Laporan Praktikum

Rekayasa Genetika Mikroba

BM-3106

DESAIN PRIMER, PCR, DAN ELEKTROFORESIS GEL

AGAROSA UNTUK MENGETAHUI KEBERHASILAN
TRANSFORMASI PLASMID pET TERLIGASI GEN phoR
PADA Escherichia coli

Nama : Ulya Alviredieta

NIM : 10413012

Tanggal Percobaan : 22 Oktober 2015

Tanggal Pengumpulan : 28 Oktober 2015

Nama Asisten :

NIM Asisten :

PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2015
I. Tujuan
1. Mendesain primer yang tepat bagi bagi proses amplifikasi
2. Mengamplifikasi gen phoR terligasi dalam plasmid vektor ekspresi pET dengan
PCR koloni.
3. Menentukan hasil amplifikasi gen phoR pada Escherichia coli tertransformasi
dengan elektroforesis gel agarosa.
4. Membuat stok kultur Escherichia coli BL21 tertransformasi.

II. Teori Dasar

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah metode yang pertama kali dikembangkan
untuk memperbanyak DNA dengan cepat (Muladno, 2010). PCR berdasar pada tiga tahap
dasar: denaturasi dsDNA menjadi ssDNA, penempelan primer pada ssDNA, dan
pemanjangan atau sintesis DNA baru. Karena berlangsung di luar sel, seluruh proses tersebut
memanfaatkan sifat DNA yang dipengaruhi oleh kondisi fisika-kimia tertentu, misalnya suhu
dan pH.
Tahap denaturasi DNA merupakan tahap pemutusan ikatan hidrogen antaruntai DNA
dobel heliks sehingga terbentuk dua molekul untai tunggal DNA dari satu molekul untai
ganda DNA. Proses ini dilakukan dengan meningkatkan suhu pada nilai 90°C-97°C sehingga
ketidakteraturan molekul meningkat dan ikatan hidrogen terputus (Muladno, 2010).
Tahap selanjutnya adalah penempelan primer. Primer merupakan molekul
oligonukleotida, umumnya berukuran kurang dari 30bp. Terdapat dua jenis primer: primer
forward dan primer reverse. Primer forward merupakan primer yang dibuat dari untai DNA
sense dan akan menempel pada untai DNA antisense sedangkan primer reverse merupakan
primer yang dibuat dari untai DNA antisense dan akan menempel pada untai DNA sense.
Primer biasanya dibuat dari bagian sekuens lestari atau bagian awal/akhir DNA yang hendak
diamplifikasi. Penempelan primer pada untai tunggal DNA terjadi pada suhu moderat,
berkisar antara 50-55°C melalui interaksi hidrogen dengan basa nitrogen untai DNA
(Muladno, 2010).
Suatu primer yang baik harus memiliki sisi penempelan spesifik sehingga bagian DNA
yang teramplifikasi benar-benar bagian DNA yang ingin diperbanyak. Beberapa primer
umum, yaitu primer yang dibuat dengan urutan nukleotida acak, dapat menempel pada lokasi
yang tidak diinginkan sehingga bagian DNA yang teramplifikasi tidak sesuai dengan target
yang diinginkan. Agar primer spesifik yang baik dapat dibuat, urutan nukleotida gen yang
diinginkan harus diketahui. Hal ini dapat dilakukan dengan metode sekuensing atau dengan
mencari sekuens nukleotida gen tertentu yang ditarget pada database, misalnya GenBank
NCBI (sitasi). Setelah sekuens nukleotida gen yang ditarget diketahui, perancangan primer
dilakukan dengan menggunakan program daring seperti Primer3Plus dan NCBI Primer
Design Tool (sitasi). Program akan merancang beberapa primer sesuai dengan sekuens
nukleotida yang diinputkan. Syarat-syarat primer yang baik adalah sebagai berikut.

Setelah penempelan primer, mesin PCR akan menaikkan suhu hingga 70-75°C. Pada
suhu ini, enzim Taq polimerase, enzim termostabil yang diisolasi dari termofil Thermus
aquaticus akan memiliki aktivitas optimal. Ketika mendeteksi keberadaan incomplete strand
akibat penempelan untai DNA templat dan primer, enzim Taq polimerase akan
memperpanjang primer menurut templat sehingga dibentuk untai DNA baru komplemen
dengan templat. Tahap ini dikenal sebagai tahap pemanjangan (Muladno, 2010).
Dari satu molekul dsDNA sampel, akan dihasilkan 2 molekul dsDNA baru pada akhir
siklus. Agar jumlah dsDNA yang dihasilkan lebih banyak, siklus diulang 30 hingga 40 kali,
bergantung pada kualitas master mix PCR. Master mic adalah komponen reaksi PCR yang
berisi enzim polimerase, dNTP sebagai bahan baku pemanjangan DNA, buffer yang menjaga
pH reaksi agar DNA tidak terdenaturasi secara permanen saat mengalami kontak dengan
lingkungan, MgCl2 yang menyuplai ion Mg2+ sebagai kofaktor enzim polimerase, dan, pada
beberapa jenis, pewarna (Muladno, 2010).

III. Bahan, dan Cara Kerja

Bahan
1. 5µL plasmid DNA hasil isolasi

2. 2µL 10X Fast Digest

Berfungsi sebagai buffer yang menjaga pH reaksi tetap berada pada kondisi optimal
bagi enzim sehingga aktivitas enzim mencapai 100%. Fast Digest juga membantu
enzim (dalam hal ini EcoRI dan KpnI) untuk bekerja secara beriringan dalam proses
restriksi, meminimalisasi terjadinya aktivitas bintang (star activity) bahkan
pascainkubasi jangka panjang (Thermoscientific, 2011).

3. 1µL enzim restriksi KpnI

Berfungsi untuk memotong gen phoR pada sisi restriksi 5’-GGTACC-3’.

4. 1µL enzim restriksi EcoRI

Berfungsi untuk memotong gen phoR pada sisi restriksi 5’-GAATTC-3’.

5. Loading Dye
Terdiri atas pewarna bromfenol biru dan gliserin. Pewarna bromfenol biru pada
loading dye akan berikatan dengan DNA dan menjadikannya berwarna biru sehingga
progress elektroforesis dapat diamati. Gliserin berfungi sebagai pemberat yang
mencegah sampel DNA keluar dari sumur sehingga analisis menjadi kurang akurat
(Muladno, 2010).

6. Ethidium Bromida (EtBr)

Merupakan senyawa karsinogenik yang dapat berinterkalasi dengan DNA. Zat ini
dapat mengalami eksitasi elektron saat dipaparkan pada sinar UV sehingga mengalami
fluoresensi, menyebabkan DNA yang terinterkaslasi dengannya dapat teramati. EtBr
digunakan untuk memvisualisasi hasil elektroforesis sehingga ukuran duatu fragmen
DNA dapat diketahui (Muladno, 2010).

7. Extraction Buffer
Setelah proses elektroforesis selesai dilakukan, gel mengandung DNA target
berukuran tertentu dicuplik. Extraction buffer mampu mencairkan gel agarosa yang
 menjebak DNA tanpa mendenaturasi atau mendegradasi DNA sehingga DNA dapat
lolos untuk dipurifikasi.

8. Etanol 96%
Berfungsi untuk memurnikan DNA sehingga tidak ada kontaminan menempel pada
DNA dan kontaminan dapat disingkirkan dengan teknik sentrifugasi.

9. Prewash dan Wash Buffer

Berfungsi mengeliminasi kontaminan dari DNA dan mencuci membran silika
sehingga proses purifikasi berjalan optimal.

10. Elution Buffer

Berfungsi untuk melarutkan DNA dengan tingkat efektivitas mendekati 100%.

Cara Kerja
Masing-masing 5µL plasmid DNA yang sudah diisolasi pada praktikum sebelumnya
dimasukkan ke dua buah mikrotub berbeda ukuran 1,5mL. Setiap larutan plasmid ditambah
11µL deion, 2µL larutan FastDigest, dan diberi label (+) untuk larutan dengan perlakuan
enzim serta label (-) untuk larutan tanpa perlakuan enzim. Larutan (-) adalah kontrol negatif.
1µL enzim restriksi EcoRI, dan 1µL enzim KpnI dicampurkan dalam larutan berlabel (+).
Baik campuran berlabel (+) dan (-) di-quick spin dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 5
menit menggunakan mesin PCR untuk homogenisasi. Campuran kemudian diinkubasi pada
suhu 80°C selama 5 menit agar enzim restriksi terinaktivasi sehingga aktivitas bintang dan
overdigest dapat dihindari. Sampel DNA yang didapat diambil 25µL dan dicampur dengan
loading dye dan dielektroforesis dalam gel agarosa terendam TAE 1X selama 30 menit.
Setelah proses elektroforesis selesai, gel dicelupkan ke larutan ethidium bromida selama 10
menit, dibilas dengan akuades, dan divisualisasi dengan UV iluminator. Purifikasi dilakukan
oleh asisten.

IV. Hasil Pengamatan

V. Pembahasan
 Plasmid yang digunakan dalam praktikum adalah plasmid pJET1.2 yang berukuran
2974bp dan berbentuk sirkuler. Plasmid ini merupakan vektor kloning positif dengan lethal
insert yang memungkinkan pemulihan secara efisien produk PCR blunt-ended (Snap Gene,
2015).

Di dalamnya terkandung elemen rep (pMB1) yang merupakan replikon, berfungsi dalam
replikasi plasmid. Elemen ini terletak pada 1762-1148bp. Replication start berfungsi dalam
inisiasi replikasi, terletak pada 1162±1bp. Bla (AmpR) merupakan gen β-lactamase yang
menentukan resistensi terhadap ampisilin. Gen ini berfungsi dalam seleksi dan kontrol sel
rekombinan. Pada tahap insersi gen asing ke dalam plasmid, ketika tidak ada insersi berupa
gen masuk, plasmid akan mengalami resirkularisasi sehingga gen letal terekspresikan dan
bakteri mati. Akibatnya, hanya bakteri dengan gen tersisip yang dapat tumbuh sehingga
screening tidak perlu dilakukan. eco47IR merupakan gen letal yang berfungsi sebagai seleksi
positif. PlacUV5 merupakan promoter termodifikasi yang bertanggung jawab pada ekspresi gen
letal sehingga memungkinkan terjadinya ekspresi gen letal. T7 promoter bertanggung jawab
pada transkripsi in vitro kloning sisipan. MCS (Multiple Cloning Sites) berfungsi dalam
mapping, clonning, dan excision kloning tersisip. Selain itu, terdapat pula sisi insersi yang
berupa ujung blunt serta primer binding sites (BIORAD, 2015; Tamar, 2015). Plasmid
pJET1.2 dapat menerima insersi berukuran 6bp-10kb.
Enzim restriksi yang digunakan adalah EcoRI dan KpnI, keduanya termasuk enzim
restriksi tipe 2 yang mengenali DNA palindrom, berikatan secara spesifik pada sekuens
tertentu pada DNA, dan memotong sekuens spesifik di tempatnya berikatan (Muladno, 2010).
Keduanya memotong DNA dan menghasilkan ujung lengket (sticky end) (Muladno, 2010).

Gambar 1
Sisi Pemotongan Enzim Restriksi EcoRI
(Muladno, 2010)

Gambar 2
Sisi Pemotongan Enzim Restriksi KpnI
(Thermo Scientific, 2011)

Sejatinya, gen phoR tidak memiliki sisi restriksi enzim EcoRI dan KpnI (Snap Gene, 2015).
Namun, sisi ini ditambahkan saat gen diamplifikasi, diletakkan setelah primer, agar gen dapat
diinsersi ke plasmid kloning pET. Sisi restriksi ditambahkan seperti pada gambar berikut.

5’ ’3
3’
Kpn1 phoR EcoR1 ’5

Gambar 3
Sisi Restriksi dan Gen phoR

Tidak terdapatnya pita elektroforesis pada campuran (+) dan (-) dapat disebabkan oleh
dua hal: kontaminasi nuklease selama proses pengerjaan, kesalahan reagen, atau kesalahan
elektroforesis. Kontaminasi nuklease akibat kurang sterilnya peralatan isolasi dari enzim
nuklease menyebabkan enzim mengontaminasi isolat, memotong-motong, dan mendegradasi
DNA (Muladno, 2010; Dube, 2015). Kesalahan prosedural pada proses elektroforesis dapat
disebabkan oleh kurangnya jumlah isolat DNA yang dimasukkan dalam agar. Masalah ini
dapat diatasi dengan menambah konsentrasi DNA yang dimasukkan ke dalam agar tetapi
tidak lebih dari 50ng/band. Ketidaktampakkan pita DNA pada gel juga dapat disebabkan oleh
kondisi elektroforesis yang tidak sesuai berupa waktu elektroforesis yang terlalu lama,
voltase yang terlalu tinggi, dan presentase gel yang tidak tepat. Hal ini dapat diatasi dengan
mengurangi waktu elektroforesis, mengurangi voltase elektroforesis, dan menambah
presentase gel elektroforesis. Selain itu, kurangnya jumlah pewarna yang digunakan untuk
memvisualisasi DNA isolat dan penggunaan sumber cahaya yang tidak tepat. Masalah ini
dapat diatasi dengan penambahan etidium bromida pada saat pewarnaan dan penggunaan
sumber cahaya yang lebih aman. Lampu W merupakan sumber cahaya elektroforesis yang
dapat mengurangi resiko degradasi DNA. Panjang gelombang 254nm – 312nm dapat
digunakan dalam memvisualisasi DNA (Dube, 2015). Kesalahan reagen dapat disebabkan
oleh beberapa hal berikut.
a. Enzim telah kadaluwarsa
 Enzim merupakan protein yang memiliki masa kadaluwarsa. Apabila telah lewat,
aktivitas enzim dapat hilang 100%.
b. Penyimpanan jangka panjang enzim tidak dilakukan sesuai prosedur.
Penyimpanan enzim pada temperatur lebih dari -20°C menyebabkan enzim tidak
benar-benar terinaktivasi. Selain itu, penyimpanan pada temperatur .di atas -20°C untuk
waktu lama tidak menginaktivasi kontaminan seperti protease. Penyimpanan enzim
pada temperatur di bawah -35°C dapat menyebabkan enzim membeku. Hal ini dapat
merusak aktivitas enzim (NEB, 2015).
c. Dilusi enzim yang salah
Dilusi enzim sebaiknya dilakukan dengan Dillution Buffer sehingga enzim bisa
bertahan hingga 3-4 minggu. Dilusi dengan air atau Reaction Buffer akan merusak
enzim (Fermentas, 2015).
Karena hasil elektroforesis tidak tampak pada semua well, dapat disimpulkan bahwa
kesalahan terjadi pada proses elektroforesis dan atau kesalahan reagen.
Purifikasi merupakan proses yang dilakukan setelah fragmen gen yang diinginkan
diperoleh melalui proses restriksi dan pengecekan elektroforesis. Purifikasi dilakukan dengan
mencuplik agar yang mengandung DNA target setelah elektroforesis. DNA ditempatkan
dalam GeneJET Gel Extraction and Cleanup Microkit yang terusun atas mikrokolom dan
tabung penampung. DNA yang masih terjebak dalam agarosa tersebut diloloskan dengan
Extraction Buffer yang dapat mencairkan agarosa sehingga DNA target lolos. DNA target
selanjutnya dipurifikasi dengan Prewash dan Wash Buffer untuk mengeliminasi gel dan
kontaminan, kemudian disentrifugasi. Sentrifugasi dengan kecepatan 14000g selama 30-60
detik akan meloloskan kontaminan dari DNA yang berikatan dengan membran silika. Setelah
murni, DNA dilarutkan dengan Elution Buffer.

VI. Kesimpulan
1. Tidak diketahui apakah gen phoR dari plasmid pJET1.2 dapat terestriksi.
2. Ukuran gen phoR tidak dapat ditentukan.

VII. Dartar Pustaka

BIORAD. 2015. Map and Features of pJET1.2/blunt Clonning Vector. [Online]
http://www.bioinfo.pte.hu/f2/pict_f2/pJETmap.pdf, diakses tanggal 20 September
2015
Fermentas. 2015. Troubleshooting Guide for DNA Digestion. [Online]
http://www.level.com.tw/html/ezcatfiles/vipweb20/img/img/34351/DNADigestion.
pdf, diakses tanggal 4 Oktober 2015.
Griffiths, A.J.F., Miller, J.H., dan Suzuki, D.T. 2000. An Introduction to Genetic
Analysis, 7th Ed. New York: W.H. Freeman and Companies.
Kotrla, T. 2007. Restriction Enzymes Activity. [Online]
http://www.austincc.edu/mlt/mdtech/restriction_enzymes_activity.pdf, diakses
tanggal 29 September 2015.
NEB. 2015. Delivery Conditions and Storage of NEB Products. [Online]
http://www.neb.uk.com/customerService/delivery_conditions.asp, diakses tanggal
4 Oktober 2015.
Snap Gene. 2015. pJET1.2. [Online]
http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pJET1.2/
, diakses tanggal 20 September 2015
Tamar. 2015. Clonejet(TM) PCR Clonning Kits. [Online]
http://www.tamar.co.il/PDFs/Thermo-Genomics/Protocol_k1231.pdf, diakses
tanggal 20 September 2015
Thermo Scientific. 2011. Product Information: Thermo Scientific FastDigest KpnI.
[Online] http://58.68.249.183/files/prod/manuals/201210/11/449940001.pdf,
diakses tanggal 2 Oktober 2015.
Thermo Scientific. 2012. Product Information: GeneJET Gel Extraction and Cleanup
Microkit. [Online]
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012670_GeneJET_Gel_
Extraction_DNA_Cleanup_Micro_UG.pdf, diakses tanggal 29 September 2015.