Ekstraksi Tanaman Metabolit sekunder

William P. Jones dan A. Douglas Kinghorn

Ringkasan
Tanaman metabolit sekunder saat subyek banyak
kepentingan penelitian, tetapi ekstraksi mereka sebagai bagian dari fitokimia atau
penyelidikan biologi menyajikan tantangan khusus yang harus
ditujukan selama proses ekstraksi pelarut. sukses
ekstraksi dimulai dengan pilihan hati-hati dan persiapan tanaman
sampel, dan review menyeluruh dari literatur yang sesuai untuk indikasi yang protokol cocok untuk kelas
tertentu senyawa atau spesies tanaman. Selama ekstraksi bahan tanaman, itu adalah
penting untuk meminimalkan gangguan dari senyawa yang dapat coextract dengan senyawa sasaran, dan
untuk menghindari kontaminasi
ekstrak, serta untuk mencegah dekomposisi metabolit penting atau pembentukan artefak sebagai akibat
dari kondisi ekstraksi atau kotoran pelarut. Bab ini menyajikan gambaran proses
ekstraksi tanaman, dengan penekanan pada masalah umum yang dihadapi dan metode untuk
mengurangi atau menghilangkan masalah ini. Di
Selain protokol ekstraksi berlaku umum, metode yang
disarankan untuk lebih atau kurang selektif mengekstraksi kelas tertentu
senyawa, dan metode fitokimia disajikan untuk deteksi
kelas senyawa yang biasa ditemui selama tanaman
ekstraksi, termasuk kelompok-kelompok yang dipilih dari metabolit sekunder dan
campur senyawa.
Kata Kunci: Ekstrak Tanaman; tanaman metabolit sekunder; perembesan; kelelahan; artefak ekstraksi; campur
senyawa; metode deteksi fitokimia.
323
Dari: Metode Bioteknologi, Vol. 20, Natural Products Isolasi, 2nd ed.
Diedit oleh: SD Sarker, Z. Latif, dan AI Gray Humana Tekan Inc., Totowa, NJ
1. Perkenalan
Para peneliti dari berbagai disiplin ilmu dihadapkan dengan
tantangan penggalian bahan tanaman dengan pelarut, sering sebagai langkah pertama
arah mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa tertentu yang bertanggung jawab untuk
kegiatan biologis yang berhubungan dengan tanaman atau ekstrak tanaman. dorongan
untuk penelitian ini timbul sebagian besar karena tanaman membentuk dasar dari farmakope
tradisional, dan karena banyak obat farmasi saat ini yang penting kami diperoleh dari tanaman (1-3).
bunga lebih lanjut muncul
dari kesadaran bahwa banyak metabolit sekunder
organisme, termasuk tanaman, melayani biologis penting dan ekologi
peran, terutama sebagai pembawa pesan kimia dan senyawa defensif (4,5).
Penyidik terlibat dalam isolasi metabolit sekunder dari
tanaman segera menemukan kebutuhan untuk kemahiran laboratorium yang cukup besar dalam
rupanya rutin '' persiapan sampel '' langkah-langkah yang mengkonversi tanaman mentah
bahan ke dalam ekstrak yang cocok untuk analisis kimia, pengujian biologi, atau
pemisahan kromatografi. Bab ini menguraikan langkah-langkah yang terlibat dalam pabrik
ekstraksi, dimulai dengan pendekatan untuk memilih, mengumpulkan, mengolah, dan
sampel tanaman mendokumentasikan. Prosedur untuk ekstraksi bahan tanaman yang
dijelaskan, teknik yang dirancang untuk menghilangkan beberapa yang paling umum '' gangguan ''
senyawa yang sering diekstrak bersama dengan senyawa yang menarik
yang disajikan, dan rekomendasi yang diberikan untuk menyesuaikan protokol ekstraksi yang sesuai
dengan tujuan tertentu. sumber umum dari kontaminasi dan penyebab potensi pembentukan artefak
selama ekstraksi dibahas, dan
saran yang diberikan untuk mengurangi atau menghilangkan masalah ini. teknik
untuk deteksi kelas yang dipilih dari tanaman metabolit sekunder yang potensial bunga (dan kontaminan
umum dan '' gangguan '' metabolit yang
mengganggu kimia dan tes biologis) disajikan juga. Tekanan
akan ditempatkan di seluruh pada cara praktis untuk mengenali dan menghindari perangkap umum, dan
untuk mengatasi masalah-masalah tertentu yang mungkin ditemui
selama ekstraksi metabolit sekunder tanaman.
2. Metode
2.1. Seleksi, Koleksi, dan Identifikasi Tanaman Bahan
Metode yang digunakan dalam pemilihan, pengumpulan, dan identifikasi
bahan tanaman secara langsung mempengaruhi reproduksibilitas fitokimia
penelitian, dan kecerobohan pada tahap ini dari penyelidikan mungkin sangat
mengurangi nilai ilmiah dari penelitian secara keseluruhan. Tanaman metabolit sekunder
sering menumpuk di bagian-bagian tanaman tertentu. Dengan demikian, kecuali jika sudah diketahui
324 Jones dan Kinghorn
yang bagian berisi tingkat tertinggi dari senyawa yang menarik, adalah bijaksana untuk mengumpulkan
beberapa bagian tanaman, atau seluruh tanaman, untuk memastikan ekstrak
disiapkan adalah wakil dari berbagai metabolit sekunder yang dihasilkan
oleh tanaman (lihat Catatan 1). metabolit sekunder tertentu juga bervariasi baik
kuantitatif dan kualitatif antara spesies terkait erat, dalam
spesies tunggal, dan di antara anggota populasi (6,7). Perhatian harus
Oleh karena itu dilakukan ketika membuat kesimpulan yang luas tentang kehadiran
atau tidak adanya senyawa tertentu dalam spesies diselidiki, dan
ketika teringat sampel dengan tujuan mengisolasi lebih dari spesifik
metabolit (lihat Catatan 2).
Untuk penemuan obat dari tanaman, sampel dapat dipilih dengan menggunakan sejumlah pendekatan,
misalnya, (1) investigasi tanaman tradisional
digunakan oleh manusia untuk makanan, obat-obatan, atau racun berdasarkan tinjauan literatur atau
wawancara yang dilakukan sebagai bagian dari penyelidikan (2,8)(Lihat Catatan
3); (2) koleksi acak atau sistematis satu set keanekaragaman hayati sampel tanaman, biasanya dari
wilayah ekologis yang relatif belum dipetakan sebagai
salam produksi metabolit sekunder (3,9); (3) pemilihan spesies
berdasarkan hubungan kekerabatan dengan spesies yang dikenal untuk menghasilkan senyawa atau
senyawa golongan bunga (10); dan (4) studi spesies
berdasarkan laporan dari aktivitas biologis dalam literatur (termasuk kimia
ekologi, toksikologi, dan laporan hewan). Database dapat digunakan untuk membantu
dalam memilih spesies yang memenuhi satu atau kombinasi dari kriteria yang ditentukan
(11,12). pendekatan berbasis keanekaragaman hayati memiliki keunggulan logistik untuk
skala besar program skrining, dan mereka diharapkan untuk menghasilkan persentase yang lebih tinggi
novel, struktur kimia biologis aktif (3,13). Sebagai tambahan
pertimbangan fitokimia, etika dan masalah hukum yang terkait dengan
kekayaan intelektual yang semakin penting dan kontroversial, terutama ketika bahan tanaman atau
ekstrak akan melintasi perbatasan internasional
(14,15) (Lihat Catatan 4).
Banyak pertimbangan logistik yang terkait dengan pengumpulan bahan tanaman
dari lapangan telah ditangani di tempat lain (2,16,17), Dan sehingga hanya aspek-aspek umum yang
disebutkan di sini. Sebelum koleksi lapangan, disarankan
untuk meninjau flora daerah; untuk mengkompilasi daftar yang spesies, genera,
atau keluarga adalah kepentingan tertentu; dan untuk menentukan taksa yang menjadi
dihindari (7). Untuk koleksi berbasis keanekaragaman hayati, taksa endemik ke daerah
bersangkutan adalah prioritas tinggi, spesies kurus pandemi mungkin dari
sedikit minat, dan spesies langka atau terancam punah yang harus benar-benar dihindari
(Lihat Catatan 5). Dianjurkan untuk mencoba identifikasi bidang sampel
dikumpulkan (setidaknya ke tingkat genus) (lihat Catatan 6). Untuk membantu taksonomi
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 325
ahli dalam mengkonfirmasikan atau memperbaiki identifikasi lapangan, dan sebagai permanen
catatan ilmiah, spesimen voucher (termasuk organ reproduksi, ketika
layak) harus disiapkan dan disimpan di herbarium, termasuk setidaknya
satu lembaga utama dan, jika berlaku, dalam herbarium lokal dalam sumber
negara. Kode voucher harus dipertahankan untuk dimasukkan mungkin dalam
publikasi yang dihasilkan dari koleksi. Sebuah kartu catatan ditempelkan spesimen voucher harus
mencakup pengamatan seperti penggunaan lokal dari spesies,
habitatnya, lingkungan mikro (misalnya, berbayang vs lokasi cerah), keadaan
kesehatan tanaman secara keseluruhan (lihat Catatan 7), tahap dalam siklus reproduksi, dan lainnya
fakta-fakta yang mungkin berguna bagi penyelidikan masa depan.
2.2. Pengeringan dan Grinding
Secara umum, bahan tanaman harus dikeringkan pada suhu di bawah 30C untuk
menghindari dekomposisi senyawa thermolabile. Demikian juga, itu harus
terlindung dari sinar matahari karena potensi transformasi kimia yang dihasilkan dari paparan radiasi
ultraviolet. Untuk mencegah
penumpukan panas dan kelembaban, sirkulasi udara di sekitar bahan tanaman
adalah penting. Oleh karena itu, tidak harus dipadatkan, dan mungkin diperlukan
menggunakan kipas atau cara lain untuk memberikan aliran udara di sekitar atau melalui sampel
pengeringan (lihat Catatan 8).
Ketika bahan tanaman segar diperlukan untuk studi, disarankan untuk mengekstrak
sesegera mungkin menggunakan pelarut organik, seperti metanol (MeOH) atau
etanol (EtOH), yang akan menonaktifkan enzim hadir di pabrik. Biasanya,
ekstrak yang dihasilkan akan berisi sebagian besar air, dan, jika diinginkan, dapat dipartisi dengan pelarut
organik yang bercampur dengan
campuran hydroalcoholic. Jika bahan tanaman harus tanah sebelum
ekstraksi, mungkin perlu untuk menggiling bahan dalam pelarut buffer,
sehingga mencegah reaksi hidrolisis karena perubahan pH yang dapat terjadi
ketika asam organik hadir di kompartemen selular yang dirilis. Atau, bahan tanaman dapat dibekukan
dan diangkut di atas es kering, atau
diawetkan dalam alkohol.
jumlah kecil bahan tanaman dapat digiling menggunakan kopi listrik
atau rempah-rempah mill, atau dalam lesung dan alu, dalam hal ini, penambahan kecil
jumlah pasir dapat membantu dalam proses. Penggilingan dalam jumlah besar tanaman
Bahan ini biasanya terbaik dilakukan dengan menggunakan skala industri kominusi
peralatan (lihat Catatan 9). Grinding meningkatkan efisiensi ekstraksi
dengan meningkatkan luas permukaan bahan tanaman. Hal ini juga mengurangi
jumlah pelarut yang dibutuhkan untuk ekstraksi dengan memungkinkan material untuk berkemas
lebih padat. Meskipun mungkin tampak bahwa bahan tanaman penggilingan denda
326 Jones dan Kinghorn
bubuk akan ideal, jika partikel yang terlalu halus, pelarut tidak dapat mengalir
dengan mudah di sekitar mereka. Selanjutnya, gesekan penggilingan menghasilkan panas
(Halus partikel yang dihasilkan, semakin banyak panas), berpotensi menyebabkan volatil
konstituen akan hilang, dan thermolabile komponen untuk menurunkan dan
mengoksidasi. Tanaman yang mengandung komponen volatil dapat diekstraksi oleh uap
penyulingan bahan tanaman cincang kasar.
2.3. pencabutan
Berbagai teknik, bervariasi dalam biaya dan tingkat kompleksitas, mungkin
digunakan untuk ekstraksi bahan tanaman. Untuk sebagian besar aplikasi, relatif
teknik sederhana, seperti perkolasi dan maserasi, efektif dan
ekonomis. Beberapa aplikasi tertentu, bagaimanapun, memerlukan teknik ekstraksi yang lebih canggih
dan mahal menggunakan peralatan khusus (lihat
Catatan 10), seperti yang digunakan dalam penyulingan skala besar uap dan ekstraksi superkritis-cairan
(SFE) (lihat Bab. 3). Metode ekstraksi pelarut dapat diklasifikasikan sebagai terus menerus atau terputus-
putus. dalam kontinyu
metode (misalnya, perkolasi dan ekstraksi Soxhlet), pelarut mengalir melalui
bahan tanaman terus menerus. Sebagai konstituen berdifusi dari tanaman
bahan ke dalam pelarut sekitarnya, pelarut menjadi semakin
jenuh, tetapi karena pelarut yang terus mengalir, jenuh
pelarut diganti dengan pelarut yang kurang jenuh. Dalam kasus metode terputus, pelarut ditambahkan
dan dihapus dalam batch. Oleh karena itu, sekali
kesetimbangan tercapai antara konsentrasi zat terlarut dalam pabrik
material dan konsentrasi dalam pelarut, ekstraksi dasarnya berhenti
sampai pelarut dialirkan dan diganti dengan pelarut baru.
Terlepas dari teknik ekstraksi yang digunakan, larutan yang dihasilkan
harus disaring untuk menghilangkan partikel yang tersisa. Menanam
ekstrak tidak harus disimpan dalam pelarut untuk waktu yang lama pada suhu kamar, atau di bawah
sinar matahari, karena peningkatan risiko yang menyertainya dari
pembentukan artefak dan dekomposisi atau isomerisasi konstituen ekstrak (lihat Sub Pos 2.4.). Ekstrak
dapat terkonsentrasi pada tekanan berkurang pada evaporator putar atau dikeringkan di bawah aliran
nitrogen. Jika sebuah
evaporator rotary digunakan, disarankan untuk menjaga suhu air mandi di bawah 40C untuk mencegah
dekomposisi komponen thermolabile.
Terutama ketika penggalian sejumlah besar sampel tunggal, pelarut
dikumpulkan dari evaporator kondensor rotary selama konsentrasi
satu ekstraksi batch yang dapat didaur ulang untuk ekstraksi lebih lanjut yang sama
sampel, tetapi penggunaan pelarut pulih dalam ekstraksi sampel lainnya tidak
disarankan, karena dapat menyebabkan kontaminasi silang dari ekstrak kemudian.
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 327
2.3.1. Perkolasi dan Soxhlet Extraction
Perkolasi adalah metode yang efisien ekstraksi, cocok untuk menengah ke
ukuran sampel yang besar. Berbagai kapal yang berbeda dapat berfungsi sebagai percolators.
Persyaratan utama adalah bahwa mereka memiliki bukaan yang lebar di bagian atas untuk
mengakomodasi penambahan dan penghapusan bahan tanaman, dan katup di
dasar untuk mengatur aliran pelarut (lihat Catatan 11). Dengan katup di ditutup
posisi, bahan tanaman ditambahkan ke wadah, meninggalkan ruang untuk ekspansi. Kemudian, cukup
pelarut ditambahkan untuk menutupi sampel. Jika bahan tanaman terlalu longgar dikemas, tidak akan
meresap efisien, dan itu mungkin perlu
dikompresi untuk mengurangi jumlah pelarut yang dibutuhkan untuk menutupi sampel (kaca atau
labware keramik berpori dapat digunakan sebagai bobot untuk mengompresi bahan tanaman). Bahan
tanaman diperbolehkan untuk rendam selama beberapa
jam atau semalam, dengan jumlah yang cukup pelarut yang ditambahkan ke
menjaga bahan tanaman tertutup. Berikutnya, katup dibuka sedikit untuk memungkinkan
pelarut mengalir perlahan ke dalam wadah. Laju aliran diatur untuk memastikan
bahwa keluarnya pelarut hampir jenuh dengan zat terlarut, dan pelarut ditambahkan
di bagian atas perkolator untuk menggantikan yang hilang dari bawah. Meskipun
pada prinsipnya lebih efisien dan ekonomis dari pelarut dari maserasi (lihat
Subpos 2.3.2.), Perkolasi biasanya tidak praktis untuk jumlah kecil
bahan tanaman atau untuk sejumlah besar sampel. ekstraksi Soxhlet,
menggunakan perangkat yang tersedia secara komersial, adalah metode yang nyaman untuk ekstraksi
kecil untuk volume moderat bahan tanaman. Karena ekstraksi berlangsung dalam sistem tertutup di
mana pelarut adalah terus-menerus
daur ulang, jumlah pelarut yang dibutuhkan untuk ekstraksi Soxhlet adalah minimal.
Dalam extractors yang paling umum digunakan, namun, panas yang dibutuhkan untuk menggerakkan
ekstraksi kemungkinan akan menyebabkan thermolabile konstituen untuk membentuk artefak
atau produk dekomposisi.
2.3.2. Kelelahan
Maserasi adalah metode umum untuk ekstraksi dari sejumlah kecil
bahan tanaman di laboratorium karena bisa dilakukan mudah
di labu Erlenmeyer (termos dapat ditutup dengan parafilm atau aluminium
menggagalkan untuk mencegah penguapan pelarut). Sebagai pedoman kasar, setelah masing-masing
Selain dari pelarut segar, bahan tanaman harus dibiarkan untuk lebih basah
semalam. pelarut harus tertuang melalui layar atau filter,
dan pelarut segar ditambahkan ke tabung. Sampel tersebut kemudian dicampur dengan
segar pelarut dengan pengadukan atau berputar-putar, dan kiri untuk lebih basah lagi. sonication
sampel maserasi atau berputar-putar lembut di atas meja kaldu fermentasi
328 Jones dan Kinghorn
kadang-kadang digunakan untuk mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk ekstraksi menyeluruh.
Pengalaman menunjukkan bahwa setelah tiga perubahan pelarut, bahan tanaman
hampir sepenuhnya habis (lihat Catatan 12). sampel besar mungkin juga
dimaserasi, biasanya dalam wadah besar dengan keran di dasar, seperti dengan
skala besar perkolasi, kecuali bahwa pelarut berubah dalam batch.
2.3.3. Pilihan Solvent
Faktor-faktor yang harus dipertimbangkan ketika memilih pelarut atau pelarut
sistem untuk mengekstrak bahan tanaman meliputi kelarutan konstituen sasaran, keamanan,
kemudahan bekerja dengan pelarut, potensi pembentukan artefak, dan kelas dan kemurnian pelarut.
Mengikuti prinsip
'' Seperti ekstrak seperti, '' sering mungkin untuk menyesuaikan pilihan pelarut untuk memaksimalkan
hasil dari senyawa dari bunga, sementara meminimalkan ekstraksi senyawa yang tidak diinginkan. teknik
ekstraksi khusus yang mencegah
dekomposisi dari analit yang menarik atau yang efisien mengekstrak
senyawa yang diinginkan sering dilaporkan. Sebuah seksama terhadap literatur
terkait dengan spesies dan senyawa kelas diselidiki sering
menghemat waktu dan usaha. Bahkan ketika sedikit informasi yang ada tentang metabolit sekunder dari
spesies tertentu, laporan fitokimia pada
spesies lain dalam genus atau keluarga dapat memberikan petunjuk tentang yang
kelas senyawa yang diharapkan, dan yang pelarut dan prosedur mungkin
digunakan untuk mengisolasi mereka. Selain itu, mungkin bermanfaat untuk melakukan beberapa
ekstraksi percobaan menggunakan pelarut dan teknik yang berbeda. Perbandingan dari
Total ekstrak hasil, hasil metabolit yang menarik, atau intensitas aktivitas biologis akan menunjukkan
metode mana yang memberikan hasil terbaik.
Tindakan pencegahan harus diambil untuk meminimalkan risiko kebakaran dan ledakan saat
menggunakan dan menyimpan pelarut mudah terbakar dan pelarut yang cenderung membentuk
peroksida peledak (seperti dietil eter dan pelarut ether lainnya yang mengandung) (lihat Catatan 13).
Pelarut dengan titik didih rendah umumnya lebih mudah
untuk menggunakan dari sudut pandang bahwa mereka lebih mudah berkonsentrasi. aseton,
kloroform (CHCl3), diklorometana (DCM), etil asetat (EtOAc), dan
n-heksana / petroleum eter menguap relatif cepat, sedangkan air dan
butanol lebih sulit untuk menghapus.
2.3.4. Preparasi Sampel untuk Skala Besar Screening Biological
Ketika sejumlah besar ekstraksi yang harus dilakukan, secara umum
tidak layak untuk mengambil setiap sampel tanaman dengan sistem pelarut disesuaikan.
Sebuah prosedur umum harus dikembangkan dan divalidasi, memberikan pertimbangan
dengan tingkat deteksi ekstrak aktif ( '' hits '') diperoleh dengan menggunakan beberapa
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 329
metode ekstraksi, dan diikuti dengan analisis tingkat positif palsu
tanggapan. Pendekatan ini telah digunakan untuk mengembangkan ekstraksi umum
protokol untuk dimanfaatkan dalam penggalian konstituen tanaman untuk in vivo atau in vitro
screening biologis (18,19) (Gambar. 1). Protokol ini terdiri dari ekstraksi awal dengan maserasi dengan
MeOH, diikuti oleh konsentrasi di bawah vakum
dan serangkaian langkah-langkah partisi yang berfungsi untuk '' Defat '' ekstrak pertama,
menghapus minyak dan lilin, alkanol rantai panjang, karotenoid, dan konstituen nonpolar lainnya,
termasuk beberapa aglikon sterol tanaman dan nonpolar
triterpenoid. Langkah partisi kedua menghilangkan konstituen polar, seperti
sebagai gula dan flavonoid yang sangat glikosilasi dan triterpenoid. The CHCl3
Lapisan ini kemudian dipartisi dengan larutan 1% -NaCl untuk menghapus
tanin (tanaman polifenol). Ekstrak CHCl3-larut yang dihasilkan pada dasarnya bebas dari tanin, dan dapat
digunakan dalam skrining primer terhadap varietas
jalur sel, dalam sistem vivo, dan tes berbasis enzim-. Untuk menguji sistem ini, telah ditetapkan bahwa
ekstrak CHCl3 disiapkan dengan cara ini mempertahankan sebagian besar aktivitas biologis sampel
tanaman, kecuali untuk
Kegiatan karena tanin nabati atau senyawa yang sangat polar atau nonpolar
yang cenderung tidak akan menjanjikan kandidat untuk pengembangan obat (18,19).
2.3.5. Persiapan Enriched Ekstrak
Ketika konstituen fitokimia tertentu atau kelas senyawa adalah menjadi
target investigasi, prosedur ekstraksi spesifik mungkin
digunakan untuk menghasilkan ekstrak diperkaya dalam konstituen yang menarik. Di
beberapa kasus, polaritas solusi dapat dimodifikasi untuk menyebabkan kelas senyawa tertentu untuk
mengendapkan, meninggalkan senyawa yang tidak diinginkan di
larutan. Senyawa yang mengandung amina primer, sekunder, atau tersier,
asam karboksilat, lakton, dan fenol dapat selektif diekstrak menggunakan
modifikasi pH untuk memanipulasi polaritas / kelarutan senyawa
bunga. Dianjurkan untuk menguji stabilitas senyawa sasaran pada
skala kecil sebelum mengajukan sebagian besar dari sampel tanaman atau
ekstrak kasar ke salah satu teknik yang berpotensi merusak ini.
Gambar 2 menunjukkan prosedur untuk mengisolasi campuran saponin mentah
(Yaitu, steroid atau glikosida triterpen). Bahan tanaman yang dihilangkan lemaknya dengan
n-heksana, dan diekstraksi dengan MeOH. Ekstrak MeOH terkonsentrasi
di bawah vakum, dan tersuspensi dalam air deionisasi (presaturated dengan
n-butanol) dan dipartisi dengan n-butanol. Dietil eter ditambahkan ke
partisi butanol untuk mengendapkan fraksi saponin (20). selektif
ekstraksi dan fraksinasi dari sterol (termasuk sapogenins, bufadienolides, dan glikosida jantung)
menggunakan manipulasi kimia dan
330 Jones dan Kinghorn
Gambar. 1. Prosedur umum untuk mempersiapkan ekstrak mewakili berbagai polaritas, termasuk ekstrak
kloroform hampir tannin-bebas (19).
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 331
pelarut / solvent partisi telah dijelaskan (21). Non-alkohol bisa
lepas dari alkohol dengan partisi antara anhidrida ftalat air dan pelarut organik. Alkohol partisi ke dalam
lapisan air sebagai
setengah-phthalates dan dapat diregenerasi dengan perlakuan dengan sodium
metoksida di MeOH. sterol keton yang mengandung dapat dipisahkan dari
Gambar. 2. prosedur fraksinasi Umum untuk mendapatkan endapan minyak mentah
saponin dari tanaman, diadaptasi dari literatur ( 20).
332 Jones dan Kinghorn
non-keton oleh partisi antara lapisan organik dan berair dengan
reagen hydrazide Girard (H2N.NH.CO.CH2.NR3þCl), dan keton
dapat diregenerasi dengan hidrolisis asam (21).
Alkaloid mengandung amina dasar dapat selektif diekstraksi menggunakan
versi modifikasi dari klasik '' asam basa shakeout '' metode (Gambar. 3).
Gambar. 3. Prosedur umum untuk mendapatkan ekstrak alkaloid dari tanaman mentah
materi (22).
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 333
asam mineral dan basa kuat harus dihindari dalam penggalian alkaloid
(Dan bahan tanaman pada umumnya) karena risiko pembentukan artefak
(22,23) (Lihat Sub Pos 2.4.). Skema ekstraksi alkaloid diuraikan
mempekerjakan asam tartarat dan Na2CO3 untuk memodifikasi pH selama partisi.
Pertama, pH disesuaikan untuk setidaknya dua unit di bawah nilai pKa dari
amina dasar ini, menyebabkan mereka untuk membentuk garam, dan dengan demikian untuk partisi ke
lapisan air (bersama dengan konstituen polar, termasuk kuartener
amina dan alkaloid N-oksida). Konstituen nonpolar partisi ke
lapisan organik. Setelah penghapusan lapisan organik, lapisan berair
dibuat dasar, memproduksi bentuk bebas-dasar alkaloid dasar. Atas
partisi dengan pelarut organik segar, alkaloid ini mendukung organik
lapisan, menghasilkan fraksi alkaloid hampir murni, dengan pengecualian
N-oksida dan amina kuartener, yang akan tetap berada di air yang
lapisan. Skema ekstraksi ini juga dapat dimodifikasi untuk digunakan dengan seri
dari partisi langkah, menggunakan solusi semakin asam, sebesar
untuk gradien pH untuk ekstraksi netral (atau sedikit asam) untuk semakin
alkaloid dasar. Alkaloid juga dapat diekstraksi dengan 10% asam -acetic di
EtOH, diikuti oleh konsentrasi di bawah vakum untuk seperempat volume asli dan pengendapan fraksi
alkaloid mentah dengan tetes demi tetes
penambahan NH4OH (24). Atau, bahan tanaman mungkin pertama menjadi
dibasahi dengan basis encer (NaHCO3, Na2CO3, atau solusi CaCO3), diikuti oleh perkolasi atau maserasi
dengan pelarut organik nonpolar.
Sebagian besar senyawa yang mengandung gugus fungsional asam karboksilat
lipofilik di hadapan larutan asam dan hidrofilik dalam
Kehadiran solusi dasar, meskipun tingkat lipophilicity atau hidrofilisitas dimodifikasi oleh sifat sisa
molekul. Demikian pula,
polifenol sering bisa dihapus dari ekstrak organik dengan partisi
dengan basis berair (sekitar pH 12,0). Berair alkali juga meningkatkan
Karakter hidrofilik dari aglikon flavonoid yang memiliki fenolik bebas
kelompok. Salah satu metode untuk mengekstraksi flavonoid polaritas rendah dan antosianin dari
permukaan daun atau kelopak bunga adalah untuk menghancurkan bahan tanaman segar
dalam larutan 1% HCl di MeOH (25) (Untuk ekstraksi flavonoid lainnya
metode, lihat Sub Pos 2.3.6.).
2.3.6. Ekstraksi air
Meskipun obat tradisional sering disiapkan oleh ekstraksi air
sebagai infus (seduhan air panas atau dingin) atau decoctions (penggalian di
air mendidih), banyak peneliti memilih untuk tidak bekerja dengan air
ekstrak. konstituen larut dalam air tantangan hadir untuk konvensional
334 Jones dan Kinghorn
metode isolasi seperti kromatografi silika gel, dan air tidak
pelarut ideal untuk ekstraksi banyak konstituen tanaman biologis aktif. ekstrak air sulit untuk
berkonsentrasi pada rotary evaporator
karena titik didih yang relatif tinggi air dan permukaan yang tinggi
ketegangan. Air istimewa ekstrak senyawa polar, meskipun beberapa
seolah-olah senyawa hidrofobik juga diekstraksi karena cosolubility, dan karena polaritas air berkurang
agak di tinggi
suhu. ekstraksi air panas dari Silybum marianum benih oleh maserasi dalam air pada 85C ekstrak secara
proporsional lebih dari konstituen polar,
taxifolin dan silycristin. Air pada 100C, bagaimanapun, ekstrak proporsional
lebih dari kurang-polar senyawa, silybinins A dan B (26). Encer
ekstrak dapat beku kering dan kembali diekstraksi dengan serangkaian pelarut di
urutan meningkatkan polaritas (27).
2.4. Artefak ekstraksi
Sebagian besar pelarut yang digunakan dalam ekstraksi bahan tanaman telah terlibat dalam
pembentukan artefak, baik secara langsung atau karena pelarut yang umum
kotoran. prosedur ekstraksi tertentu juga dapat menyebabkan pembentukan artefak. Selain contoh-
contoh spesifik yang mengikuti, Middleditch (28) memiliki
disusun pengobatan rinci subjek artefak analitis di
kromatografi. Phillipson dan Bisset (29) Melaporkan brucine itu dan
strychnine dibentuk Bromochloromethane dan DCM adisi selama ekstraksi dari spesies Strychnos, dan
menyimpulkan bahwa jejak HCl dan DCM
dalam CHCl3 digunakan untuk ekstraksi bereaksi dengan alkaloid untuk membentuk artefak. Fosgen
(CoCl2), senyawa reaktif dan beracun bahwa bentuk-bentuk cepat
dari dekomposisi CHCl3 di hadapan udara dan cahaya, adalah diketahui
bereaksi dengan alkaloid, terutama mereka dengan kelompok amino sekunder
(30), Dan fosgen dapat menggabungkan dengan alkohol seperti MeOH, EtOH,
dan isopropanol dan bereaksi dengan amina membentuk metil, etil, atau isopropil
karbamat (31,32). Beberapa metode telah dijelaskan untuk penghapusan
dari fosgen dari kloroform (lihat Catatan 14). DCM tidak mudah membentuk
fosgen; Namun, ekstraksi DCM tablet dari siproheptadin hidroklorida ditemukan untuk menghasilkan
aduk N-klorometil, menyarankan
potensi reaksi analog terjadi dengan senyawa lain di pabrik
ekstrak (33). MeOH dapat langsung membentuk metoksi yang mengandung gugus artefak dengan
bertindak sebagai nukleofil dengan senyawa yang mengandung, kelompok karbonil b-tak jenuh, seperti
dalam kasus dari sejumlah kecil cincin-A
methoxylated withanolide artefak dari bagian aerial Physalis
philadelphica (tomatillo) baru-baru ini diisolasi dan struktural ditandai
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 335
di laboratorium kami (34). Penggunaan ammonium hidroksida dengan aseton mungkin
menghasilkan artefak yang memberikan respon positif palsu dalam penyaringan alkaloid
tes (35).
Senyawa yang mengandung proton asam di pusat kiral rawan
pembentukan artefak, bahkan di bawah kondisi dasar yang relatif ringan. Sebuah klasik
Contohnya adalah racemization dari (-) - hyoscyamine bawah biasa '' asam-basa
kondisi shakeout '', tapi kelas lain dari senyawa juga rentan
untuk dasar-katalis modifikasi. Misalnya, lignan mengandung tegang
cincin lakton mungkin epimerize di bawah kondisi dasar, seperti yang telah dicatat
untuk konversi podophyllotoxin untuk picropodophyllin dan lainnya
lignan terkait dengan podofilum di hadapan organik atau anorganik
dasar (36).
Selain mengambil langkah-langkah untuk mengurangi risiko pembentukan artefak, itu adalah
penting untuk mengenali fitur struktural yang menunjukkan bahwa senyawa
terisolasi dalam kondisi tertentu mungkin artefak. Dianjurkan untuk mempertahankan
sampel dari bahan tanaman asli untuk analisis dalam kasus salah satu isolat
harus nantinya akan dicurigai sebagai artefak dari metode ekstraksi. Itu
bahan referensi dapat diekstraksi menggunakan pelarut reaktif dan ringan
kondisi, dan ekstrak yang dihasilkan dianalisis menggunakan LC-MS / MS untuk menentukan apakah
senyawa hadir dalam bahan tanaman asli (34).
3. Senyawa Mengganggu
3.1. Lemak
asam lemak telah ditemukan untuk memberikan hasil positif palsu di tes untuk
Kegiatan siklooksigenase dan dalam beberapa tes reseptor-mengikat (37,38).
uap yodium dalam ruang tertutup akan mengungkapkan lipid sebagai bintik-bintik coklat. Lain
umum kromatografi lapis tipis (TLC) reagen yang sesuai
untuk mendeteksi asam lemak disajikan di Bab. 4. Ekstrak di mana lemak
Asam dianggap komponen utama dapat dianalisis dengan 1H-NMR
spektroskopi untuk menentukan apakah sinyal karakteristik untuk asam lemak
yang hadir. Dalam spektrum 1H-NMR mereka, intens, puncak luas di sekitar.
d 1,2-1,4 (methylenes alifatik) diamati, dan sinyal yang lebih kecil di sekitar
d 5.3 (olefin methines) dan d 0,9 (metil terminal) sering jelas (39).
Kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS) dukungan analisis adalah
juga berguna dalam hal ini, karena banyak asam lemak umum ionisasi di negatif
mode. Biasanya mungkin untuk menyimpulkan mana asam lemak utama yang hadir dengan
pemeriksaan berat molekul komponen utama dan oleh
dibandingkan dengan standar otentik (40). Kromatografi gas-massa
336 Jones dan Kinghorn
spektrometri (GC-MS) dapat digunakan untuk mengidentifikasi asam lemak dalam campuran,
tanpa perbandingan langsung dengan standar (39).
Selain metode yang disebutkan di atas, asam lemak dan lipid lainnya
konstituen dapat dipisahkan dari komponen ekstrak lebih polar oleh
kromatografi cair-vakum (VLC, lihat Bab. 5) menggunakan petroleum eter
atau n-heksana sebagai eluen silika gel. Dalam beberapa kasus, akan lebih mudah untuk menggunakan
fase terbalik kolom kromatografi atau kartrid ekstraksi fase padat untuk menghapus lemak dan lilin dari
sampel. Bahan hidrofobik umumnya akan dipertahankan sampai dicuci dari kolom dengan kuat
eluen, seperti fase gerak yang terdiri dari 100% pelarut organik. Sebuah teknik sederhana yang sering
efektif adalah dengan menambahkan jumlah minimal MeOH
atau MeOH-air ke lipid '' solusi, '' berlaku back-mengekstraksi
diinginkan senyawa atau senyawa. Partisi metanol kemudian dapat
ditransfer menggunakan pipet untuk wadah terpisah, meninggalkan bagian lipid
dibelakang.
3.2. Pigmen tanaman
pigmen tumbuhan yang hadir untuk berbagai derajat di banyak bagian tanaman dan
dapat mengganggu tes kimia atau biologi. Karotenoid telah
dilaporkan mengganggu deteksi penangkapan elektron, dan metode untuk
menghapus mereka dengan menyaring lebih perak alumina nitrat-diresapi memiliki
telah dijelaskan (41). Satu atau lebih dari metode berikut ini biasanya cocok untuk penghapusan klorofil
dari sampel. partisi pelarut-pelarut
antara n-heksana atau petroleum eter dan 90% MeOH (Gambar. 1) berfungsi untuk
berkonsentrasi klorofil di lapisan atas, meskipun hal ini biasanya tidak
benar-benar efektif. VLC lebih resin Diaion LH-20 telah digunakan secara efektif
di laboratorium kami untuk pemisahan klorofil dari konstituen ekstrak lainnya. resin Diaion sebelumnya
dicuci dengan aseton diseimbangkan dengan
50% MeOH dalam air deionisasi. Hal ini dapat dicapai dengan mencuci
resin beberapa kali dalam gelas kimia sebelum loading kolom atau dapat dilakukan setelah memuat resin
dalam kolom. Sampel tersebut dimuat ke
kepala kolom dilarutkan dalam jumlah minimum MeOH (atau pelarut lain yang kompatibel). Langkah
gradien digunakan untuk mengembangkan kolom. klorofil
biasanya mulai mengelusi dengan 100% MeOH, dan dapat benar-benar dicuci
dari kolom menggunakan rasio 1: 1 aseton dan MeOH. klorofil bisa
juga dihilangkan dengan bagian atas (atau berdiri dengan) arang aktif
(42), Meskipun ini membawa risiko kehilangan konstituen aktif yang penting.
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 337
3.3. Tanin sayuran
tanin sayuran yang polifenol tumbuhan yang biasa ditemukan di pabrik
ekstrak, sering dalam konsentrasi tinggi. Dua kelompok besar diakui,
yaitu poliester asam gallic dan / atau asam hexahydroxydiphenic dan
turunannya (yang disebut tanin terhidrolisis), dan proanthocyanidins (yang disebut tanin kental,
mengandung oligomer dari diol flavan
unit) (43). Banyak tanin memberikan hasil positif palsu di berbagai biologis
tes, biasanya karena kecenderungan mereka untuk membentuk kompleks nonselektif
dengan protein (termasuk enzim, reseptor, dan protein struktural)
melalui multipoint ikatan hidrogen (44). Berair dan ekstrak organik
mengandung tanin menghambat enzim, seperti topoisomerase 1 dan 2 (T-1
dan T-2), reverse transcriptase virus, dan enzim lainnya, yang mengarah ke falsepositive hasil (19,44-46).
Jika tanin dianggap bertanggung jawab
bioaktivitas diamati dari ekstrak tanaman, ekstrak dapat diuji untuk
kehadiran tanin (Sub Pos 4.4.) sebelum dan setelah pengobatan dengan
metode tannin-removal.
Untuk mengurangi jumlah tanin hadir dalam ekstrak kloroform, yang
Ekstrak dapat dicuci dengan volume yang sama dari 1% -aqueous NaCl. Itu
fase atas dibuang, dan fase kloroform dikeringkan dengan anhidrat Na2SO4. Tanin juga dapat dihapus
dari air dan
ekstrak nonpolar oleh bagian atas polivinil pirolidon (PVP) atau poliamida, kolagen, Sephadex LH-20,
silika gel, atau dengan presipitasi dengan larutan gelatin / natrium klorida (5% b / v NaCl dan w / v
gelatin 0,5%), atau
kafein (47,48). PVP / poliamida dapat digunakan dalam batch, atau dikemas dalam
Kolom kecil melalui mana ekstrak dilewatkan, dengan pemantauan
supernatan atau eluat oleh reaksi besi-klorida untuk menentukan apakah
tanin telah dihapus, meskipun metode ini bukan tanpa risiko
kehilangan konstituen non-tanin penting. senyawa fenolik juga bisa
dihapus oleh partisi dengan solusi -NaOH 1% (49).
3.4. plasticizer
Plasticizer (lihat Sub Pos 2.3.1.) Dapat mencemari pelarut, penyaring
makalah, aparat plastik, dan fase stasioner kromatografi disimpan
dalam wadah plastik. Ketika beberapa nilai dari MeOH digunakan dalam jumlah besar untuk
ekstraksi, diikuti oleh konsentrasi ekstrak, plasticizer bisa
menjadi porsi yang signifikan dari ekstrak (50). ester ftalat adalah
plasticizer mungkin yang paling mungkin ditemui. Dioctylphthalate kadang-kadang mencemari ekstrak
dari tanaman. dioctylphthalate murni adalah kuning
338 Jones dan Kinghorn
minyak yang menunjukkan aktivitas sitotoksik dilihat untuk P-388 sel leukemia limfositik murine.
Diethylhexylphthalate, dilaporkan diisolasi dari Aloe
vera, ditemukan untuk menginduksi apoptosis pada beberapa sel kanker manusia
(51). Di piring TLC, dioctylphthalate menunjukkan tempat merah muda-ungu saat
disemprot dengan asam sulfat pekat atau asam sulfat pekat /
asam asetat (4: 1), dan dipanaskan pada 110C selama 5 menit dengan Rf ¼ 0,4 (petroleum
ether / etil asetat, 19: 1) (lihat Catatan 15).
Plasticizer dapat dihilangkan atau sangat dikurangi dengan pelarut penyulingan
digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi. Petunjuk untuk membangun
alat distilasi cocok untuk pemurnian skala laboratorium pelarut
dapat ditemukan dalam teks-teks kimia praktis (52). Sebuah nyaman dan efektif
metode penghapusan plasticizer yang dapat digunakan untuk sejumlah kecil pelarut
adalah untuk '' menyaring '' pelarut menggunakan rotary evaporator. Kondensor dan mengumpulkan
labu harus bersih dan bebas dari kondensat dari pelarut lainnya.
4. Teknik untuk Deteksi fitokimia Grup di Ekstrak
Reagen skrining fitokimia dan prosedur yang disajikan dalam ini
Bagian yang cocok untuk digunakan tanpa pemisahan kromatografi. Umum
masalah yang berkaitan dengan skrining fitokimia telah dibahas secara rinci
di tempat lain (53,54). Reaksi positif tidak harus diambil sebagai bukti
kehadiran jenis tertentu metabolit sekunder karena jenis senyawa lain mungkin memberikan reaksi
positif palsu. Meskipun peringatan ini, ini
metode deteksi yang sering efektif untuk menghasilkan hipotesis tentang
apa jenis metabolit sekunder dapat hadir dalam campuran
'' Tidak diketahui, '' dan pemantauan keberadaan senyawa yang menarik.
Selain prosedur kolorimetri, penggunaan HPLC dalam analisis
ekstrak tanaman menjadi semakin penting, baik untuk metabolit
profil studi dan untuk dereplication konstituen aktif (lihat Catatan 16,
dan Chap. 12).
4.1. alkaloid
Beberapa alkaloid yang mungkin hadir dalam ekstrak tanaman mungkin tidak memberikan
reaksi positif karena keanehan struktural. Ketika berikut
reagen yang digunakan untuk skrining fitokimia, sering diinginkan untuk menggunakan
Setidaknya dua reagen yang berbeda untuk mengurangi risiko hasil positif palsu dan falsenegative
(53,55,56). metode skrining sekunder dapat digunakan
untuk mengkonfirmasi hasil positif (lihat Catatan 17). Beberapa reagen ini
dapat digunakan untuk mengendapkan alkaloid menghasilkan alkaloid semipurified
ekstrak pada regenerasi alkaloid bebas.
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 339
1. Mayer reagen-Solusi saya: melarutkan 1,36 g HgCl2 dalam 60 mL air. Solusi II:
melarutkan 5 g KI dalam 10 mL air. Prosedur: menggabungkan dua solusi dan
encerkan dengan air sampai 100 mL. Tambahkan beberapa tetes ke larutan ekstrak diasamkan
(Diencerkan HCl atau H2SO4), dan jika alkaloid yang hadir, putih untuk endapan kekuningan akan
muncul. Perawatan harus diambil untuk tidak mengganggu sistem tes,
karena endapan dapat dilarutkan kembali.
2. Dragendorff reagen-Solusi saya: melarutkan 8,0 g bismut subnitrate [Bi (NO3) 3.
H2O] di 30% b / v HNO3. Solusi II: melarutkan 27,2 g KI di 50 mL air.
Prosedur: menggabungkan solusi dan diamkan selama 24 jam, filter, dan encerkan sampai
100 mL dengan air deionisasi. Dalam larutan asam, endapan oranye-kecoklatan akan muncul. Alkaloid
dapat dipulihkan oleh pengobatan dengan Na2CO3
dan ekstraksi selanjutnya dengan dietil eter. Reaksi ini juga dapat dilakukan pada kertas filter atau di
piring TLC dengan menambahkan setetes reagen
ke tempat sampel.
3. Wagner reagen-Solusi: melarutkan 1,27 g I2 (menyublim) dan 2 g KI dalam 20 mL
air, dan make up dengan air untuk 100 mL. Prosedur: endapan coklat di
larutan asam menunjukkan adanya alkaloid.
4. Amonium reineckate-Solusi: tambahkan 0,2 g hidroksilamin ke jenuh
larutan 4% amonium reineckate {NH4 [Cr (NH3) 2 (SCN) 4] .H2O}, dan
mengasamkan dengan HCl encer. Prosedur: ketika ditambahkan ke ekstrak, endapan merah muda
akan muncul jika alkaloid yang hadir. endapan larut dalam 50% aseton,
yang juga dapat digunakan untuk senyawa rekristalisasi.
4.2. Seskuiterpen Lactone dan jantung Glikosida
Banyak senyawa yang mengandung, lakton b-tak jenuh juga dapat memberikan
reaksi positif dengan tes di bawah ini. reagen deteksi lainnya untuk lakton seskuiterpen dan glikosida
jantung dapat ditemukan dalam literatur
(21,53).
1. Kedde reagen-Solusi saya: melarutkan 2% asam 3,5-dinitrobenzoic di MeOH.
Solusi II: 5,7% KOH berair. Prosedur: tambahkan satu tetes setiap solusi untuk
0,2-0,4 mL larutan sampel, dan kebiruan warna ungu akan muncul
dalam 5 menit. Solusinya harus tidak mengandung aseton, yang memberikan mendalam
warna kebiruan.
2. Baljet reagen-Solusi saya: melarutkan 1 g asam pikrat dalam 100 mL EtOH. Larutan
II: 10 g NaOH dalam 100 mL air. Prosedur: menggabungkan solusi I dan II (1: 1)
sebelum digunakan dan menambahkan 2-3 tetes 2-3 mg sampel; reaksi positif
ditunjukkan oleh oranye untuk warna merah tua.
340 Jones dan Kinghorn
4.3. flavonoid
flavonoid tertentu dapat menyebabkan hasil positif palsu dalam tes menggunakan 3-
(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenil-tetrazolium bromide (MTT) untuk
kuantifikasi viabilitas sel. Kaempherol ditemukan langsung
mengurangi MTT untuk produk berwarna dalam sistem sel-bebas, merupakan suatu
'' Positif '' hasil yang dapat ditafsirkan sebagai mengindikasikan keberadaan sel-sel hidup (57). Reagen
bawah umumnya dijelaskan dalam diterbitkan
monograf (25,53).
1. Shinoda test-Prosedur: untuk solusi beralkohol sampel, tambahkan bubuk magnesium dan beberapa
tetes HCl pekat. Sebelum menambahkan asam,
disarankan untuk menambahkan t-butil alkohol untuk menghindari kecelakaan dari reaksi kekerasan;
senyawa berwarna akan larut ke dalam fase atas. Flavon, flavonol, derivatif 2,3-dihidro yang sesuai, dan
xanthones menghasilkan
oranye, pink, merah untuk warna ungu dengan tes ini. Dengan menggunakan seng bukan magnesium,
hanya flavanonols memberikan deep-merah untuk warna magenta; flavanon dan
flavonol akan memberikan warna pink lemah untuk warna magenta, atau tidak ada warna sama sekali.
2. Asam sulfat-Prosedur: flavon dan flavonol larut dalam terkonsentrasi
H2SO4, menghasilkan solusi berwarna kuning tua. Chalcones dan aurones
menghasilkan solusi merah atau merah-kebiruan. Flavanon memberikan oranye ke warna merah.
4.4. Polifenol lainnya
tanin sayuran secara longgar didefinisikan oleh kombinasi struktural
dan karakteristik fungsional sebagai senyawa polifenol yang mengendap
protein. Prosedur deteksi berikut diambil dari literatur
(19,58).
1. Ferri klorida-Solusi: melarutkan 5% (w / v) FeCl3 dalam air atau EtOH. Penambahan beberapa tetes
solusi untuk ekstrak menghasilkan biru, biru-hitam,
atau reaksi warna biru-hijau di hadapan polifenol. Ini bukan reagen spesifik untuk tanin, senyawa fenolik
lain juga akan memberikan positif
hasil.
2. Gelatin-garam uji-Prosedur: untuk mendeteksi tanin dalam larutan, larutkan
10 mg ekstrak di 6 ml deionisasi panas, air suling (penyaringan jika
diperlukan), dan solusinya dibagi antara tiga tabung reaksi. Untuk pertama
ditambahkan larutan 1% NaCl, dengan kedua ditambahkan 1% -NaCl dan
5% solusi -gelatin, dan untuk yang ketiga ditambahkan larutan FeCl3. Pembentukan
dari endapan dalam pengobatan kedua menunjukkan adanya tanin,
dan respon positif setelah penambahan FeCl3 ke bagian ketiga mendukung
inferensi ini (19).
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 341
4.5. sterol
Berikut ini dapat memberikan respon positif dengan senyawa lain selain
sterol. Reaksi sterol-mendeteksi tambahan telah dijelaskan dalam
literatur (21,53,59).
1. Liebermann-Burchard uji-Solusi: menggabungkan 1 mL asetat anhidrida dan
1 mL CHCl3, dan keren untuk 0C, dan menambahkan satu tetes terkonsentrasi H2SO4. Prosedur: ketika
sampel ditambahkan, baik dalam bentuk padat atau dalam larutan di CHCl3,
warna biru, hijau, merah, atau oranye yang berubah dengan waktu akan menunjukkan positif
reaksi; warna biru-kehijauan khususnya diamati untuk D5-sterol, dengan
intensitas maksimum dalam 15-30 menit. (Tes ini juga berlaku untuk kelas-kelas tertentu
dari triterpenoid tak jenuh.)
2. Salkowski reaksi-Prosedur: melarutkan 1-2 mg sampel dalam 1 mL
CHCl3 dan tambahkan 1 mL terkonsentrasi H2SO4, membentuk dua tahap, dengan merah
Warna yang mengindikasikan kehadiran sterol.
4.6. saponin
Ketika terguncang, larutan sampel saponin yang mengandung
menghasilkan busa, yang stabil selama 15 menit atau lebih. Tes tambahan
untuk saponin memanfaatkan kecenderungan mereka untuk hemolyze sel darah merah
(20,58), Meskipun kecenderungan ini dapat dihambat oleh kehadiran tanin dalam ekstrak, mungkin
karena tanin crossling protein permukaan,
sehingga mengurangi kerentanan sel lisis (60).
5. Catatan
1. tanaman herba Kecil biasanya diproses sebagai seluruh tanaman. Ini bukan
layak untuk tanaman besar, spesies terutama kayu, dan sejumlah tanaman
bagian (daun, ranting, buah, untuk beberapa nama) harus dikumpulkan, mengambil hati jangan
untuk menghancurkan seluruh pabrik. Uji hayati pendahuluan atau evaluasi kromatografi analitis skala
atau '' dereplication '' (lihat Bab. 12) dari bagian yang terpisah
mungkin menyarankan bagian prioritas tinggi untuk penyelidikan lebih lanjut. Ini adalah normal
berlatih untuk program penelitian kami saat ini pada antikanker yang diturunkan dari tanaman
agen untuk mengumpulkan sampai empat bagian tanaman anatomi terpisah, seperti profil fitokimia
yang berbeda mungkin terjadi (61). Misalnya, dalam penyelidikan baru-baru ini,
daun dan akar latifolia Picramnia (Simaroubaceae) dikumpulkan di
Peru dan diperiksa secara terpisah. Dua antrakuinon sebelumnya dikenal berada
terisolasi dari kedua bagian tanaman ini. Selain itu, glikosida antrakuinon
dan beberapa benzanthrones baru terjadi secara eksklusif di akar, sementara beberapa
sebelumnya uncharacterized anthrone- dan oxanthrone C-glikosida bisa
diisolasi dari daun tetapi tidak akar ( 62). Namun, untuk tanaman yang sama
342 Jones dan Kinghorn
bagian, kondisi habitat lokal di lokasi koleksi tampak penting. Jadi, ketika sampel dari kulit Diospyros
maritima diperoleh
dari berbagai daerah di Indonesia, naphthoquinones didominasi dalam
sampel yang dikumpulkan di Jawa Barat di permukaan laut, sementara methoxylated dan alkohol
monomer naphthoquinone didominasi dalam spesimen kedua dikumpulkan pada kira-kira 350 m
ketinggian di Pulau Lombok (63).
2. Untuk keterjaminan maksimum yang sampel teringat akan berisi sama
konstituen sebagai bahan tanaman yang dikumpulkan asli, ingatan harus
sejauh mungkin dilakukan di lokasi yang sama, pada bagian tanaman yang sama,
pada saat yang sama tahun ini. Namun, perawatan harus dilakukan untuk tidak menghancurkan
semua spesimen tumbuh di lokasi koleksi tertentu.
3. Jika obat-obatan herbal yang dipelajari, keputusan harus dibuat apakah mereka akan
dikumpulkan dari alam, yang dibeli dari toko lokal atau grosir,
ditanam di sebuah peternakan rumah kaca atau penelitian, atau diperoleh melalui kolaborasi
dengan produsen. Terlepas dari sumber, memastikan keaslian
sampel adalah penting. Seringkali, adalah mungkin untuk membeli minimal diproses
material, seperti keseluruhan atau kasar digiling root atau daun, yang dapat dikonfirmasi dengan
menggunakan karakteristik makroskopik dan mikroskopik, selain
karakteristik kimia (64,65). Monograf yang diterbitkan oleh American
Herbal Pharmacopoeia (PO Box 66809, Scotts Valley, CA 95.067) dan lainnya
organisasi (termasuk Amerika Serikat Pharmacopeia dan Formularium Nasional) menjadi tersedia untuk
daftar tumbuh obat herbal. Jika
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan tingkat konstituen aktif tertentu atau
senyawa penanda dalam produk yang tersedia secara komersial, hanya mungkin layak untuk
mengidentifikasi sumber komersial dari produk. Dalam ketiadaan
deposit spesimen voucher di herbarium, beberapa jurnal ilmiah
(Termasuk Journal of Natural Products dan Planta Medica) meminta bukti
dari identitas obat herbal melalui penyajian standar
HPLC Kromatogram menunjukkan adanya senyawa penanda dikenal.
4. Ini adalah tanggung jawab penyidik untuk memastikan bahwa izin yang diperlukan
dan perjanjian telah diperoleh, dan bahwa ketentuan di dalamnya diikuti. Contoh jenis dokumentasi
yang mungkin diperlukan
termasuk izin resmi untuk mengumpulkan di taman nasional, bukti persetujuan priorinformed saat
wawancara dilakukan sebagai bagian dari seleksi
dan proses pengumpulan, dan pembagian keuntungan perjanjian antara resmi
perwakilan dari lembaga berkolaborasi atau instansi pemerintah di
negara sumber dan dari lembaga penyidik (dan berpotensi
pihak hukum lainnya).
5. International Union for Conservation of Nature and Natural
Sumber Red Daftar Spesies yang Terancam daftar banyak spesies dianggap
terancam atau terancam, dan dapat dicari secara online (www.redlist.org,
2003 IUCN Red List of Species Terancam, diakses Mei 2004).
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 343
6. Dalam banyak kasus, itu akan diperlukan untuk berkolaborasi dengan seorang ahli botani yang
berpengalaman,
karena organ reproduksi sering hilang pada saat pengumpulan, dan
fitur steril, seperti morfologi daun, bau, dan karakteristik kulit kayu, harus
digunakan untuk identifikasi. Meskipun demikian, bahkan ahli botani terampil hanya mungkin
mampu menyelesaikan identifikasi parsial untuk beberapa spesies, di mana spesimen kasus harus dikirim
ke ahli taksonomi yang mengkhususkan diri dalam keluarga atau genus
yang dimaksud.
7. kerusakan Herbivora dan infeksi mikroba dapat menyebabkan peningkatan kadar
metabolit sekunder defensif tertentu.
8. Sebuah teknik yang efektif adalah untuk menempatkan bahan tanaman dalam kantong yang terbuat
dari longgar-menenun
muslin atau jala sintetis dengan penutupan kolor (16). Penggunaan tersebut
tas bantu dalam sampel label dan mencegah kecelakaan pencampuran sampel,
dan kain berpori memungkinkan sirkulasi udara, mempercepat proses pengeringan,
dan mencegah penumpukan panas dan kelembaban dan pertumbuhan jamur.
Tas ini dapat menyebar di tanah kering dan dapat mudah
pindah di bawah naungan, diskors dari kait, dan diangkut, yang diperlukan.
9. Berbagai pabrik cocok untuk kominusi dari bahan tanaman secara komersial
tersedia. Dalam pengaturan yang khas, bahan tanaman diperkenalkan ke dalam
ruang yang berisi satu set berputar pisau, yang memotong bahan tanaman dan TRAYEK melawan layar.
Tingkat penggilingan dikendalikan oleh
Pemilihan layar yang akan memberikan ukuran partikel yang diinginkan. Ukuran layarnya
dinyatakan sebagai jumlah lubang per inci linear (disebut '' mesh size ''), atau
sebagai diameter lubang dalam milimeter. Penggilingan untuk ukuran mesh 3 mm adalah
kompromi praktis antara peningkatan luas permukaan dan meminimalkan
dampak buruk.
10. Distilasi uap digunakan ketika senyawa bunga yang tidak stabil,
terutama dalam penyusunan aroma dan bumbu agen ( 66). SFE menggunakan
karbon dioksida sebagai pelarut ekstraksi menunjukkan janji besar sebagai '' hijau
alternatif '' metode ekstraksi konvensional, karena menggunakan pelarut pada dasarnya tidak beracun,
menunjukkan potensi minimal untuk pembentukan artefak,
dan CO2 dapat diperoleh dengan kemurnian tinggi cocok untuk produksi ekstrak foodgrade (lihat Bab. 3).
Penambahan pengubah polaritas seperti
EtOH, dan pengembangan peralatan SFE mampu menghasilkan tekanan lebih dari 600 bar, telah
memungkinkan ekstraksi beberapa senyawa polaritas menengah, tetapi senyawa polar, termasuk mereka
yang
fenolik dan kelompok glikosidik, masih kurang diekstrak ( 67). Untuk alasan ini, SFE terlalu selektif untuk
digunakan dalam ekstraksi umum bahan tanaman untuk
bioassay-dipandu isolasi.
11. percolators kaca kerucut sederhana berguna untuk jumlah bahan tanaman
kilogram atau kurang. percolators stainless steel yang berguna untuk sampel yang lebih besar
ukuran. Deagen dan Deinzer (68) Telah menggambarkan sistem cerek penapis menggunakan
344 Jones dan Kinghorn
drum 55 galon, pompa pelarut, regulasi aliran elektronik, dan sejajar
kolom pertukaran ion untuk ekstraksi skala besar alkaloid pyrrolizidine.
12. Pertanyaan tentang kapan ekstraksi selesai dapat dijawab secara empiris. Saya t
disarankan untuk mengeringkan suatu aliquot dari ekstrak. Jika sejumlah besar residu
tetap setelah pengeringan, atau jika metode deteksi kimia tertentu menunjukkan bahwa
sejumlah besar senyawa (atau kelas senyawa) yang menarik hadir, ekstraksi tambahan dapat dibenarkan,
atau mungkin perlu untuk
beralih ke pelarut yang lebih cocok.
13. Pelarut yang menghasilkan uap beracun harus dimanipulasi dalam lemari asam
atau daerah lain yang disetujui. Meskipun bau kadang-kadang indikator yang dapat diandalkan
konsentrasi udara tidak aman pelarut, batas paparan yang aman dari beberapa pelarut, termasuk
kloroform, dapat sangat melebihi tanpa
terdeteksi oleh bau (69).
14. Fosgen dapat membangun konsentrasi berbahaya dalam botol disegel dari
CHCl3 (70). Meskipun EtOH atau stabilisator lainnya biasanya ditambahkan ke
CHCl3, mereka tidak sepenuhnya efektif. Distilasi CHCl3 menghilangkan sebagian stabilizer, tetapi tidak
efektif dalam menghilangkan fosgen. fosgen
dapat dihapus dengan melewati CHCl3 lebih alumina aktif atau berdiri di atas
CaOH selama 18 jam (31). Jika diinginkan untuk menghapus kedua fosgen dan EtOH
dari CHCl3, CHCl3 dapat dipartisi dengan H2SO4 encer, dan dikeringkan
anhidrat CaCl selama 18 jam, diikuti dengan distilasi ( 71). kloroform sehingga
diperlakukan harus dilindungi dari paparan diperpanjang untuk cahaya dan udara, dan
disarankan untuk mempersiapkan hanya sebanyak yang diperlukan untuk segera digunakan, seperti
menstabilkan EtOH telah dihapus.
15. Kombinasi berikut semprot reagen phthalate-spesifik dijelaskan dalam
literatur (72). solusi semprot I: menambahkan bubuk seng ke etanol 20%
solusi resorsinol. Semprot solusi II: 2 M H2SO4. Semprotkan larutan III:
40% larutan KOH. Prosedur: semprot dengan saya, panas selama 10 menit pada
150C, semprot dengan II, panas 10 menit pada 120C, dan semprot dengan III. phthalate
ester akan muncul sebagai bintik-bintik oranye pada latar belakang kuning. spektroskopi
Data: UV Lmax 275 nm (log e 3,17), bahu pada 282 nm; 1H NMR (d,
CDC13) 7.70 (2H, dd, H-3, dan H-6 proton aromatik), 7,52 (2H, dd, H-4,
dan H-5 proton aromatik), 4.20 (4H, dd, H-10 dan H-100 residu 2-ethylhexyl), 1,2-1,8 (14H, m, CH dan
CH2s dari 2-ethylhexyl residu), 0,90 (12H,
kelompok CH3); elektron berdampak spektrometri massa (m / z) 279, 167, dan 149
(100%) (50). ion umum karena plasticizers terdeteksi di positif-ion
electrospray dan tekanan kimia spektrum massa ionisasi di atmosfer
termasuk m / z 391, yang mewakili [M þ H] þ untuk dioctylphthalate, dan m / z
550, 522, 371, dan 282 untuk berbagai plasticizer lainnya dari polyethylene dan
sumber lain (73).
16. Analisis tanaman mentah atau semipure ekstrak dengan HPLC awal penyelidikan fitokimia, atau
memang seluruh penyelidikan menjadi
Ekstraksi Metabolit sekunder Tanaman 345
biasa. Berikut ini adalah beberapa tips praktis dan pertimbangan yang
memiliki telah bekerja di laboratorium kami, tetapi dianjurkan untuk berkonsultasi dengan
pengguna HPLC alami selama pengembangan metode untuk memastikan kompatibilitas dengan sistem
spesifik yang digunakan. sampel harus dilarutkan dalam
fase gerak, atau pelarut lain yang cocok (yaitu, satu yang tidak akan membubarkan
filter, atau kolom fase diam), dan disaring melalui 0,45-mm filter.
Sebuah precolumn sangat penting untuk melindungi kolom HPLC lebih mahal,
dan precolumn harus berubah secara teratur. Jadwal penggantian
akan tergantung pada tingkat '' senyawa 'lengket' di ekstrak yang dianalisis. Hal ini sering diinginkan
untuk menggunakan teknik persiapan sampel sebelum
HPLC analisis ekstrak tanaman untuk '' membersihkan '' sampel, dan untuk mengurangi
kompleksitas sampel.
17. Sebagai prosedur penyaringan sekunder, menduplikasi pelat TLC dapat disiapkan
dan disemprot dengan reagen dua visualisasi alkaloid yang berbeda, seperti
Dragendorff dan iodoplatinate. Electrospray-ionisasi spektrometri massa
dalam modus positif dapat digunakan untuk konfirmasi kehadiran alkaloid, karena sebagian besar
alkaloid (orang-orang dengan jumlah ganjil atom nitrogen)
akan menghasilkan ion bahkan-bulat yang kuat, sesuai dengan [M þ H] ion þ,
membedakan mereka dari kelas produk alami lainnya, yang umumnya memberikan
ion aneh-integer. Jadi, jika ekstrak mengandung satu atau lebih senyawa yang
sesuai dengan pola ini, dapat disimpulkan bahwa alkaloid yang hadir. Saya t
Perlu dicatat bahwa metode ini tidak dapat digunakan untuk menyingkirkan kehadiran
alkaloid, sebagai alkaloid dengan bahkan jumlah atom nitrogen akan menghasilkan ion aneh-integer.