METODE

Dalam praktikum ini, alat yang digunakan adalah cawan petri, collection tube, elution
tube, Erlenmeyer, freezer, inkubator, jarum inokulum, mikropipet, mikrosetrifugator, spin
filter, spirtus, tabung eppendorf 1.5 mL, dan tip plastik.

Bahan yang digunakan yaitu aquabidest, bakteri Escherichia coli, dapar TE yang terbuat
dari 10mM TrisHCl dan 1mM EDTA, elution buffer, lysis solution RL, lysozyme 20 mg/ml,
media Luria Bertani (LB) cair, washing solution HS, dan washing solution LS.

Pada praktikum ini, dilakukan dua tahap untuk mengisolasi DNA kromosom. Pertama,
dilakukan persiapan suspensi bakteri Escherichia coli yang akan digunakan. Kedua,
dilakukan proses atau tahapan isolasi DNA kromosom suspensi bakteri yang telah dicuci.

Persiapan Suspensi Bakteri

Koloni bakteri Escherichia coli yang sudah dibiakan selama 18 jam diinolukasi ke dalam
media Luria Bertani (LB) cair 100 ml. Kemudian, media tersebut diinkubasi selama 18 jam
dengan shaker kecepatan 200 – 250 rpm pada suhu 37oC. Hasil suspensi bakteri yang telah
diinkubasi, dipipet 1.5ml ke dalam tabung eppendorf 1.5ml dan disentrifugasi dengan
kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Hasil dari sentrifugasi berupa supernatan dibuang lalu
ditambahkan 1 ml suspensi bakteri dan kembali disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang dan dicuci pellet atau sisa hasil sentrifugasi dengan
aquabidest, disentrifugasi 6000 rpm selama 5 menit, dan dibuang supernatannya. Pencucian
dilakukan sebanyak dua kali.

Isolasi DNA Kromosom

Hasil pencucian pellet bakteri E. coli dengan aquabidest diresuspensi dengan 100 µl
dapar TE dan 2 µl lysozyme, homogenkan campuran dengan cara pipetting. Setelah itu,
ditambahkan 450 µl lysis solution RL, dihomogenkan dengan pipetting, diinkubasi pada suhu
ruang selama tiga menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan maksimum selama satu menit.
Selanjutnya, dipindah supernatan ke dalam spin filter D dan dimasukkan ke dalam collection
tube, lalu disentrifugasi 12000 rpm selama dua menit. Dilakukan penggantian collection tube,
ditambahkan 500 µl washing solution HS, disentrifugasi 12000 rpm selama satu menit, dan
dibuang filtratnya. Ditambahkan 700 µl washing solution LS, disentrifugasi 12000 rpm
selama satu menit, dibuang filtrat, dan disentrifugasi 12000 rpm selama dua menit.
Dipindahkan spin filter ke elution tube, ditambahkan 100 µl elution buffer, diinkubasi pada
suhu ruang selama satu menit, disentrifugasi 8000 rpm selama satu menit, dan disimpan pada
suhu -20oC. Setelah diisolasi, dilakukan proses memperbanyak hasil tersebut dengan
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%.