BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Pada percobaan Modul 03: Deteksi dan Penentuan Kandungan Metabolit Primer
dan Sekunder ini, untuk menunjang pelaksanan praktikum kami menggunakan alat dan
bahan sebagai berikut :
Tabel 3.1 Alat dan bahan pada percobaan
Alat Bahan
Eppendorf (2) Aluminium foil (1 gulung)
Gelas kimia (2) Etanol 96% (20 mL)
Gelas ukur (8) Falcon tube 15 mL (8)
Kertas saring (8) Kertas Saring (1 lembar)
Mortar dan pestle (1) Larutan Benedict (5 mL)
Pelat tetes (2) Larutan Biuret (5 mL)
Penangas air (1) Larutan Dragendorff (5 mL)
Pipet tetes (2) Larutan I2KI (5 mL)
Sentrifuga (1) Larutan Liebermann-Burchard (5 mL)
Spektofotometer (1) Larutan Na2CO3 (15 mL)
Tabung reaksi (8) Reagen Folun-Ciocalteu (10 mL)
Timbangan (1) Sari jeruk nipis (10 mL)
Tanaman Camellia sinensis (teh) (1 g)
Tanaman Cantella asiatica (pegagan) (1 g)
Tanaman Mentha piperita (mint) (1 g)
Tanaman Nicotiana tabacum (tembakau) (1 g)
Teh celup (1)

3.2 Langkah Kerja

3.2.1 Ekstraksi
Disiapkan etanol 96% 20 mL, dan organ tanaman (akar, batang, dan daun)
Camellia sinensis (teh), Mentha piperita (mint), Nicotiana tabacum (tembakau),
 dan Cantella aquatica (pegagan) diambil masing-masing 1 gr. Kemudian, organ
tanaman digerus hingga halus. Ekstrak yang diperoleh dilarutkan dengan 20 mL
etanol 96%. Selanjutnya, didiamkan selama 15 menit, lalu disaring. Kemudian,
ampas yang diperoleh ditambahkan 10 mL lagi, digerus dan digabung dengan
ekstraksi sebelumnya. Kemudian, larutan yang diperoleh disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit sampai supernatant terpisah dari endapan.
3.2.2 Pengujian Metabolit Primer
3.2.2.1 Uji Polisakarida dengan Reagen Lugol (I2KI)
Disiapkan ekstrak sari jeruk nipis, teh celup, organ tanaman (akar, batang,
dan daun) Camellia sinensis (teh), Mentha piperita (mint), Nicotiana tabacum
(tembakau), dan Cantella aquatica (pegagan) masing-masing sebanyak 5 tetes, dan
3 tetes larutan Lugol (I2KI). Kemudian, ekstrak tanaman diteteskan pada pelat tetes
sebanyak 5 tetes. Selanjutnya, ditambahkan larutan lugol (I2KI) sebanyak 3 tetes.
3.2.2.2 Uji Monosakarida dan Disakarida dengan Reagen Benedict
Disiapkan ekstrak sari jeruk nipis, teh celup, organ tanaman (akar, batang,
dan daun) Camellia sinensis (teh), Mentha piperita (mint), Nicotiana tabacum
(tembakau), dan Cantella aquatica (pegagan) masing-masing sebanyak 500 µL,
dan 3 tetes reagen benedict. Kemudian, diambil 500 µL ekstrak tanaman, lalu
dipipet dengan pipet tetes kedalam eppendorf. Selanjutnya, ekstrak tanaman
ditambahkan reagen benedict sebanyak 3 tetes. Kemudian, larutan dipanaskan
selama 5 menit pada suhu 95°C.
3.2.2.3 Uji Protein dengan Reagen Biuret
Disiapkan ekstrak sari jeruk nipis, teh celup, organ tanaman (akar, batang,
dan daun) Camellia sinensis (teh), Mentha piperita (mint), Nicotiana tabacum
(tembakau), dan Cantella aquatica (pegagan) masing-masing sebanyak 3 mL, dan
reagen biuret (3 mL NaOH 4% dan 3 tetes CuSO4 1%). Kemudian, diambil 3 mL
ekstrak tanaman, lalu ditambahkan dengan 3 mL NaOH 4%. Selanjutnya, campuran
diteteskan 3 tetes larutan CuSO4 1%.
3.2.3 Pengujian Metabolit Sekunder
3.2.3.1 Uji Alkaloid
 Disiapkan ekstrak sari jeruk nipis, teh celup, organ tanaman (akar, batang,
dan daun) Camellia sinensis (teh), Mentha piperita (mint), Nicotiana tabacum
(tembakau), dan Cantella aquatica (pegagan) masing-masing sebanyak 5 tetes, dan
larutan dragendorff 3 tetes (perbandingan asam asetat : asam sulfat adalah 2 : 1).
Kemudian, ekstrak tanaman diteteskan pada pelat tetes sebanyak 5 tetes.
Selanjutnya, ditambahkan larutan dragendorff sebanyak 3 tetes.
3.2.3.2 Uji Terpenoid
Disiapkan ekstrak sari jeruk nipis, teh celup, organ tanaman (akar, batang,
dan daun) Camellia sinensis (teh), Mentha piperita (mint), Nicotiana tabacum
(tembakau), dan Cantella aquatica (pegagan) masing-masing sebanyak 5 tetes, dan
3 tetes reagen Liebermann-Burchard. Kemudian, ekstrak tanaman diteteskan pada
pelat tetes sebanyak 5 tetes. Selanjutnya, ditambahkan reagen Liebermann-
Burchard sebanyak 3 tetes.
3.2.3.3 Penentuan Kandungan Fenol dengan Metode Gallic Acid
Disiapkan sari jeruk nipis, teh celup, larutan gallic acid 1mg/mL, 3 mL
reagen folin-ciocalteu (1:1), 12 mL Na2CO3 20%, dan 15 mL H2O. Kemudian,
dibuat seri pengenceran larutan dengan konsentrasi 0, 10, 20, 40, 80, dan 160
µg/mL asam galat (gallic acid). Selanjutnya, 0.5 mL masing-masing larutan standar
dicampurkan dengan 0.5 mL reagen folin-ciocalteu (1:1) pada tabung reaksi, lalu
didiamkan selama 5 menit. Kemudian, masing-masing campuran ditambahkan 2
mL Na2CO3 20%, dan 2.5 mL H2O. Campuran diinkubasi pada air mendidih selama
1 menit, lalu didinginkan dan diukur absorbansi pada panjang gelombang 765 nm.
Selanjutnya, dibuat kurva standar dengan menggunakan nilai absorbansi larutan
standar. Lalu, untuk menentukan kandungan fenol total dihitung Gallic acid
equivalent (GAE)/mL sampel. Dengan cara yang sama, dihitung kandungan fenol
total sampel pada sampel sari jeruk nipis dan ekstrak teh (teh celup).