan AdipoR2 terutama dinyatakan dalam hati (51).
Karena sistem adiponektin sudah terlibat dalam meningkatkan sensitivitas insulin, kami ingin
tahu apakah insulin sensitisasi PPARs bisa sebagian disebabkan oleh efek potensial mereka
terhadap ekspresi reseptor adiponektin.

Hasil menunjukkan bahwa fenofibrate meningkatkan ekspresi reseptor adiponektin di

hati oleh pengaruh mekanisme PPAR-α dan menyarankan bahwa fenofibrate dapat
meningkatkan sensitivitas insulin dengan meningkatkan aksi adiponektin pada hati. Penelitian
lebih lanjut dilalukan untuk menentukan apakah PPAR-α bertindak langsung pada promotor
AdipoR1 dan AdipoR2 gen di sel hati atau tidak langsung dengan cara lain (misalnya,
perubahan metabolisme). Dan juga, hasil konsisten dengan potensi terapeutik PPAR-
α/γganda agonis (5, 52).