Cara dan Proses Produksi Iturin A

1. Pemilihan Strain
Bacillus Subtilis RB14-CS, yang merupakan mutan spontan yang diturunkan dari RB14-C dan
dipilih berdasarkan perubahan morfologi RB14-C dalam formasi koloni, adalah produsen
tunggal iturin A dan produsen non-surfactin. Bacillus Subtilis RB14-C adalah mutan resistan
streptomycin yang berasal dari strain RB-14 dan merupakan sebuah koprodusen antibiotic
iturin A dan surfactin.

2. Media yabg digunakan

Medium L yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri mengandung 10 gr Polipepton, 5 gr
ekstrak ragi dan 5 gr NaCl. Sebanyak 1 ml medium L setelah 24 jam mengalami kultivasi pada
30oC, akan diinokulasi ke dalam 100 ml medium nomor 3S yang mengandung 30 gr
polipepton S, 10 gr glukosa, 1 gr KH2PO4, 0.5 gr MgSO4.7H2O (pH 6,8), dan diinkubasi pada
120 stroke per menit (spm) dan suhu 30oC selama 24 jam di dalam labu yang digoyangkan.
Medium ini akan digunakan sebagai biji untuk fermentasi keadaan padat.

3. Fermentasi keadaan padat

Okara yang merupakan produk samping pembuatan tahu, dibagi menjadi potongan-
potongan kecil sebanyak 150-200 gr, dibungkus dengan selembar film pembungkus
komersial dan dibekukan pada -15oC. Sebanyak 15 gr okara cair dimasukkan ke dalam 100 ml
labu berbentuk kerucut dan diautoklaf sebanyak dua kali pada 120oC selama 20 menit
dengan interval 8-12 jam. Hal ini bertujuan untuk membunuh mikroorganisme pembentuk
spora yang berada dalam okara. Setelah didinginkan sampai temperatur ruang, setiap 15 gr
okara ditambahkan larutan suplemen nutrisi yang memiliki kandungan kelembapan 79% dan
terdiri dari 833 µl dari 0.45 gr glukosa/ml, 75 µl dari 1 M KH2PO4, 150 µl dari 1 M
MgSO4.7H2O dan 367 µl air distilasi deionisasi. Kemudian, 3 ml kultur RB14-CS dalam
medium nomor 3S ditambahkan ke dalam 15 gr okara dan dicampurkan dengan spatula
stainless steel. Semua labu diikubasi dalam inkubator air pada 25oC dan pada waktu
tertentu, satu labu diambil dan semua okara dalam labudigunakan untuk analisis sampel.

4. Ekstraksi dan Kuantifikasi Iturin A

Untuk mengektraksi iturin A, sebanyak 45 ml methanol ditambahkan ke dalam produk
fermentasi dalam labu dan campuran digoyangkan pada 150 spm selama 1 jam. Ekstrak
methanol yang didapatkan kemudian disentrifugasi pada 18000xg pada 4oC selama 10 menit
dan difiltrasi melalui membran politetrafloroetilen dengan pori-pori sebesar 0,2 µm. Filtrat
kemudian diinjeksikan ke dalam high-performance liquid chromatography (HPLC) untuk
mengukur konsentrasi iturin A.