TUGAS RESUME

BIOTEKNOLOGI FARMASI

NAMA : MOH.AQIB

NIM : G 701 16 071

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM

UNIVERSITAS TADULAKO

PALU

2018
 SCREENING DAN ISOLASI MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIKA
Screening adalah sejenis tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi
spesifik atau mikroorganisme dalam sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif
mudah dan tidak mahal (peralatan yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Beberapa tes
skrining masih dapat dilanjutkan dengan tes lain yang lebih spesifik. (Singleton,
2001).

Metode Screening Untuk Berbagai Macam Asal Mikroba Penghasil Antibiotik

1.`Screening Metabolit Sekunder (Antibiotik) Oleh Isolat Jamur Endofit
(Margino,2008)
a. Tahap Persiapan
Ranting tanaman dipotong sepanjang 1 cm. Untuk mensterilkan
permukaan, potongan ranting direndam di dalam larutanByclean atau Chlorox 5
% selama 5 menit, diikuti dengan perendaman dalam air steril selama 2 menit,
entanol 70% selama 1 menit, dan air steril selama 2 menit. Potongan yang telah
disterilkan dihilangkan ekses airnya dan selanjutnya dibelah menbujur menjadi
2 bagian. Inokulasi dilakukan dengan cara meletakkan permukaan belahan pada
permukaan medium CMM (corn meal malt extract) agar untuk isolasi fungi
atau Nutrien agar untuk isolasi bakteri. Inkubasi dilakukan selama 4-7 hari.
Koloni mikrobia diisolasi dengan ose, selanjutnya isolat fungi dipelihara pada
medium PDA miring dan isolat bakteri dipelihara pada Nutrien agar miring
sebagai kultur stok murni (Bacon, 1988; Margino, 1997).
b. Tahap Screening
Langkah pertama seleksi dilakukan dengan teknik “paper disc diffusion
technique”, yakni dengan jalan mencelupkan paper disc ke dalam supernatan
dan hindarkan ekses air. Paper disc yang sudah bebas ekses air diletakan pada
medium yang mengandung mikrobia indikator Bacillus subtilis, Candida
albicans, dan Fusarium oxysporum f.sp. licopersicae dan diinkubasi pada suhu
kamar, selama 2 hari. Terbentuknya zona jernih di sekitar paper
 disc menggambarkan adanya aktivitas penghambatan oleh senyawa
antimikrobia (antibiotik) terhadap mikroba indikator. Seleksi isolat dilakukan
dengan mengkompilasi hasil uji ini. Isolat yang memiliki nilai rasio lebih besar
4 menjadi kandidat isolat unggul.

2. Isolasi Dan Penapisan Aktinomisetes Laut Penghasil Antimikroba (antibiotik)

a. Tahap Persiapan
Lima gram tiap sediment laut diambil pada kedalaman rata-rata 20-50cm.
Masing-masing sampel ditempatkan pada falcon tube 15mL dan ditutup rapat.
Sampel disimpan dalam ruang dingin sebelum dilakukan proses isolasi.
Sebanyak 1 gram padatan sampel dipisahkan air lautnya dengan cara
didekantir. Empat mililiter air steril ditambahkan ke dalam sampel tersebut dan
diaduk selama 10 menit dan didiamkan sampai suspensi mengendap. Sebanyak
1 ml cairan sampel diambil dan diencerkan dengan air steril sebanyak 4 mL.
Proses pretreatment dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan cara asam dan
pemanasan. Pretreatment dengan cara asam dilakukan dengan penambahan
asam klorida sampai pH 2 dan didiamkan selama 2 jam. Pretreatment dengan
cara panas dilakukan mengacu pada metode Pisano et al. (1986) yang
dimodifikasi, yaitu dengan memanaskan cairan sampel pada suhu 650C selama
60 menit.
Cairan sampel yang telah ditreatment selanjutnya diencerkan secara seri
dari 10-1 sampai dengan 10-5. Selanjutnya 0.1 ml sampel yang telah diencerkan,
di-sebarkan pada permukaan agar media isolasi. Komposisi media agar untuk
isolasi adalah sebagai berikut; 10 gr soluble starch, 2 gr pepton, 4 gr yeast
ekstrak, 16 gr agar dalam 1000 mL air laut. Medium tersebut ditambahkan juga
beberapa antibiotik 100 µgr/ml cy-cloheximide, 25 µgr/ml nistatin, 100 µgr/ml
nalidic acid, dan 5 µgr/ml rifampin. Antibiotik ditambahkan setelah medium
agar disterilisasi.
 Inkubasi dilakukan pada suhu 300 C dalam inkubator. Koloni
aktinomisetes yang tumbuh dipisahkan dan dipindahkan ke dalam medium agar
yang baru dengan menggunakan marine agar. Pemindahan dilakukan sampai
diperoleh koloni tunggal
Koloni aktinomycetes yang telah dimurnikan lalu ditumbuhkan pada
medium broth YEME selama 2 hari, dan ditransfer ke medium fermentasi
dengan komposisi medium Bacto peptone 15 gr/L, yeast extract 3 gr/L, Fe
citrate n H2O 0,3 gr/L, demin water 250mL, dan air laut 750mL. Fermentasi
dilakukan selama 5 hari dengan inkubasi pada suhu 300C. Broth fermentasi
dikeringkan dengan freeze drying dan diekstraksi dengan metanol. Ekstrak
dalam metanol siap diuji aktivitasnya.
b. Tahap Screening
Tahapan penapisan(screening) aktinomisetes penghasil anti-mikroba
dilakukan dengan uji antibakteri dan antijamur dengan metode kertas cakram.
Mikroba uji yang biasa digunakan untuk mengetahui keefektifitasan
actinomycetes adalah Eschereschia coli,Streptococcus aereus, Pseudomonas
aeroginosa, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, dan Candida
albican. Eschereschia coli,Streptococcus aereus, Pseudomonas aeroginosa,
Bacillus subtilis ditumbuhkan pada media nutrien agar dan Aspergillus
niger, dan Candida albican ditumbuhkan pada Potato Dextrose Agar.
Keduanya dilakukan dengan metode pour plate methods.
Setelah itu, Sebanyak 15 µL ekstrak sampel diteteskan dalam kertas
cakram berukuran 6 mm, kemudian dikeringkan. Selanjutnya diletakkan pada
permukaan agar yang telah diinokulasikan mikroba uji. Inkubasi dilakukan
pada suhu 300 C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk yang
menunjukkan aktivitas antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan
mikroba uji diukur diameternya. Setelah terbentuknya zona bening lalu
ditentukan Minimum Inhibition Concentration.
 Minimum Inhibition Concentration (MIC) ditentukan dengan cara
melarutkan ekstrak broth pada berbagai konsentrasi yaitu dari konsentrasi
10.000 µg/ml sampai dengan 100 µg/ml. Masing-masing konsentrasi diuji
aktivitas antibakterinya menggunakan metode difusi agar. Diameter kertas
cakram yang digunakan adalah 6 mm. Zona bening yang terbentuk diukur
diameternya. Selanjutnya dibuat kurva Log [C] (kon-sentrasi) sebagai sumbu Y
melawan X2 (diameter zona bening) sebagai sumbu X. Titik potong sumbu Y
pada X=0 merupakan nilai Log MIC. Metode penentuan MIC ini mengikuti
Bonev et al., 2008 yang dimodifikasi.

3. Metode Screening Bakteri Yang Berasosiasi Dengan Spons Jenis Aplysina

sp (Devin et al, 2012)
a. Tahap persiapan
Spons dimasukan kedalam kantong plastik steril kemudian disimpan di
dalam ice box dan dibawa ke laboratorium. Bakteri yang terdapat pada sampel
spons diinokulasi pada media NA dengan metode agar tuang (Lay,1994).
Sampel spons dihaluskan dengan menggunakan blender, kemudian diambil
sebanyak 1 gr dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air laut.
Dilakukan pengenceran hingga konsentrasi menjadi 10-6, Kemudian sampel
diinokulasi dengan metode agar tuang, diambil sebanyak 1 ml untuk diinokulasi
pada media NA dalam cawan petri 15 ml secara aseptik kemudian diinkubasi
pada suhu 370C di dalam inkubator selama 2 x 24 jam. Setelah itu isolat
dimurnikan yang bertujuan untuk memisahkan hasil inokulasi yang terdiri dari
banyak koloni bakteri yang berlainan jenis sehingga didapat koloni bakteri
murni pada setiap biakan bakteri. Koloni bakteri yang diambil untuk
dimurnikan adalah koloni yang dominan. Pemurnian dilakukan dengan
menggunakan metode streak. Setelah itu dilakukan inokulasi bakteri uji dan
bakteri yang akan diuji pada media NB sehingga diperoleh suspensi bakteri uji
dan suspensi bakteri yang akan diuji (Nofiani et al. 2009).
 b. Tahap screening
Bakteri uji yang digunakan harus mewakili bakteri gram positif dan gram
negatif. Suspensi bakteri uji diambil sebanyak 200 μl dan dimasukan kedalam
15 ml NA yang mulai mendingin namun masih cair kemudian dikocok hingga
merata dan dituangkan ke cawan petri kemudian dibiarkan hingga membeku.
Setelah membeku letakkan kertas cakram yang telah dibasahi dengan suspensi
bakteri spons yang akan diuji kemudian diinkubasi selama 24 jam, setelah
diinkubasi dilihat apakah terdapat zona bening disekitar koloni bakteri yang
diuji yang tumbuh disekitar kertas cakram. Jika terdapat zona bening maka
bakteri tersebut menghasilkan senyawa bioaktif sebagai antibakteri (Nofiani et
al. 2009).

4. Metode Screening Kapang Endofit Dari Tumbuhan Berkasiat Obat Yang

Berpotensi Sebagai Antibiotik Untuk E.Coli Dan Staphylococcus aureus
(Melliawati dan Harni, 2009)
Kapang endofit yang digunakan berasal dari tumbuhan berkhasiat obat
Seleksi kapang endofit penghasil senyawa antibakteri dilakukan dengan metode
difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method). Bakteri uji sebanyak 1 mL
diinokulasikan ke dalam cawan Petri dan tambahkan medium Nutrient agar cair
yang tidak terlalu panas sebanyak 15 ml kemudian dihomogenkan dengan cara
digoyang dan dibiarkan sampai dingin. Setelah medium padat, potongan kapang
endofit (berdiameter 6 mm) yang akan diseleksi ditempelkan diatas permukaan
medium, selanjutnya diinkubasikan selama 2-3 hari pada suhu kamar (28- 300C).
Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter zona hambat di sekitar kapang
endofit . Luas zona hambat dihitung dengan rumus dalam Sukaraet al., (1992).
5. Metode Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. Sebagai
Penghasil Senyawa Antimikroba (Abubakar et al, 2011)
a. Tahap Persiapan
Spons Jaspis sp. diambil menggunakan pisau steril dengan ukuran
panjang sampel 5–10 cm Sampel kemudian dimasukkan ke dalam plastik
sampel (Whirl-Pak, Nasco, USA) yang telah diisi oksigen murni, selanjutnya
ditempatkan dalam cool box untuk analisis di Laboratorium. Setelah itu
dilakukan Isolasi bakteri dari sampel spons tersebut. Permukaan sampel spons
disemprot air laut steril dengan perbandingan ukuran spons 1 cm2 : 5 ml air laut
steril, sehingga hanya bakteri dengan daya gabung yang kuat saja yang akan
tersampling. Bagian mesohil diambil dengan ukuran + 1x1 cm, digerus dan
diencerkan dengan Phospat Buffer Saline (PBS) steril dengan perbandingan 1:1
(Kim et al., 2006). Isolasi bakteri dari permukaan luar menggunakan swab
steril (Wahl et al., 1994), yang diusapkan dengan satu arah pada permukaan
luar spons. Swab steril yang telah diusapkan pada permukaan sampel
dimasukkan ke dalam tabung pengenceran yang berisi PBS steril dan divorteks
. Hasil pengenceran disebar ke dalam cawan petri yang telah berisi media Sea
Water Complit (SWC) dengan komposisi 1 liter media terdiri dari 5
gr/l bacto pepton, 1 gr/l yeast extract dan 3 ml/lglycerol, dan diinkubasi pada
suhu 26oC selama 24-36 jam dan diamati pertumbuhan koloni bakterinya.
Setiap koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna, ukuran dan
bentuk koloni, serta dimurnikan dengan menggunakan media yang sama.
b. Tahap Screening
Screening dilaksanakan dengan pengujian aktivitas antagonis terhadap
bakteri dan khamir patogen dilakukan secara kualitatif modifikasi Marinho et
al., 2009, dengan menggores Isolat pada permukaan media yang telah disebar
dengan bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan terdiri dari bakteri gram negatif
yaitu Escherichia coli, Pseudomonas aerogenosa patogen manusia serta
bakteri Gram positif yaitu Staphylococcus aureus patogen dan S. aureus.
Penguiian aktivitas antikhamir menggunakan khamir uji Candida albicans yang
ditumbuhkan pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Aktivitas antagonis
terhadap bakteri dan khamir diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih
disekitar koloni isolat murni.
 TEKNOLOGI FERMENTASI DALAM UPAYA MEMPRODUKSI
ANTIBIOTIKA MENGGUNAKAN ISOLAT TERPILIH

Proses fermentasi kehidupan mikroorganisme berperan sangat besar terhadap

produksi antibiotika. Siklus pertumbuhan mikroorganisme meliputi fase lag, fase
logaritmik, fase stasioner dan fase kematian. Anah dkk. (1991) mengemukakan bahwa
antibiotik merupakan metabolit sekunder dan dihasilkan pada akhir fase logaritmik
sebelum fase stasioner; sedangkan menurut Jack dkk. (1995) , antibiotik diproduksi
pada saat fase stasioner.
Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam optimasi produksi antibiotika
yaitu waktu atau lama fermentasi, konsentrasi sumber karbon yang tersedia dalam
medium fermentasi serta pH medium fermentasi. Berdasarkan hasil penelitian
Enshasy dkk. (2007) bahwa aktivitas antibakteri dihasilkan pada fase decay yaitu fase
pada saat substrat mulai habis, penelitian pada antibiotik rifamycin yang dihasilkan
oleh Amycolaptosis mediterranei. Penelitian lain yang dilakukan oleh Todorov dan
Dicks (2007) menyebutkan bahwa aktivitas antibakteri berupa bacteriocin yang
dihasilkan oleh Lactobacillus pentosus ST712BZ optimum setelah lama fermentasi
24 jam pada suhu 30°C dengan media pertumbuhan yang ditambahkan 20-40 gram/L
glukosa.
Telah dilakukan penelitian oleh Andi Reskika mengenai ganggang hijau
Enteromorpha linza yang ditemukan memiliki aktivitas antimikroba terhadap Vibrio
alginoliticus ganggang coklat Dictyopteris acrostichoidesditemukan memiliki
aktivitas terhadap Vibrio alginoliticus dan Vibrio harveyi. Demikian pula dengan
penelitian yang dilakukan oleh Vallinayagam dkk. yang menemukan aktivitas dari
ganggang Gracilaria edulis terhadap Staphylococcus aureus dan Pseudomonas
aeroginosa. Taksin dkk. juga menemukan bahwa ganggang merah Coralina
officinalis memiliki aktivitas terhadap Enterococcus faecalis, Enterobacter
aerogenens dan Escherichia coli, sedangkan ganggang hijau Ulva rigida memiliki
aktivitas terhadap Staphylococcus aureus.
 Hentschel dan Wilkinson dalam Mahdiyah (2012) mengemukakan bahwa
spons merupakan salah satu organisme yang dapat berasosiasi dengan sejumlah besar
mikroorganisme berbeda meliputi cyanobacteria, bakteri heterotrofik, alga uniseluler
dan zoo-chlorella. Senyawa bioaktif laut atau produk alami laut (Marine Natural
Products (MNPs)) adalah senyawa organik yang diproduksi oleh mikroba, spons,
rumput laut, dan organisme laut lain. Organisme inang mensintesis senyawa ini
sebagai metabolit sekunder untuk melindungi dirinya dan menjaga keseimbangan
lingkungan. Spons laut memiliki sumber yang kaya akan mikroorganisme baru
dengan potensi aktivitas farmakologi. Interaksi antara spons dan bakteri terjadi dalam
bentuk simbiosis komensalisme di mana dalam interaksi ini dihasilkan senyawa
bioaktif.
Telah dilakukan penelitian oleh Zheng dkk. (2005) bahwa beberapa bakteri
berasosiasi dengan spons yang menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas
antimikroba adalah bakteri yang berasosiasi dengan spons Himeniacidon parleve,
yaitu NJ6-3-1 yang menghasilkan senyawa beta karbolin alkaloid yang bersifat
antimikroba terhadap Staphylococcus aureus.

Fermentasi Mikroorganisme
Fermentasi secara teknik dapat didefinisikan sebagai suatu proses oksidasi
anaerobik atau partial anaerobik karbohidrat yang menghasilkan alkohol serta
beberapa asam, namun banyak proses fermentasi yang menggunakan substrat protein
dan lemak. Fermentasi adalah proses yang dilakukan oleh mikroorganisme baik
melalui proses aerobik ataupun anaerobik dimana terjadi perubahan kimia spesifik
dari suatu substrat organik dan menghasilkan produk yang bernilai ekonomis.
Hasil fermentasi diperoleh sebagai akibat metabolisme mikroba pada suatu
bahan pangan dalam keadaan anaerob. Mikroba yang melakukan fermentasi
membutuhkan energi yang umumnya diperoleh dari glukosa. Dalam keadaan aerob,
mikroba mengubah glukosa menjadi air, CO2 dan energi (ATP). Beberapa mikroba
hanya dapat melangsungkan metabolisme dalam keadaan anaerob dan hasilnya adalah
substrat yang setengah terurai.
Dalam proses fermentasi mikroorganisme, pemilihan medium sangat penting
terhadap keberhasilan proses fermentasi karena medium menyediakan nutrisi untuk
pertumbuhan, energi, zat pembangun sel dan susbtrat biosintesis selama fermentasi.
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan fungi mengandung sumber karbon
(umumnya glukosa), sumber nitrogen (umumnya amonia atau nitrat terkadang asam
amino), fosfat, sulfat, magnesium, potassium, dan unsur mikro seperti besi, mangan,
zink, tembaga. Dan sebagai tambahan, terkadang juga ditambahkan bahan alam pada
medium seperti air rendaman jagung, ekstrak khamir, jus buah-buahan dan protein
terhidrolisa.