KATA PENGANTAR

Alhamdulillah puji syukur kehadirat Allah SWT. Karena hanya dengan rahmat dan hidayah-Nya
penulis dapat menyelesaikan makalah Metode Kromatografi yang berisikan tentang “Karakterisasi
Ekstrak Daun Dewa (Gynura pseudochina (L.) DC) dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”.

Sebelumnya diucapkan juga rasa terima kasih pada Allah SWT tentunya, baginda besar Rasulullah
Muhammad SAW beserta para sahabat dan pengikutnya, kemudian kepada Dosen mata kuliah Cara-Cara
Pemisahan yang telah memberikan banyak ilmu serta pengetahuan yang sangat bermanfaat.

Penulisan makalah ini sebagai tugas untuk mata kuliah Cara-Cara Pemisahan pada semester 4.
Penulis merasa bahwa makalah ini masih sangat jauh dari sempurna, oleh karena itu maka penulis sangat
mengharapkan masukan dan saran dari pembaca.

Jakarta, 26 Mei 2014

Penulis

1|Metode Kromatografi
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR...............................................................................................................................1

DAFTAR ISI.............................................................................................................................................2

BAB I PENDAHULUAN

A.Latar Belakang..........................................................................................................................3

B. Rumusan Masalah....................................................................................................................3

C. Tujuan Penulisan .....................................................................................................................3

BAB II ISI ................................................................................................................................................4

BAB III PENUTUP...................................................................................................................10

DAFTAR PUSTAKA...............................................................................................................................11

2|Metode Kromatografi
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Daun dewa [Gynura pseudochina(L.) DC, Asteraceae] adalah salah satu tumbuhan obat Indonesia
yang telah lama digunakan secara turun-temurun untuk pengobatan berbagai penyakit seperti obat demam
(antipiretik), kanker, kencing manis, tekanan darah tinggi dan penyakit kulit (obat luar). Selain itu daun
dewa juga digunakan untuk pengobatan penyakit ginjal dan ruam-ruam pada muka. Hasil penapisan
fitokimia daun dewa menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid, flavonoid, tanin, steroid dan
triterpenoid. Penelitian lain menemukan bahwa daun dewa mengandung senyawa flavonoid kuersetin 3,7-
O-diglikosida, empat macam alkaloid senesionina, senesifilina, senesifilinina dan (E)- senesifilina, enzim
peroksidase dan enzim isoperoksidase. Daun dewa telah terbukti menunjukkan berbagai efek
farmakologis, antara lain dapat menghambat pertumbuhan sel kanker, mempercepat waktu perdarahan,
waktu koagulasi dan mampu berfungsi sebagai antiseptik, menurunkan kadar kolesterol dalam darah dan
antiinflamasi. Kajian fitokimia dan farmakologi di atas menunjukkan daun dewa sangat penting dalam
pengobatan. Karena itu, mutu, keamanan dan kemaanfaatannya harus ditingkatkan melalui penelitian dan
pengembangan. Untuk meningkatkan mutu, keamanan dan kemanfaatan daun dewa sebagai obat bahan
alam Indonesia, perlu dilakukan standardisasi terhadap bahan bakunya, baik yang berupa simplisia
maupun yang berbentuk ekstrak atau sediaan galenik. Oleh karena itu penetapan karakterisasi simplisia
dan ekstrak daun dewa perlu dilakukan guna menjamin bahwa produk obat bahan alam yang mengandung
daun dewa dapat diketahui mutunya. Salah satu cara penetapan karakterisasi ekstrak tumbuhan obat
adalah penentuan pola kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Penelitian ini bertujuan untuk
menentukan karakteristik pola KCKT dari ekstrak daun dewa. Pola KCKT ini dapat dipakai sebagai salah
satu parameter untuk standardisasi ekstrak daun dewa.

B. Rumusan Masalah
1. Apa pengertian kromatografi ?
2. Bagaimana proses kromatografi ?

C. Tujuan Penulisan
1. Mengetahui proses kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk Karakterisasi Ekstrak Daun
Dewa (Gynura pseudochina (L.) DC) yang banyak digunakan untuk pengobatan.

3|Metode Kromatografi
 BAB II
ISI

Metode kromatografi merupakan metode yang banyak digunakan dalam aplikasi industri untuk
sampel gas dan uap. Kromatografi berasal dari kata cromatography yang bersal dari bahasa Yunani yang
berarti “berwarna” karena metode ini pada awalnya digunakan untuk pemisahan zat warna.
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan
antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada
larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding
molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan
pergerakan pada kolom.
Pada kolom kromatografi terdapat fasa diam yang umumnya terbuat dari material padatan yang
dapat mengabsorpsi komponen-komponen dalam sampel. Fasa diam ini dapat berupa cairan yang
melarutlkan komponen-komponen dalam sampel. Komponen-komponen dalam sampel masuk ke dalam
kolom kromatografi yang mengandung fasa diam, dan terjadi interaksi antara komp0nen-komponen yang
terbawa oleh fasa gerak dan fasa diam. Interaksi ini berbeda-beda untuk masing-masing komponen yang
terdapat dalam campuran tersebut, sehingga terjadi proses pemisahan. Setelah komponen-komponen
dalam sampel terpisah, masing-masing komponen tersebut dideteksi oleh detektor yang terdapat pada
peralatan kromatografi. Signal yang keluar dari detektor kromatografi dapat di plot terhadap waktu. Plot
signal terhadap waktu ini disebut “kromatogram”.
Prinsip kerja kromatografi cair kinerja tinggi adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair
dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi
dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Instrumen kromatografi cair kinerja tinggi antara lain terdiri dari
fase gerak, pompa, kran cuplikan, kolom dan detektor.
Pada penelitian ini dilakukan karakterisasi ekstrak tumbuhan obat (daun dewa) dengan melalui
penentuan pola kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk meningkatkan mutu, keamanan dan
kemanfaatan daun dewa sebagai obat bahan alam Indonesia. Dari daun dewa segar sebanyak 1 kilogram
setelah dikering-anginkan pada suhu kamar sampai kering (kadar air 9,6 %), diperoleh serbuk daun dewa
kering sebanyak 235 gram. Pembuatan ekstrak daun dewa dilakukan berdasarkan buku Monografi

4|Metode Kromatografi
Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia Volume 1 untuk pembuatan ekstrak daun sambung nyawa (Gynura
procumbens). Dari 100 g daun dewa kering diperoleh ekstrak kental sebanyak 7,567 gram dengan
rendemen 7,567 %. Rendemen ini sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan oleh BPOM untuk ekstrak
kental daun sambung nyawa. Hasil pengujian ini menunjukkan bahwa ekstrak daun dewa yang dibuat
sesuai dengan standar mutu yang berlaku, tetapi berbeda dengan ekstrak kental sambung nyawa. Hasil uji
pendahuluan ekstrak daun dewa menunjukkan bahwa ekstrak berbentuk cairan kental, berbau khas,
berwarna hijau tua dan rasa pahit. Susut pengeringan yang diperoleh dari ekstrak daun dewa adalah 9,48
%, kadar abu total 7,85 % dan kadar abu tidak larut dalam asam 1,25 %. Dari kromatogram dapat dilihat
bahwa senyawa rutin terlihat pada waktu retensi 3,225 menit, sedangkan pada kromatogram pembanding
kuersetin terdapat dua puncak yaitu isokuersitrin terlihat pada waktu retensi 4,450 menit dan kuersetin
terlihat pada waktu retensi 5,683 menit terlihat pada gambar (Gambar 2A dan 2B).

2A

2B
Kromatogram campuran kedua senyawa pembanding tersebut menunjukkan tiga puncak pada
waktu retensi 3,250, 4,533 dan 5,808 menit terlihat pada gambar (Gambar 2C).

2C

5|Metode Kromatografi
 Pada pengukuran KCKT senyawa pembanding secara berulang diperoleh waktu retensi seperti
pada Tabel 1.
Tabel 1. Waktu Retensi Senyawa Pembanding Rutin, Isokuersitrin danKuersetin yang Diukur Berulang
Kali.

Senyawa Waktu Retensi Rata-rata (menit) Minimum (menit) Maksimum

Pembanding (menit) (menit)
Rutin 3,225 3,235 3,225 3,250
3,250
3,242
3,225
3,233
Isokuersitrin 4,450 4,493 4,450 4,525
4,525
4,508
4,467
4,517
Kuersetin 5,808 5,767 5,683 5,817
5,817
5,800
5,683
5,725

Dari kromatogram hasil pengukuran ekstrak daun dewa (Gambar 3) dapat dilihat bahwa pada fraksi etil
asetat, butanol dan air dapat terdeteksi beberapa senyawa. Karakteristik kromatogram itu diringkaskan
dalam Tabel 2.

Tabel 2. Karakteristik Kromatogram Fraksi Etil Asetat, Fraksi Butanol dan Fraksi Air dari Ekstrak Daun
Dewa

Fraksi Jumlah P-1 P-2 P-3 P-4 P-5 P-6

Puncak (menit) (menit) (menit) (menit) (menit) (menit)
Etil 5 3,358 4,833 6,350 11,867 12,317
Asetat
Butanol 7 2,742 2,942 3,275 3,625 4,592 6,150

6|Metode Kromatografi
 Air 6 2,442 2,675 3,192 7,500 7,842

Pada kromatogram fraksi etil asetat (Gambar 3A) terdeteksi lima senyawa. Pada kromatogram fraksi
butanol (Gambar 3B) terdeteksi tujuh senyawa sedangkan pada kromatogram fraksi air (Gambar 3C)
terdeteksi enam senyawa.

C
Gambar 3. Kromatogram KCKT Fraksi Etil Asetat (A), Fraksi Butanol (B) dan Fraksi
Air (C) dari Ekstrak Daun Dewa dengan Fase Gerak Metanol-Asam
Asetat 1% (70 : 30)

Ekstrak daun dewa sebanyak 0,5670 gram ditambahkan 50 ml aqua bidestilata dan dilakukan
proses fraksinasi, tujuannya adalah untuk memisahkan senyawa yang bersifat non polar, semi polar dan
polar. Pelarut yang digunakan pada proses fraksinasi ini adalah heksan (non polar), etil asetat (semi polar)
dan butanol (polar) dan air (paling polar). Dari fraksinasi ekstrak daun dewa didapat 4 fraksi yaitu fraksi
heksan, fraksi etil asetat, fraksi butanol dan fraksi air. Dari keempat fraksi ini, fraksi heksan tidak
dikarakterisasi dengan KCKT karena dikhawatirkan fraksi heksan yang bersifat non polar akan terikat
kuat dalam kolom. Fraksi-fraksi etil asetat, butanol dan air dikarakterisasi menggunakan KCKT. Fraksi-
fraksi ini diduga mengandung senyawa-senyawa polifenol dan senyawa semi polar lainnya. Hasil
fraksinasi ini diuapkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh larutan pekat. Larutan pekat ini
dilarutkan dalam metanol sampai 100 ml lalu diukur dengan menggunakan KCKT partisi fase terbalik.
Untuk mendapatkan hasil yang baik dalam karakterisasi ekstrak daun dewa dengan KCKT, uji kesesuaian

7|Metode Kromatografi
sistem perlu dilakukan terlebih dahulu. Pada penelitian ini kolom yang digunakan adalah kolom RP 18,
ukuran 250 mm x 4,6 mm. Pemilihan kolom ini disesuaikan dengan metode KCKT yang digunakan yaitu
KCKT partisi fase terbalik yang dapat digunakan dengan fase gerak polar dan semi polar. Uji kesesuaian
sistem ini dilakukan dengan menggunakan senyawa pembanding yang diperkirakan terkandung dalam
ekstrak daun dewa, yaitu rutin, isokuersitrin dan kuersetin. Detektor yang digunakan adalah detektor UV
pada panjang gelombang 360 nm. Panjang gelombang ini dipilih karena senyawa pembanding yang
digunakan adalah senyawa flavonoid yaitu rutin, isokuersitrin dan kuersetin yang memiliki banyak gugus
kromofor pada strukturnya sehingga bisa terdeteksi panjang gelombang 360 nm. Selain itu, senyawa
flavonoid dapat terdeteksi secara maksimal pada panjang gelombang tersebut. Pada penelitian ini fase
gerak yang dicobakan adalah campuran asetonitril – air (50:50, 60:40, 70:30), campuran metanol – air
(50:50, 60:40, 70:30) dan campuran metanol – asam asetat 1% (50:50, 60:40, 70:30). Dari semua fase
gerak yang telah dicobakan diperoleh pemisahan yang terbaik untuk campuran senyawa pembanding
rutin, isokuersitrin dan kuersetin dengan menggunakan fase gerak campuran metanol – asam asetat 1%
dengan perbandingan 70:30 (Gambar 2C). Dari hasil uji kesesuaian sistem tersebut dapat disimpulkan
bahwa kolom yang dapat digunakan untuk memisahkan ketiga komponen itu dengan baik adalah kolom
fase terbalik RP 18 (250 x 4,6 mm, 5 μm) dengan memakai fase gerak campuran metanol – asam asetat
1% (70 : 30), volume sampel 20 μL dan laju alir 1 mL/menit. Karena itu sistem ini dapat dipakai untuk
karakterisasi ekstrak daun dewa. Untuk menentukan senyawa kimia yang terkandung di dalam fraksi etil
asetat, butanol dan air digunakan senyawa pembanding. Senyawa pembanding yang digunakan adalah
rutin dan kuersetin. Kedua senyawa ini digunakan sebagai pembanding karena ekstrak daun dewa
mengandung senyawa flavonoid dengan komponen utama kuersetin dan rutin. Syarat senyawa
pembanding yang baik adalah senyawa harus murni yang menghasilkan satu puncak. Senyawa
pembanding rutin menunjukkan satu puncak yang dominan pada pada waktu retensi 3,225 (Gambar 2A)
sehingga dapat dipakai sebagai pembanding. Senyawa pembanding kuersetin menunjukkan dua puncak
yang dominan pada waktu retensi 4,450 menit dan 5,683 menit. Waktu retensi 4,450 menit menunjukkan
senyawa isokuersitrin dan waktu retensi 5,683 menit menunjukkan senyawa kuersetin. Senyawa
pembanding kuersetin yang diperoleh dari Laboratorium Biota Sumatra Universitas Andalas berupa
campuran isokuersitrin dan kuersetin. Senyawa isokuersitrin memiliki satu gugus gula pada strukturnya
sedangkan senyawa kuersetin tidak memiliki gugus gula (aglikon). Oleh karena itu senyawa isokuersitrin
lebih polar dibandingkan dengan kuersetin sehingga isokuersitrin lebih dulu keluar pada kromatogram
(Gambar 2B). Berdasarkan hasil pengujian pada sampel maka didapatkan kromatogram dari fraksi etil
asetat, butanol dan air. Pada kromatogram fraksi etil asetat dari ekstrak daun dewa terdapat lima puncak
(Gambar 3A). Pada kromatogram fraksi butanol terdapat tujuh puncak (Gambar 3B), dan pada
kromatogram fraksi air terdapat enam puncak (Gambar 3C). Bila puncakpuncak yang didapatkan pada
kromatogram fraksi-fraksi dari ekstrak daun dewa dibandingkan dengan waktu retensi senyawa

8|Metode Kromatografi
pembanding (Tabel 1) terlihat bahwa beberapa puncak mendekati waktu retensi untuk rutin, isokuersitrin
dan kuersetin. Dari hasil penelitian ini dapat dilihat bahwa ekstrak daun dewa memiliki kandungan kimia
flavonoid, terutama rutin, isokuersitrin dan kuersetin. Hal ini ditunjukkan dari puncak rutin yang terdapat
pada fraksi etil asetat, butanol dan air yang lebih dominan sehingga dapat dijadikan sebagai senyawa
penanda untuk penentuan mutu ekstrak daun dewa. Dengan demikian pola KCKT ini dapat dipakai untuk
identifikasi dan pemastian mutu ekstrak daun dewa.

9|Metode Kromatografi
 BAB III

PENUTUP

KESIMPULAN
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang
berada pada larutan.
Proses kromatografi diawali dengan komponen-komponen dalam sampel masuk ke dalam
kolom kromatografi yang mengandung fasa diam, dan terjadi interaksi antara komponen-
komponen yang terbawa oleh fasa gerak dan fasa diam. Interaksi ini berbeda-beda untuk masing-
masing komponen yang terdapat dalam campuran tersebut, sehingga terjadi proses pemisahan.
Setelah komponen-komponen dalam sampel terpisah, masing-masing komponen tersebut dideteksi
oleh detektor yang terdapat pada peralatan kromatografi. Signal yang keluar dari detektor
kromatografi dapat di plot terhadap waktu. Plot signal terhadap waktu ini disebut “kromatogram”.
Dari penelitian yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa KCKT RP 18 (250
mm x 4,6 mm, 5 μm) menghasilkan puncak kromatogram yang baik untuk karakterisasi ekstrak
daun dewa dengan fase gerak campuran metanol-asam asetat 1% pada perbandingan 70:30, laju
alir 1 mL/menit dan detektor UV pada panjang gelombang 360 nm. Pola KCKT fraksi etil asetat
ekstrak daun dewa menunjukkan lima puncak, pola KCKT fraksi butanol menunjukkan tujuh
puncak dan pola KCKT fraksi air ekstrak daun dewa menunjukkan enam puncak. Pada ketiga
fraksi tersebut terdapat senyawa rutin dan komponen-komponen lain yang belum diketahui dengan
pasti. Pola KCKT masing-masing fraksi menunjukkan puncak-puncak khas yang dapat dipakai
untuk identifikasi dan pengendalian mutu ekstrak daun dewa.

10 | M e t o d e K r o m a t o g r a f i
 DAFTAR PUSTAKA

Sudibyo M. Alam Sumber Kesehatan: Manfaat dan Kegunaan. Jakarta: Balai Pustaka; 1998.
Perry LM. Medicinal Plants of East and South East Asia: Attributed Properties and Uses. Cambridge
(MA): MIT Press; 1980
Sayuthi D, Darusman LK, Suparto IH, Imanah A. Potensi senyawa bioaktif daun dewa (Gynura
pseudochina (Linn.) DC. sebagai antikanker.Buletin Kimia 2000; 1(1): 23-29.
Herwindriandita. Telaah fitokimia daun dewa [Gynura pseudochina (Lour.)] DC. Skripsi. Bandung:
Sekolah Farmasi ITB; 2006.
Yuan SQ, Gu GM, Wei TT. Studies on the alkaloids of Gynura segetum (Lour.) Merr. Yau Xue Xue Bao
1990; 25(3): 191-197.
Fu PP, Yang YC, Xia Q, Chou MW, Cui YY, Lin L. 2002, Pyrrolizidine alkaloids – tumorigenic
components inChinese herbal medicines and dietary supplements. J Food and Drug Anal 2002;
10(4): 198-211.
Qi X, Wu B, Cheng Y, Qu H. Simultaneous characterization of pyrrolizidine alkaloids and N-oxides in
Gynura segetum by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry. Rapid Commun Mass
Spectrom 2009; 23(2): 291-302.
Pewnim T, Thadaniti S. Study on medicinal plants of the Thachin basin with on emphasis on the chemical
and biological properties. Research Summary: Silpakorn University No.3, Bangkok (Thailand);
1988; 158 p.
Pewnim T. Production of peroxidase from plants in the Thachin Basin. Research Abstracts Silpakorn
University, Bangkok (Thailand); 1993; 156 p.
Sayuthi D. 2001, Ekstraksi, fraksinasi, karakterisasi dan uji hayati in vitro senyawa bioaktif daun dewa
(Gynura pseudochina (Linn.) DC. Sebagai antikanker. Buletin Kimia 2001; 1(2): 75-79.
Novayanti D. Pengaruh ekstrak daun dewa (Gynura pseudochina (Lour.) DC., terhadap waktu perdarahan
dan koagulasi pada tikus putih (Rattus norwegicus, L.). Skripsi. Yogyakarta: UIN Sunan Kalijaga;
2009.
Abdullah T. Pengaruh pemberian ekstrak etanol daun dewa (Gynura pseudochina (Lour.) DC. Terhadap
kadar kolesterol total, kolesterol HDL, kolesterol LDL dalam serum tikus jantan
hiperkolesterolemik. Tesis. Surabaya: Universitas Airlangga; 2005
Siriwatanametaton N, Fiebich BL, Efferth T, Prieto JM, Heinrich M. Traditionally used Thai medicinal
plants: in vitro anti-inflammatory, anticancer and antioxidant activities. J Ethnopharmacol 2010;
130(2): 196-207.
Ditjen POM. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan
Republik Indonesia; 2000.
11 | M e t o d e K r o m a t o g r a f i
BPOM. Monografi Tumbuhan Obat Indonesia. Volume 1. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan
Republik Indonesia; 2004.
Pennarietta JM, Alvarado JA, Akesson B and Bergenstahk B. 2007. Separation of phenolic compounds
from foods by reversed-phased high performance liquid chromatography. Bolivian Journal of
Chemistry 2007; 24(1): 1-4.
Fatma Lestari . 2007. Bahaya Kimia sampling dan pengukuran kontaminan di udara. Jakarta : EGC

12 | M e t o d e K r o m a t o g r a f i