BIOKIMIA

MAKALAH PENDAMPING ISBN : 978-979-1533-85-0

(Kode : F-14)

KARAKTERISASI FRAGMEN 0,58 kb GEN PENGKODE STILBEN SINTASE (STS)

DARI TANAMAN MELINJO (Gnetum gnemon L.)

1 2
Rosyida Azis Rizki , Tri Joko Raharjo
1
Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Gadjah Mada, Sekip Utara Yogyakarta 55281. Email:
azies_rizq@yahoo.com
2
Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Gadjah Mada, Sekip Utara Yogyakarta 55281. Email:
tri_jrarvin@yahoo.com

Abstrak
Resveratrol bermanfaat dalam kesehatan sebagai antikanker dan agen pencegah kanker (cancer chemopreventive).
Melinjo (Gnetum gnemon) telah diketahui sebagai penghasil resveratrol. Gen pengkode sts pada melinjo dianggap
sebagai salah satu target untuk perubahan genetik tanaman penghasil resveratrol. Amplifikasi dilakukan dengan RT-
PCR dengan pasangan primer GGF2 (5’ AAGGGCATCAAGGAGTGGGG 3’) dengan GGR2 (5’
CACCAGGATGTGCGATCCAG 3’) menghasilkan banyak fragmen dengan salah satu fragmen berukuran 0,58 kb sesuai
dengan perkiraan ukuran berdasarkan posisi urutan primer di gen sts yang lain. Hasil sekuensing fragmen hasil RT-PCR
(fragmen 0,58 kb) menunjukkan kemiripan dengan urutan DNA gen sts Arachis hypogaea, sebesar 67%. Homologi ini
lebih tinggi dibandingkan kemiripan urutan antara gen sts yang biasanya berkisar 66%. Dengan demikian penelitian ini
telah berhasil mendapatkan urutan DNA fragmen gen sts Gnetum gnemon.

Kata Kunci: Gen stilben sintase (sts), RT-PCR, Resveratrol, Melinjo (Gnetum gnemon L.)

PENDAHULUAN alami seperti tumbuhan hingga puluhan kilogram

Penyakit kanker merupakan salah satu dengan proses pemurnian yang relatif panjang
masalah kesehatan yang dihadapi dunia pada dan mahal. Hal ini menjadikan proses isolasi dari
saat ini. Pengobatan pada kanker biasanya tumbuhan menjadi sangat tidak ekonomis.
mengkombinasikan pembedahan, radiasi, dan Salah satu alternatif produksi resveratrol
chemoteraphy (terapi obat). Selain pengobatan adalah dengan menggunakan pendekatan biologi
kanker juga dapat di cegah diantaranya dengan molekuler. Berdasarkan jalur biosintesis
menggunakan obat dan suplemen pencegah resveratrol diketahui bahwa enzim Stilbene
kanker (cancer chemopreventive). Sintase (STS) merupakan enzim kunci dalam
Salah satu senyawa yang banyak biosintesis. Enzim ini mengkatalisis kondensasi p-
menunjukkan anti kanker yang sekaligus dapat coumaril-CoA dengan malonil-CoA menhasilkan
berfungsi sebagai kemopreventif adalah senyawa resveratrol [2].
resveratrol [1]. Pemanfaatan resveratrol sebagai Gen pengkode sts yang dikenal sebagai gen
senyawa chemopreventive terkendala pada sts merupakan gen kunci yang bertangung
ketersediaanya. Untuk mendapatkan beberapa jawab terhadap proses biosintesis sehingga jika
gram resveratrol diperlukan isolasi dari bahan gen tersebut dapat diklon ke dalam bakteri

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 726
Escherichia coli, maka bakteri akan menghasilkan selama 10 menit. Campuran disentrifugasi pada
sts yang dapat dimanfaatkan untuk katalis 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (500
biosintesis in vitro bahkan kemungkinan bakteri µL) dipindah ke tube yang baru, tambahkan
tersebut dapat memproduksi resveratrol. isopropanol 500 µL dan diinkubasi pada suhu
Di antara tanaman penghasil resveratrol, kamar selama 10 menit. Campuran disentrifuse
tanaman Melinjo (Gnetum gnemon) merupakan pada 12.000 rpm selama 15 menit dan
tanaman yang banyak terdapat di Indonesia. supernatan dibuang. Pellet dicuci dengan 1000
Dalam Gnetum gnemon telah ditemukan µL etanol 75% sebanyak 2 kali, divortex dan
resveratrol dan turunannya [3]. disentrifuge pada 7500 rpm selama 10 menit,
sisa etanol dikeringkan dalam laminar flow dan

METODE PENELITIAN pellet RNA total dilarutkan dalam RNAse free

water.
Alat dan bahan
RNA total dianalisis kualitatif menggunakan
Alat yang digunakan adalah timbangan
elektroforesis gel agarose 1 % dalam 100 volt.
digital, Waterbath incubator, Mesin PCR,
Analisis kuantitatif dengan menggunakan
sentrifugase, seperangkat alat elektroforesis,
spektrofotometer UV pada λ 260 dan 280 nm.
pipet mikro, microwave, laminar flow, lampu UV,
RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase
DNA sequencer ABI PRISM 310.
Chain Reaction)
Bahan utama yang digunakan adalah daun
Sebanyak 1 μg RNA total ditambah 1 µL
melinjo (Gnetum gnemon), dan primer
oligo-dT primer, 2 µL random hexamer primer,
GGF1(5’GCAACCGTCCTGGCAATCGC3’) dan
dan RNAse free water sehingga volume total
GGR1 (5’ GTTCCACCTGCGAAGCAGCC 3’). Bahan
menjadi 13 µL, tambahkan mineral oil 20 µL dan
kimia yang digunakan adalah Trizol reagent,
sentrifuge singkat (spin) selama 10 detik.
Transcriptor first strand cDNA synthesis kit,
Campuran template-primer dalam mesin PCR
TM
illustraTM Ready To Go PCR bead, PureLink
pada suhu 65 ºC selama 10 menit, dinginkan
Quick gel extraction kit dan bahan pendukung:
dalam ice bath. Tambahkan 4 µL transcriptor RT
isopropanol, kloroform, etanol 75%, agarose,
reaction buffer 5X, 2 µL campuran dNTP, 0,5 µL
loading buffer, ethidium bromida, DNA marker,
protector RNAse inhibitor dan 0,5 µL transcriptor
RNAse free water, aquadest steril, nitrogen cair,
RT, sehingga volume total 20 µL, dihomogenkan
buffer TAE.
secara hati-hati, spin selama 10 detik. Campuran
reaksi di inkubasi pada suhu 25 ºC selama 10
Prosedur Penelitian
menit (suhu kamar), PCR pada suhu 55 ºC
Isolasi RNA Total Melinjo
selama 30 menit dan pada suhu 85 ºC selama 5
Daun melinjo muda 100 mg dengan nitrogen
menit.
cair digerus dalam mortar dan dimasukkan dalam
PCR (Polymerase Chain Reaction)
ke tube 1,5 mL, dilarutkan dengan trizol 1000 µL,
Sebanyak 1 butir illustraTM Ready To Go
divortex dan inkubasi pada suhu kamar selama
PCR bead dilarutkan dalam RNAse free water 21
10 menit. Campuran disentrifugasi pada 12.000
µL, tambahkan 1 µL primer forward (GGF2), 1 µL
rpm selama 5 menit. Supernatan (800 µL)
primer reverse (GGR2) , 2 µL template (cDNA)
dipindahkan ke tube yang baru, tambahkan
hasil tahap RT-PCR, volume total 25 µL.
kloroform 200 µL dan digojok dengan tangan
Campuran didiamkan sampai larut,
selama 10 detik, inkubasi pada suhu kamar

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 727
dihomogenkan dan spin selama 10 detik, dalam 50 volt. Analisis kuantitatif dengan
tambahkan mineral oil 25 µL. Campuran menggunakan spektrofotometer UV pada λ 260 dan
dimasukkan dalam mesin PCR dan direaksikan 280 nm.
dengan kondisi denaturasi pada suhu 95 ºC Sekuensing Fragmen DNA
selama 1 menit, annealing pada suhu 52 ºC Sekuensing fragmen DNA menggunakan
selama 1 menit, polimerisasi pada suhu 72 ºC ABI PRISM 310 Instrument DNA Analyzer,
selama 2 menit masing-masing sebanyak 35 menggunakan Vector NTI (Invitrogen). Pencarian
siklus. Siklus terakhir diperpanjang pada suhu 72 homologi DNA dan protein homology
ºC selama 10 menit. menggunakan BLAST 2.0 dan GeneBank
Hasil amplifikasi dianalisis kualitatif database.
menggunakan elektroforesis gel agarose 1,5 %
HASIL DAN PEMBAHASAN
dalam 50 volt.
RNA total Melinjo diisolasi dari daun muda
Isolasi Fragmen RT-PCR
Melinjo menggunakan pereaksi Trizol kit.
Hasil elektroforesis menunjukkan lebih dari
Dipilihnya jaringan daun dikarenakan berdasarkan
satu fragmen maka fragmen dengan ukuran
informasi dari gen-gen sejenis pada Vitis vinifera
sesuai ukuran target diisolasi untuk selanjutnya di
ekspresi yang paling besar terdapat di daun
sekuensing. Fragmen DNA target pada gel
sehingga kebanyakan teknis RT-PCR
dipotong dengan scapel steril, dimasukkan ke
menggunakan sampel RNA daun. Prinsip isolasi
mikrotube, ditimbang. Ditambahkan buffer pelarut
total RNA dengan trizol sebenarnya seperti
gel sebanyak 3X volume gel (µL). Campuran
o
proses isolasi dengan menggunakan fenol-
kemudian diinkubasi pada waterbath 50 C
kloroform yang sudah biasa dipakai di
selama 10 menit dengan dibolak-balik setiap 3
laboratorium.
menit agar gel larut sempurna, inkubasi
Kuantifikasi RNA total dengan
dilanjutkan 5 menit lagi, tambahkan isopropanol
spektrofotometer menunjukkan ratio
sebanyak 1X volume gel. Larutan gel dimasukkan
OD260/OD280 antara 1,75. Hasil ini menunjukkan
ke dalam kolom ekstraski gel yang telah
bahwa tingkat kemurnian RNA total yang
dipasangkan pada wash tube, disentrifugasi pada
diperoleh terlalu tinggi dan terdapat
12.000 g selama 1 menit. Sisa ethidium bromide
terkontaminasi protein. Rasio OD260/280
dibuang, kolom dicuci dengan 600 μL wash buffer
diharapkan <1,60. Rendahnya angka hasil (yield)
yang mengandung etanol, sentrifugasi lagi pada
ini dapat disebabkan oleh kontaminasi fase air
12.000 g selama 1 menit, buang residu di wash
oleh fase organik, atau resuspensi yang kurang
tube, sentrifugasi lagi pada 15.000 g selama 2
sempurna pada pembentukan pellet RNA. Pellet
menit. Buang wash tube dan tempatkan kolom
RNA selanjutnya lebih spesifik disebut sebagai
pada recovery tube. Fragmen DNA dielusi dari
molekul mRNA. Hasil analisis kualitatif total RNA
kolom dengan memipetkan 50 μL elution buffer ke
dalam gel elektroforesis agarose 1% pada 100
bagian tengah kolom, diinkubasi selama 1 menit
volt ditunjukkan pada gambar 1.
pada suhu kamar, sentrifugasi pada 12.000 g
Proses RT-PCR dilakukan dengan dua
selama 1 menit untuk mengelusi DNA purified ke
tahap, tahap reverse transcription (RT)
recovery tube.
menghasilkan cDNA dan tahap PCR. Kelebihan
Hasil isolasi gel dianalisis kualitatif metode ini yaitu cDNA dari hasil RT dapat
menggunakan elektroforesis gel agarose 1,5 % digunakan untuk beberapa kali reaksi PCR.

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 728
Tahap RT dilakukan dengan menggunakan primer yang dapat langsung disekuensing. Hasil isolasi
oligoDT dan hexamer. Hal ini menjadikan hasil RT fragment DNA target ditunjukkan dalam gambar 3
merupakan koleksi lengkap cDNA mRNA yang Hasil menujukkan kemurnian tinggi fragmen
ada pada daun Gnetum gnemon yang terdiri tidak hasil isolasi yang ditunjukkan dengan fragmen
hanya oleh cDNA gen sts. tunggal. Fragmen DNA hasil isolasi selanjutnya
Pada tahap PCR dilakukan dengan disekuensing.
menggunakan primer hasil desain yaitu pasangan Sekuensing dilakukan dengan menggunakan
primer GGF2 dan GGR2. Konsentrasi primer yang metode Dye ddNTP terminator dengan
digunakan berkisar antara 10-30 pmol, dengan pemisahan fragmen menggunakan metode
panjang masing-masing primer adalah 20 capillary electrophoresis. Fragmen (hasil PCR
nukleotida. Panjang oligonukleotida yang dengan GGF2 dan GGR2) disekuensing dengan
digunakan sebagai primer umumnya 18-28 menggunakan primer GGF2, dan primer GGR2.
nukleotida dan mempunyai kandungan G + C Fragmen disekuensing dengan satu primer
sebesar 50-60% [4]. mengingat metode capilarry elektroforesis dapat
Hasil amplifikasi RT-PCR dengan pasangan mensekuen sampai 800 pb dalam sekali rekasi
primer GGF2 dan GGR2, selanjutnya di uji secara sehingga baik fragmen I (580 pb) masih dapat
kualitatif dengan melakukan elektroforesis pada disekuensing dalam sekali reaksi dengan satu
gel agarose 1,5% yang ditunjukkan dalam gambar primer.
2 Hasil pembacaan sekuensing untuk fragmen
Hasil elektroforesis RT-PCR menggunakan gen sts Gnetum gnemon ditunjukkan pada
primer GGF2 dengan GGR2 menunjukkan banyak gambar 4.
fragmen DNA yang muncul, dan tidak Untuk memastikan bahwa fragmen hasil
menghasilkan fragmen tunggal. Namun yang PCR merupakan bagian gen sts Gnetum gnemon
digunakan dalam DNA target yaitu fragmen maka dilakukan studi homologi fragmen hasil
tunggal pada kisaran 580 bp. Primer yang tersebut dengan urutan gen sts Arachis hypogaea
digunakan merupakan primer yang spesifik untuk L00952. Hasil alignment ditunjukkan pada gambar
amplifikasi gen sts. Namun pada beberapa kasus 4.
seringkali primer dapat mengamplifikasi fragmen Hasil sekuensing terhadap fragmen dengan
DNA, meskipun belum melekat secara sempurna primer GGF2 menghasilkan 270 pb. Aligment
pada cetakan target. Hal ini terjadi jika suhu urutan hasil sekuensing fragmen terhadap urutan
amplifikasi telah sesuai dengan suhu annealing nukeotida gen sts Arachis hypogaea L00952
primer. Oleh karena itu, langkah selanjutnya menunjukkan bahwa sekeunsing fragmen
adalah mengisolasi fragmen DNA target hasil mempunyai kemiripan dengan daerah depan gen
PCR untuk sekuensing. yang merupakan posisi target amplifikasi gen.
Isolasi fragmen hasil PCR menggunakan Untuk fragmen II didapatkan nilai homologi urutan
TM
PureLink Quick gel extraction kit. Hasil purifikasi yang mencapai 67% terhadap Vitis vinifera
divisualisasi dengan elektroforesis pada gel DQ459351. Berdasarkan data-data tersebut
agarose 1,5% untuk mengetahui kualitas DNA maka diyakini bahwa fragmen tersebut
murni yang dihasilkan dari isolasi fragmen RT- merupakan hasil amplifikasi RT-PCR total RNA
PCR, dan berdasarkan hasil elektroforesis Gnetum gnemon merupakan bagian gen sts dari
didapatkan fragmen tunggal untuk DNA target Gnetum gnemon dan sekuensing yang dihasilkan

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 729
merupakan bagian urutan gen sts Gnetum
[2] Gorham, J. 1995, The Biochemistry Of The
gnemon.
Stilbenoids, Chapman & Hall, London

[3] Iliya, I, Ali, Z, Tanaka, T, Iinuma, M, Furusawa,

KESIMPULAN M, Nakaya, K, Murata, J, Darnaedi,
Pasangan primer GGF2 (5’ D, Matsuura, N, dan Ubukata, M
,2003, Stilbene Derivatives from
AAGGGCATCAAGGAGTGGGG 3’) dengan Gnetum gnemon Linn.
GGR2 (5’ CACCAGGATGTGCGATCCAG 3’) Phytochemistry, 62: 601-606
dapat mengamplifikasi fragmen gen sts dengan [4] Gelfand, D.H, and White, T.J, 1990,
ukuran 580 pb. Thermostable DNA Polymerases. In:
innis, M. A., Gelfand,D.H., Sninsky
Urutan DNA Fragmen gen sts gnetum J.J, and White, T.J.(eds.). PCR
gnemon mempunyai kemiripan dengan urutan Protocols.a Guide to Methods and
Applications. Academic press. Inc.
DNA gen sts Vitis vinifera DQ459351 sebesar san diego.p.18.
67%.
Penelitian telah berhasil mendapatkan urutan
DNA fragmen gen sts Gnetum gnemon dengan
primer GGF2.

DAFTAR RUJUKAN
[1] Jang, M., Cai, L., Udeani, G. O., Slowing, K.
V., Thomas, C. F., Beecher, C. W.,
Fong H H. S., Farnsworth N R.,
Kinghorn A. D, Mehta R G., Moon
RC., Pezzuto JM. ,1997, Cancer
Chemopreventive Activity Of
Resveratrol, A Natural Product
Derived From Grapes. Science, 275
(5297), 218–220.

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 730
LAMPIRAN

Gambar 1. Elektroforesis gel agarose RNA total daun melinjo

Gambar 2. Hasil elektroforesis RT-PCR dengan primer GGF2 dan GGR2 (2), DNA marker (1). Semua
angka menunjukkan ukuran dalam bp.

Gambar 3. Hasil elektroforesis isolasi fragmen RT-PCR dengan primer GGF2 dan GGR2 (2), DNA
marker (1). Semua angka menunjukkan ukuran dalam bp.

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 731
TAAACAGGGGGCTCAAATCTTTTCTACCCTGAGGGCCCCAAATCATAAGATGCCTATGACATAACAACT
GCAAGTAGTTAGTAATCATGATAACCAATTGTCACCCTTAAACATGGATTTCTGGGTCGATGGTCTCTCT
CTTTTCTAGCCCTCCCGGGCCCCCCTTTTATTTGCCTTTGACATCTCCTCTTCTCCTCTTTAGTATCGTGA
TACCTAAATGGTTCATTCAACCTGCTCTATAACTTCATTTATAAACACTCTCTCATCCTT
Gambar 4. Urutan DNA hasil sekuensing fragmen GGF2

Homologi Fragmen
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment

L00952Arachis ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTCGCAAGGTTCAAAGGGCAGAAGGTCCAGCAACTGTATTG 60
FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis GCAATTGGAACAGCAAATCCACCGAACTGTATTGATCAGAGTACATATGCAGATTATTAT 120

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis TTTAGAGTAACCAATAGCGAACACATGACTGATCTCAAGAAGAAATTTCAGCGCATCTGT 180

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis GAGAGAACACAGATCAAGAACAGACATATGTACTTAACAGAAGAGATACTAAAAGAAAAT 240

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis CCTAACATGTGTGCATACAAGGCACCGTCATTGGATGCAAGAGAAGACATGATGATCAGG 300

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis GAGGTACCAAGAGTTGGAAAAGAGGCTGCAACCAAGGCCATCAAGGAATGGGGCCAGCCA 360

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis ATGTCTAAGATCACACATTTGATCTTCTGCACCACCAGCGGCGTTGCGTTGCCTGGCGTT 420

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis GATTACGAACTCATCGTACTTTTAGGGCTGGACCCATGCGTCAAGAGGTACATGATGTAC 480

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis CACCAAGGTTGCTTCGCTGGTGGCACTGTCCTTCGTTTGGCTAAGGACTTGGCTGAAAAC 540

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis AACAAGGATGCTCGTGTACTTATCGTTTGTTCTGAGAATACCGCAGTCACTTTCCGCGGT 600

FRAGMEN II --------------------------------TAAACAGGGGGCTCAAATCTTTTCTACC 28
* * * ** * **
L00952Arachis CCTAGTGAGACAGACATGGATAGTCTTGTAGGACAAGCATTGTTTGCCGATGGAGCTGCT 660
FRAGMEN II CTGAGGGCCCCAAATCATAAGATGCCTATGACATAACAACTGCAAGTAGTTAGTAATCAT 88
* ** * ** * * * * * * * ** * ** * * * * * *
L00952Arachis GCGATTATCATTGGTTCTGATCCTGTGCCAGAGGTTGAGAAGCCTATCTTTGAGCTTGTT 720
FRAGMEN II G-----ATAACCAATTGTCACCCTTAAACATGGATTTCTGGGTCGATGGTCTCTCTCTTT 143
* ** * ** * * *** ** * ** * * ** * ** **
L00952Arachis TCGACCGATCAAAAACTTGTCCCTGGCAGCCATGGAGCCATCGGTGGTCTCCTTCGTGAA 780
FRAGMEN II TCTAGCCCTCCCGGGCCCCCCTTTTATTTGCCTTTGACATCTCCTCTTCTCCTCTTTAGT 203
** * * ** * * * * * * * ****** *
L00952Arachis GTTGGACTTACATTCTATCTTAACAAGAGTGTTCCTGATATTATTTCGCAAAATATCAAT 840
FRAGMEN II ATCGTGATACCTAAATGGTTCATTCAACCTGCTCTATAACTTCATTTATAAACACTCTCT 263
* * * * * * * * ** ** * ** ** *** ** *
L00952Arachis GACGCGCTCAATAAAGCTTTTGATCCATTGGGTATTTCTGATTATAACTCAATATTTTGG 900
FRAGMEN II CATCCTT----------------------------------------------------- 270
* *
L00952Arachis ATTGCACATCCTGGTGGGCGTGCAATTTTGGACCAGGTTGAACAGAAGGTGAACTTGAAG 960
FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis CCAGAGAAGATGAAAGCCACTAGAGATGTGCTTAGCAATTATGGTAACATGTCAAGTGCC 1020

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis TGTGTGTTCTTCATTATGGATTTGATGAGGAAGAGGTCTCTTGAAGAAGGACTTAAAACT 1080

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis ACCGGAGAAGGACTTGATTGGGGTGTGCTTTTTGGCTTTGGTCCTGGTCTCACTATTGAA 1140

FRAGMEN II ------------------------------------------------------------

L00952Arachis ACTGTCGTTCTCCGCAGTGTGGCCATATAA 1170

FRAGMEN II ------------------------------
Gambar 5. Hasil alignment (perbandingan urutan) DNA fragmen hasil RT-PCR dengan gen sts
Arachis hypogaea L00952.

Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia III (SN-KPK III)……………………………………………….. 732