Halaman 1

teknik korelasi secara drastis mengurangi tinggi

batas deteksi dalam waktu yang sederhana.
Lihat juga: I / Kromatografi. II / Kromatografi:
Cair: Teori Kromatografi Cair. Elektrofor-
esis: Elektroforesis kapiler.
Bacaan lebih lanjut
Engelsma M, Kok WT dan Smit HC (1990) Penentu selektif
minasi tingkat jejak fenol dalam air sungai menggunakan
modulasi konsentrasi elektrokimia. Jurnal dari
Kromatografi 506: 201} 210.
Fister JC, Jacobson C dan Ramsey M (1999) sangat sensitif
korelasi silang elektroforesis pada microdevices. Ana
Kimia litis 71: 4460} 4464.
Kaljurand M dan KuKllik E (1989) Terkomputerisasi Banyak
Masukan Kromatografi . Chichester: Ellis Horwood.
Laeven JM, Smit HC dan Kraak JC (1987) Diferensial
korelasi silang kromatografi cair kinerja tinggi
phy, metode membangun konsentrasi kecil berbeda
ferences dalam sampel asal yang sama. Analytica Chimica
Acta 194: 11} 24.
Louwerse DJ, Boelens HFM dan Smit HC (1992) Single-
kromatografi korelasi sekuens. Sebuah teknologi baru
nique untuk mengurangi batas deteksi. Analytica Chimica
Kisah 156: 349} 359.
Louwerse DJ, Smit HC dan Kaljurand M (1997) Monitor-
konsentrasi waktu yang bervariasi dalam sampel aliran oleh
kromatografi masukan ganda. Analytica Chimica
Acta 346: 285} 297.
Mars C dan Smit HC (1990) Pengantar sampel dalam
kromatografi hubungan. Aplikasi, properti dan
kondisi kerja untuk sistem injeksi baru. Ana
lytica Chimica Acta 220: 193} 208.
Smit HC, Mars C dan Kraak JC (1986) secara bersamaan
kromatografi hubungan, teknik baru diterapkan
kalibrasi dalam kromatografi cair kinerja tinggi.
Analytica Chimica Acta 181: 37} 49.
van der Moolen JN, Louwerse DJ, Poppe H dan Smit HC
(1995). Korelasi elektroforesis zona kapiler,
teknik baru untuk mengurangi batas deteksi.
Kromatografi , 40: 368.
van der Moolen JN, Poppe H dan Smit HC (1997)
Perangkat injeksi mikro mesin untuk CZE, Applica-
tion ke Correlation CZE. Kimia Analitik 69:
4220} 4225.
Kromatografi Melawan Waktu dan Kecepatan Tinggi
Kromatografi Melawan Waktu: Instrumentasi
WD Conway , Sekolah Farmasi, Negara Bagian
Universitas New York di Buffalo, Buffalo, NY, USA
Hak Cipta ^ 2000 Academic Press
pengantar
Artikel ini menyajikan gambaran singkat yang paling banyak
aspek penting dari sejarah, aparat, teori
dan praktek kromatografi arus balik
(CCC). CCC terutama merupakan teknik persiapan untuk
isolasi dan pemurnian bahan kimia pada satu mili
gram ke skala multigram. Ini telah diterapkan secara luas
ke produk alami, farmasi dan lainnya
bahan kimia organik dan anorganik organik.
Apa itu Arus Balik
Kromatografi?
Kromatografi arus balik dapat secara luas
dicirikan sebagai bentuk cair} kromatografi cair-
phy (LLC) di mana dua imis- yang saling jenuh
cairan cawan digunakan. Satu fase dipertahankan
dalam kromatografi sebagai kontinyu panjang atau
tersegmentasi tempat tidur stasioner tanpa menggunakan
matriks absorpsi; fase kedua melewati
tempat tidur stasioner dan secara efisien diseimbangkan
dengan itu baik dengan hidrodinamik atau turbulen
percampuran.
Dalam bentuk awal dari cairan} partisi cair
kromatografi diperkenalkan oleh Martin dan Synge,
di mana satu fase dipertahankan dalam matriks berpori seperti itu
sebagai tanah diatom atau selulosa, puncak yang signifikan
tailing sering terlihat dan beberapa analit hilang
adsorpsi ireversibel pada matriks pendukung. Di
CCC, fase diam dipertahankan oleh gravi-
gaya tational, inersia atau kapiler dan adsorpsi
dihalangi oleh pembangunan peralatan dari
polytetrafluoroethylene (PTFE) atau lembam lainnya, biasanya
polimer, material. Jadi analit migrasi di CCC
hanya ditentukan oleh koefisien partisi dalam
sistem dua fase dan puncak biasanya cukup
simetris.
CCC berbeda dari distribusi arus balik
(CCD) dari jenis yang diperkenalkan oleh Craig pada tahun 1940-an di
CCD yang merupakan proses terputus berdasarkan pencapaian-
posisi partisi equilibrium sebelum transfer fase,
sedangkan CCC adalah dinamika berkelanjutan atau kondisi mapan
proses yang mencirikan semua bentuk chromato-
graphy. Baik CCC dan CCD dapat menggunakan yang sama
sistem pelarut dan keduanya mencapai pemisahan berdasarkan
pada koefisien partisi, tetapi aparaturnya
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu
365

Halaman 2
Gambar 1 Migrasi arus balik cairan tak beragi dalam tabung heliks berputar
dengan ujung tertutup.
digunakan dan perawatan matematika masing-masing
prosesnya sangat berbeda.
Istilah CCC diciptakan oleh analogi dengan yang sebelumnya
Proses CCD dan dianggap keliru oleh beberapa orang
karena, seperti yang biasanya dilakukan, satu fase bersifat stasioner
dalam aparatus. Namun, ketentuan tersebut dibenarkan oleh
pertimbangan bahwa jika pengamat tinggal di keduanya
salah satu fase, tanpa referensi ke stasioner
aparat, akan terlihat bahwa fase bergerak masuk
mode arus balik. Memang mungkin untuk bisa
tually memindahkan kedua fase dalam arah yang berlawanan tetapi itu
kemudian perlu untuk merujuk pada proses oleh redun-
dant istilah seperti CCC 'sejati' atau CCC 'ganda'.
Aparat
Perangkat yang hari ini mungkin disebut berlawanan
kromatografi dideskripsikan sedini tahun 1930-an
dan digunakan untuk memisahkan zat lipofilik seperti itu
sebagai vitamin yang larut dalam minyak. Namun, era modern
CCC dimulai pada pertengahan 1960-an ketika Yoichiro Ito ob-
disajikan jika dua cairan tak bercampur ditempatkan
bagian berlawanan dari koil heliks tertutup dan kumparan
diputar pada sumbunya, cairan mengalir menjadi satu
lain dalam mode berlawanan ( Gambar 1 ). Kapan
ditempatkan pada antarmuka awal, komponen individu
contoh dari sampel yang dapat larut bermigrasi pada tingkat yang berbeda
ditentukan oleh koefisien partisi relatif mereka, K ,
dalam sistem dua fase. Jika K , misalnya, didefinisikan
sebagai konsentrasi dalam fase yang diarsir dibagi dengan
centrasi dalam fase tak teduh ditunjukkan pada Gambar 1
maka komponen dengan K lebih tinggi dari kesatuan akan mi-
parut ke kanan, sementara mereka dengan K kurang dari satu
akan bermigrasi ke kiri, dan mereka dengan K sama dengan satu
akan berkonsentrasi dalam sebuah band di antarmuka awal. Ito’s
aparatus CCC pertama menghasilkan arus balik yang nyata
mengalir dan ditunjukkan untuk memisahkan campuran yang larut
tures of dyes and proteins in organic} aqueous
sistem, dan juga eritrosit sebagai contoh
partikulat yang partisi dalam dua fase berair
sistem polimer.
Ketika ujung kumparan dibuka, sistem
menyerupai pompa sekrup Archimedes dan keduanya
fase bermigrasi ke arah yang sama menuju apa
disebut ujung kepala helix. Arah yang sebenarnya
aliran tergantung pada wenangan, kiri atau kanan, dari
koil dan arah putarannya, dan akan menjadi
menuju sisi kanan dari contoh yang ditunjukkan di
Gambar 1. Sekarang, jika salah satu dari fase dipompa
ke ujung kanan kumparan berputar pada Gambar 1,
menciptakan aliran head-to-tail dari fase gerak, yang
fase lain, mencoba mengalir ke arah kepala,
akan terhambat oleh kekuatan kental dan sangat stabil
ekuilibrium akan terbentuk di mana 40 hingga 60% dari
fase yang tidak digantikan akan tetap berada di kolom sebagai
fase diam. Komponen intro- sampel
dikurangkan sebagai bolus dalam fase gerak akan dipartisi
antara fase gerak dan fase diam
dan dielusi dari kumparan pada ujung ekor agar
koefisien partisi mereka. Proses ini persis
analog dengan kromatografi partisi kolom konvensional-
graphy. Seperti dalam bentuk kromatografi lainnya
diinginkan untuk menentukan koefisien partisi sebagai
K"Cs/Cm
dimana C mewakili konsentrasi dalam stasioner
(C s) dan mobile (C m) tahap, masing-masing. Kemudian sub-
kuda-kuda dengan koefisien partisi yang lebih tinggi akan kembali
lebih lama berada di kolom.
Instrumen geometri
Ito dan rekan telah menemukan banyak cara
kumparan heliks heliks atau heliks dari tabung dapat
diputar sehubungan dengan bidang gravitasi dan inersia
untuk mencapai retensi yang baik dari fase diam sementara
meminimalkan band menyebar dan mempromosikan efisien
transfer massa zat terlarut. Beberapa akan dijelaskan di sini
berdasarkan signifikansi historis atau praktisnya.
Horizontal W ow-melalui koil planet centrifuge The
perilaku yang baru saja dijelaskan di 'Aparatur' di atas adalah itu
diproduksi oleh aliran horizontal melalui planet kumparan
centrifuge (HFTCPC), pertama kali dijelaskan pada akhir
1970-an. Gerakan khasnya ditampilkan dalam
Gambar 2B . Perangkat biasanya terdiri dari beberapa
heliks single-layer yang dibentuk oleh berliku PTFE tubing,
mengukur diameter internal beberapa milimeter, pada
batang sekitar 12 mm diameter dan panjang sekitar 40 cm,
dan memasang beberapa di antaranya, terhubung secara seri, di
pemegang kolom silinder. Pemegang itu diarahkan untuk
putar pada sumbunya sendiri, dua kali di setiap orbit, seperti itu
berputar di sekitar poros pusat atau matahari. Pemisahan
366
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu

Halaman 3
Gambar 2 Ilustrasi skematik dari (A) tetesan kromatografi berlawanan arah, (B)
horizontal flow-through coil planet centrifuge,
(C) multilayer coil planet centrifuge, (D) sentrifugal droplet kromatografi
berlawanan atau kromatografi partisi sentrifugal
grafik, (E) CCC lintas-sumbu dan (F) kopral lintas-sumbat lateral CCC.
biasanya membutuhkan 10 jam atau lebih. HFTCPC
tidak sukses komersial pada saat itu, tetapi
konfigurasi telah muncul kembali sebagai kolom opsional
konfigurasi dalam beberapa kecepatan tinggi yang baru-baru ini dijelaskan
Aparat CCC.
Kromatografi putaran droplet sebelumnya
tahun 1970-an, Ito dan rekannya menggambarkan
teknik CCC sentrifugal yang disebut droplet countercur-
sewa kromatografi (DCCC). Seperti yang diilustrasikan
Gambar 2A dengan fase berat bergerak, itu terdiri dari
sekitar 300 tabung gelas, 1,8 mm, terhubung secara seri
dengan tabung PTFE sempit-bore. Entah fase bisa
seluler. Tekniknya, bagaimanapun, terbatas pada sol-
sistem ventilasi yang membentuk tetesan. Itu mengandalkan gravitasi
untuk pemisahan fase dan sangat lambat, membutuhkan 60
atau lebih banyak jam untuk pemisahan yang khas. Meskipun
keterbatasan ini, itu berhasil dipasarkan dan
secara luas dipekerjakan oleh ahli kimia produk alami;
tekniknya masih tersedia hari ini.
Multilayer coil planet centrifuge Kumparan multilayer
planet centrifuge (MLCPC) dijelaskan oleh Ito dan col-
liga pada awal 1980-an adalah salah satu yang paling serbaguna
dan instrumen yang banyak digunakan. Versi itu tersedia
dapat mendunia dari beberapa perusahaan. Itu ditunjukkan
secara skematik pada Gambar 2C, di mana koil heliks berada
terlihat terdiri dari beberapa lapisan luka tubing
konsentris pada pemegang kolom, yang lagi
berputar dua kali pada porosnya di setiap orbit. The forcefield
bertindak pada kumparan sangat berbeda di sini dari itu
diperoleh dalam konfigurasi eksentrik (Gambar 2B)
baru saja dijelaskan. Jari-jari orbital, R , biasanya
sekitar 10 cm dan frekuensi orbital biasanya
sekitar 800 rpm. Koil ini terdiri dari sekitar 10 hingga 16
lapisan tubing PTFE, 2} 3mm id, luka di
spool 5 cm atau lebih lebar, dimulai dari radius r dari
sekitar 5 cm (setengah dari R ) hingga maksimal 8 atau 9 cm.
Berliku sebenarnya bukan spiral seperti yang ditunjukkan
Gambar 2C, tetapi terdiri dari beberapa back-dan-
lapisan heliks sebagainya biasanya diperoleh dengan cara berliku
pipa fleksibel pada spul. Spool selebar 5 cm dan
Diameter 17cm mungkin mengandung sekitar 130m dari
tubing 1,68 cm dengan id, dengan total volume sekitar
300 mL.
The forcefield yang diperoleh dalam MLCPC menghasilkan
pola pencampuran unik di mana fase dalam
bagian luar kumparan dipisahkan sebagai
lapisan tric dari fase bergerak dan fase diam,
lapisan yang lebih berat diarahkan ke luar. Di sisi lain
tangan, di segmen bagian dalam kumparan,
terdiri sekitar sepertiga dari volume kumparan, yang
fase cukup kuat dicampur. Campuran dinamis ini-
pola ing tidak bergantung pada aliran fase bergerak
tingkat dan karena seluruh gulungan berputar melalui
mencampur zona sekitar 13 kali setiap detik, sangat bagus
transfer massa terlarut diperoleh. Perpisahan khas
diperoleh dari 2 hingga 6 jam dalam gulungan 300 mL dan
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu
367

Halaman 4
pemisahan lebih cepat diperoleh, dengan beberapa kerugian
resolusi, dalam gulungan yang lebih kecil. Resolusi digulirkan
di MLCPC dengan retensi stasionernya yang sangat tinggi
fase, sering 80% dari volume kumparan. Sebuah fea- unik
mendatang semua peralatan CCC bergaya Ito dikembangkan sejak itu
sekitar tahun 1980 adalah kurangnya segel yang berputar. Karena
sistem roda gigi yang digunakan untuk memutar kolom,
aliran influen dan efluen membawa cairan dari
instrumen eksterior ke kumparan berputar menggunakan
disebut skema antitwisting, yang tidak melibatkan
segel berputar, dengan demikian menghindari kebocoran, panas lokal-
ing dan kontaminasi yang terkait dengan segel tersebut.
Aparatur tersedia berisi satu, dua atau tiga
kelos pada rotor tunggal dan beberapa instrumen
beberapa gulungan tersedia dalam satu kumparan tunggal. Ini
dapat dioperasikan secara mandiri atau dalam pembuatan seri
MLCPC salah satu dari jenis CCC yang paling serbaguna
aparat.
Kromatografi partisi Certrifugal Salah satunya
beberapa jenis instrumentasi CCC modern dikembangkan
di luar laboratorium Ito dirancang oleh Murayama
dan rekan kerja di Sanki Engineering (Jepang) dan
diperkenalkan pada awal 1980-an. Itu ditunjuk sim-
lapis sebagai kromatografi tandingan sentrifugal
dan hari ini biasanya disebut sebagai sentrifugal
tion chromatograph (CPC). Beberapa hasil kebingungan
dari penggunaan akronim BPK karena digunakan secara luas
untuk mewakili centrifuge planet koil dalam gaya Ito
kromatografi. Secara konseptual tekniknya
telah dideskripsikan sebagai tetesan droplet sentrifugal
kromatografi (CDCCC, lihat Gambar 2D). Ini de-
kitab suci didasarkan pada model awal
atus, yang terdiri dari serangkaian kartrid
fluoroplastic di mana serangkaian silinder dibor
bilik dihubungkan oleh alur kecil, super-
secara resmi menyerupai DCCC gravitasi yang lebih besar
paratus. Kartrid dihubungkan secara seri dan berputar
dengan kecepatan tinggi di rotor, yang masuk dan keluar jalur
terhubung melalui segel berputar. Aparatus
dapat diisi dengan satu fase dan, ketika diputar,
fase lain bisa dipompa. Entah itu
berat (mode menurun) atau lebih terang (mode naik)
fase bisa dipompa melalui. Di versi selanjutnya dari
aparatus, bilik dan lorong adalah
dibentuk dengan mengetsa mereka di permukaan pasir-
rerata tumpukan pelat rotor. Meskipun digambarkan sebagai
bentuk kromatografi tetesan, droplet yang sebenarnya
formasi mungkin tidak memainkan peran utama dalam transfer massa
karena banyak sistem pelarut berfungsi dengan baik di BPK
yang tidak membentuk tetesan di aplikasi gravitasi
ratus. Peralatan kadang-kadang dicirikan sebagai
sistem statis, yang bertentangan dengan sistem dinamis, sejak
pencampuran dan transfer massa tergantung pada cham-
desain ber dan pada laju aliran fase bergerak; percampuran
efisiensi meningkat dengan meningkatnya laju aliran. Iklan-
Keuntungan CPC adalah unit dengan volume sangat besar
dapat dibangun karena tidak tunduk pada
masalah getaran yang terkait dengan planet koil
sentrifugal.
Sumbu silang dan kopral CS lateral yang terlantar
Sejak sekitar tahun 1989, Ito dan rekannya telah menerbitkan
banyak makalah tentang kromatografi digambarkan sebagai
sumbu silang, sumbu X atau sumbu silang yang digantikan lateral
kromatografi (XL). Sulit untuk mengilustrasikan ini
tanpa model tiga dimensi, tetapi sebuah upaya
telah dibuat untuk menunjukkan kepada mereka secara skematis
Gambar 2E dan F. Pada unit X-axis, sumbu kumparan adalah
cukup dimiringkan 903, atau dilintasi terhadap matahari
sumbu. Di unit CCC sebelumnya (Gambar 2B dan C),
sumbu ini paralel. Di unit XL, kumparan adalah
semakin mengasingkan jarak L di sepanjang planet ini
sumbu dari posisi X pusat , di mana surya
Sumbu terletak pada bidang rotasi kumparan.
Efek memiringkan kumparan adalah untuk memperkenalkan ketiga
komponen dimensi ke medan perang. Dalam paral-
unit lel shaft (Gambar 2B dan C), vektor forcefield
semua terletak pada bidang rotasi dua dimensi
gulungan. Tapi perpindahan X dan XL diperkenalkan
vektor gaya dalam bidang sumbu vertikal atau matahari. Ini
perubahan memiliki efek yang signifikan dalam meningkatkan fase
mencampur fenomena dan efisiensi kolom. Ini adalah
sangat penting untuk sistem pelarut kental
seperti sistem polimer dua fase berair dari
polietilena glikol-garam dan polietilen glikol-
tipe dekstran. Sistem ini berfungsi buruk di
HFTCPC dan bahkan kurang baik dalam sistem MLCPC.
Sistem polimer dua fase berair adalah penting-
tant untuk pemisahan protein, enzim dan bio
partikulat logis. Sayangnya, X dan XL
kromatografi secara mekanik lebih kompleks
dari instrumen sebelumnya dan belum komer-
tersedia secara cial.
Pengawas
Banyak teknisi CCC hanya mengumpulkan pecahan dan
pantau komposisi mereka dengan kromatografi lapis tipis-
graphy (TLC). Limbah kolom sering bisa
terus dipantau oleh spektra absorpsi UV
fotometri. Interferensi utama dengan pemantauan
adalah kecenderungan tetesan mobil fase diam-
masuk ke dalam sel aliran untuk menyebabkan lonjakan atau suara
mematuhi jendela sel. Masalahnya adalah mini-
dikawinkan dengan menggunakan sel aliran dengan jalur aliran vertikal
dan dengan mengalirkan fase gerak yang lebih ringan di bawah
arah lingkungan, dan fase gerak yang lebih berat di
arah ke atas. Ini cenderung menyiram tetesan
fase diam melalui sel dengan cepat. Lain
metode yang digunakan termasuk pemanasan limbah kolom
368
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu

Halaman 5
Gambar 3 Sebuah kromatogram berlawanan arah umum untuk zat terlarut dengan
koefisien partisi, K, dari 0, 1, 2 dan 3.
tepat sebelum memasuki sel monitor, atau berdarah
aliran pelarut yang dapat dicampur, seperti metanol, ke dalam
efluen kolom. Pendekatan lain menggunakan dioda
detektor array untuk memonitor kebisingan droplet di suatu area
spektrum di mana analit tidak menyerap,
seperti wilayah terlihat, dan mengurangi kebisingan,
on line, dari absorbansi pada panjang gelombang yang digunakan
untuk pemantauan. Fluoresensi dapat digunakan untuk monitor-
ing dan menyajikan masalah serupa untuk absorptiometry.
Detektor hamburan cahaya evaporatif sangat baik
untuk memantau senyawa yang tidak memiliki kromofor
dan bekerja dengan senyawa lain juga. Bergejolak
pelarut yang digunakan di CCC cukup kompatibel dengan
hamburan cahaya evaporatif selama tidak ada yang tidak mudah menguap
konstituen seperti garam atau buffer dimasukkan ke dalam
sistem pelarut. Beberapa publikasi memiliki
peared menghubungkan CCC dengan spektrometri massa dan dengan
resonansi magnetik nuklir (NMR).
Teori
Kromatografi lawan arus (CCC) biasanya
dilakukan dengan terlebih dahulu mengisi kolom saat istirahat dengan stasioner
fase, kemudian mulai rotasi dan memompa di
fase gerak pada laju alir konstan. Sampel mungkin
diperkenalkan di kepala aliran fase seluler
atau nanti. Saat ia membuat umpan pertamanya melalui kumparan,
aliran fase gerak akan menggantikan volume, V CO,
fase diam, yang akan dibawa ke dalam
kapal pengumpul. Selanjutnya, volume-fase
rasio dalam kolom biasanya stabil. Carryover ini
volume kemudian merupakan ukuran volume fase gerak
V m dan volume fase diam, V s, dapat esti-
dikawinkan dengan mengurangkan V CO dari kolom dikenal
volume V C :
V s " V C ! V m " V C ! V CO
Mengukur waktu retensi dari zat terlarut yang tidak terkandung
menyediakan sarana alternatif untuk memperkirakan V m.
Karena V s dikenal di CCC, kromatogram
dapat dijelaskan secara menguntungkan dalam kaitannya dengan
koefisien partisi centration K (didefinisikan sebelumnya sebagai
K " C s / C m" dari analit, daripada kuantitas
koefisien distribusi atau faktor retensi, k , digunakan dalam
bentuk kromatografi lainnya.
Kromatogram lawan arus dapat berhasil.
serasa dirasakan secara visual dalam hal K dan fakta
bahwa analit dengan K "1 akan selalu terelusi dengan
volume retensi sama dengan volume kolom, V C.
Volume kolom, atau waktu yang sesuai dengannya,
adalah titik fokus dari chromato countercurrent
gram dan munculnya K "1 pada titik ini
independen dari rasio volume fase. Tentu saja,
analit dengan K "0 tidak akan dipertahankan dan akan
muncul dengan fase gerak depan. Analit lainnya
dengan nilai integral K akan mengelusi beberapa kali
volume fase stasioner, atau waktu, di luar K "1 dan
posisi nilai antara dapat ditentukan
dengan interpolasi linier. Oleh karena itu, Gambar 3 disajikan
gambaran umum tentang arus balik
kromatogram analit dengan K "0, 1, 2, 3 dan itu
jelas bahwa pola elusi digambarkan oleh
persamaan:
V R " V m # KV s
dimana V R adalah volume retensi analit.
Karena laju aliran biasanya konstan, skala waktu bisa
ditambahkan atau dibayangkan. Misalnya jika Gambar 3 adalah
diperoleh dengan kolom 300 mL pada laju alir
3 mL per menit, K "1 akan muncul pada 100 menit dan
K "0 pada sekitar 30 menit. V s kemudian sesuai dengan
70 menit dan K "3 muncul sekitar 240 menit. An
analit dengan K "1.5 bisa diharapkan muncul
sekitar 135 menit. Contoh yang menunjukkan pemisahan
dari serangkaian fenilalkanol ditunjukkan pada Gambar 4 .
Pemisahan senyawa terkait erat-
litaxel dan cephalomanine dengan bentuk daur ulang
CCC ditunjukkan pada Gambar 5 . Dalam pendekatan ini, puncaknya
mengandung campuran dipisahkan dari mantan
materi yang semula di siklus pertama melalui CCC
dengan mengocok limbah yang terkandung dalam sebuah palka
tabung tubing diameter yang sama yang digunakan dalam CCC
kolom. The shunt kemudian dihubungkan kembali ke CCC
inlet dan bahan dikromatografi sedetik
waktu, dan proses shunting kembali diulang
dapatkan pemisahan yang ditunjukkan pada Gambar 5.
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu
369

Halaman 6
Gambar 4 pemisahan CCC dari campuran 10 L masing-masing benzil alkohol, 2-
feniletanol dan 3-fenilpropanol pada kumparan 24-m dari
1.68-mm PTFE, volume 56 ml menggunakan heptana sebagai fase diam dan fase
gerak 25% 2-propanol dalam air yang mengalir pada 4 mL
min \ . Direproduksi dari Conway WD, Buchert EL, Sarlo AM dan Chan CW
1

(1998) dengan izin dari Marcel Dekker.

Gambar 5 Pemisahan paclitaxel (1) dan cephalomanine (2) dengan mendaur ulang
CCC menggunakan sistem pelarut heksana / etil ace-
tate / metanol / air} 6: 4: 5: 5 (v / v / v / v) dan kolom 230 mL dari PTFE 1,6 mm
dengan fase air bergerak mengalir pada 1,7 mL
min \ . Direproduksi dari Du QZ, Ke CQ dan Ito Y (1998) dengan izin dari Marcel
1

Dekker.
Resolusi
Pengaruh V s resolusi analit juga jelas
dari Gambar 3. parameter Eksperimental yang mengubah V s,
seperti laju aliran atau kecepatan rotasi, tidak akan mempengaruhi
K "1 poin. Tapi seperti laju aliran meningkat, lebih
fase diam akan dibawa dan V m dis-
dikan akan meningkatkan ke arah kanan, penurunan V s.
Jarak V s melampaui K "1 akan bergerak ke kiri,
sehingga mengurangi resolusi antara puncak. Di
kasus ekstrim laju aliran tinggi, semua stasioner
fase akan dipaksa dari kolom dan semua puncak
akan berkumpul dan dielusi di kolom volume, atau
K "1 poin, yang menekankan pentingnya
kolom volume atau K "1 poin dalam arus berlawanan
kromatogram.
Pengukuran langsung dari resolusi, R s, dua
puncak pada kromatogram didasarkan pada definisi:
Rs"
V2!V1
0,5 ( W 2 # W 1 )
370
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu

Halaman 7
di mana V 2 dan V 1 adalah volume retensi
Puncak kedua dan pertama muncul dan W 2 dan W 1 adalah
lebar basis 4-sigma mereka diukur dalam satuan yang sama
sebagai V 2 dan V 1 . Dengan definisi ini, nilai R adalah 1,5
merupakan resolusi dasar.
Kontribusi faktor-faktor lain untuk resolusi
dalam CCC dirangkum dalam umum berikut
persamaan resolusi:
R s "0,25 (! 1) N 0,5
K1
0,5 K 1 (# 1) # (1! S F ) / S F
dimana K 1 adalah koefisien partisi dari yang pertama
sepasang puncak kromatografi muncul dan, N
dan S F adalah faktor pemisahan, kolom atau kumparan
efisiensi, dan fraksi volume kolom
ditempati oleh fase stasioner, masing-masing.
Faktor pemisahan didefinisikan sebagai:
"K2/K1
dimana K 2 adalah koefisien partisi yang kedua
puncak pasangan muncul dan selalu dihitung
lebih besar dari 1.
Efisiensi dalam lempeng teoritis didefinisikan dalam istilah
lebar dasar puncak sebagai:
N "16
VR
W1
2
dimana W 1 adalah lebar dasar 4-sigma dari puncak dan
diukur dalam satuan yang sama dengan V R.
S F , fraksi fase stasioner adalah:
SF"Vs/VC
dan ekspresinya dalam denominator dari resolu-
persamaan tion dilihat untuk mewakili volume-fase
perbandingan:
(1! S F ) / S F " V m / V s
Persamaan resolusi menegaskan visual observa-
tion dari Gambar 3 bahwa peningkatan V s akan meningkat
resolusi.
Tiga istilah dalam persamaan resolusi adalah
sekutu disebut istilah faktor pemisahan, efisiensi
istilah dan istilah besar dalam tanda kurung adalah partisi
istilah koefisien. Masing-masing dapat dievaluasi secara independen
dari kromatogram arus balik.
Istilah Istilah faktor pemisahan bergantung pada
selektivitas sistem pelarut untuk satu analit
dibandingkan yang lain. Seringkali istilah dominan memimpin
untuk pemisahan tetapi tidak dapat diprediksi dan harus
ditentukan oleh pemeriksaan empiris berbagai
sistem pelarut. Pencarian paling baik dilakukan oleh
alat non-CCC untuk mengukur koefisien partisi,
seperti kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) atau TLC atau dengan menggunakan CCC-volume kecil
umns. Keuntungan dari CCC adalah yang sangat besar
jumlah sistem pelarut tersedia.
The ef V siensi Istilah akar kuadrat ketergantungan
N menunjukkan bahwa diperlukan resolusi dua kali lipat
peningkatan empat kali lipat dalam panjang kolom, yang sering
tidak praktis karena peningkatan yang dihasilkan
backpressure dan waktu pemisahan. CCC menyediakan
hanya sejumlah kecil pelat teoritis, biasanya dalam
kisaran 300 hingga 1000, kecuali colour-bore col
umns digunakan pada laju alir rendah. Itu sebanding
untuk kromatografi flash-kolom dalam hal N. Bagaimana-
pernah, resolusi dalam CCC sering jauh lebih baik
dari karena itu mungkin diharapkan karena adanya
kontribusi yang lebih besar dan karena sangat tinggi
S F , biasanya 0,7 atau lebih, diperoleh dengan beberapa pelarut
sistem.
Partisi coef Vientity istilah Mengubah polar-
sistem pelarut untuk meningkatkan K 1 akan meningkat
resolusi, tetapi manfaat cepat berkurang sebagai
K 1 meningkat. Besarnya efek tergantung pada
S F , tetapi ketika S F adalah 0,4, 80% dari efek peningkatan
K 1 akan diperoleh ketika K 1 mencapai sekitar 4, pada
waktu retensi yang akan cukup panjang, khususnya
untuk K 2 .
Jika S F adalah 0,8, 80% dari efek peningkatan K akan
diperoleh ketika K 1 kira-kira 1, jadi lebih praktis untuk
atur kondisi sehingga S F setinggi mungkin dan
kemudian sesuaikan K dari komponen yang diinginkan ke
kisaran sekitar 1 hingga 2.
Sistem Solvent
Sistem pelarut dua fase yang sangat luas bisa
digunakan di CCC. Ini termasuk fase berair dengan
pelarut berkisar dalam polaritas dari heksana melalui
kloroform, etil asetat dan n-butanol. Partisi
Koefisien dapat dimodifikasi dengan mencampur organik
pelarut dengan satu sama lain atau dengan menambahkan suatu yang dapat
dicampur
pelarut seperti metanol, 2-propanol atau asetonitril
ke sistem. Sementara ini larut terutama di
fase berair, mereka sebagian larut dalam
fase organik, membuat sistem lebih beragam dan
menggeser koefisien partisi analit ke arah 1.
Ketika sistem menjadi terlalu campur, stasioner
fase kurang dipertahankan. Contohnya adalah 2-butanol,
yang ketika jenuh mengandung sekitar 40% air
berat. Beberapa sistem pelarut yang telah diperluas
Sively bekerja di CCC diberikan pada Tabel 1 .
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu
371

Halaman 8
Tabel 1 Sistem pelarut perwakilan untuk CCC
1. Hexane / ethyl acetate / methanol / water} 3: 7: 5: 5 (v / v / v / v)
2. Chloroform / methanol / water} 7: 13: 8 (v / v / v)
3. Chloroform / methanol / water} 4: 4: 3 (v / v / v)
4. Chloroform / methanol / water} 5: 5: 3 (v / v / v)
5. Hexane / methanol} rasio apa pun
6. Hexane / asetonitril} rasio apa pun
7. n-Butanol / air} rasio apa pun
Sistem pertama yang diberikan pada Tabel 1 berguna untuk
bahan lipofilik; sistem kloroform luas
ly digunakan untuk zat terlarut dari polaritas menengah dan
n-butanol / air adalah salah satu sistem yang paling polar
tersedia. Sistem 5 dan 6 (Tabel 1) tidak berair
sistem dan sangat berguna untuk sangat lipofilik
bahan tanpa kelarutan dalam air. Sebelum digunakan
di CCC, sistem pelarut selalu terguncang
corong pisah dan dibiarkan terpisah untuk memastikan
saturasi timbal balik dari dua fase. Sistem pelarut
dicakup secara luas di semua karya referensi
terdaftar di Bacaan Lebih Lanjut dan hanya dibahas di sini
sangat singkat.
Sistem pelarut skrining
Untuk menggunakan CCC dengan sukses perlu untuk secara empiris
mencari sistem pelarut yang sesuai menggunakan non-CCC
metode awalnya. Tujuan pertama adalah menemukan sistem itu
menyediakan K 1 hingga 2 dan yang menyediakan sampel yang baik
kelarutan dalam kedua fase . Poin terakhir ini penting-
karena kapasitas sampel akan dibatasi oleh
fase di mana sampel paling tidak larut. Dua ap
proksi untuk menyaring nilai K akan dijelaskan di sini
secara singkat.
Menggunakan TLC Persiapkan sejumlah kecil usulan
sistem pelarut bi-phasic dan partisi beberapa sampel
antara sekitar 200 L setiap fase. Spot 20 L dari
masing-masing fase berdampingan di atas pelat TLC
dan kembangkan dengan sistem TLC yang sesuai. Visual
pemeriksaan, atau lebih baik, pemindaian dengan TLC
densitometer, dari tempat terpisah untuk keduanya
fase akan memungkinkan penilaian dibuat
komponen mana yang memiliki nilai K di negara tetangga
bourhood dari 1.
Menggunakan HPLC Melarutkan sejumlah kecil sampel dalam
sekitar 500 L fase berair. Kromatografi
20 L dalam sistem HPLC yang sesuai. Kemudian setimbang
larutan berair dengan volume non- yang sama
fase berair, buang ekstrak yang tidak berair dan
lagi kromatografi 20 L dari fase berair.
Dari ketinggian puncak masing-masing, partisi coeffi-
Klien dalam sistem pelarut CCC dapat dihitung.
Karena retensi CCC hanya bergantung pada K , menggunakan
persamaan untuk V
0
, atau hanya mengacu pada Gambar 3, yang
waktu retensi yang diharapkan dari komponen sampel
dapat dihitung.
Pendekatan Kromatografi Lainnya
Zat dengan nilai K tinggi yang tidak terelusi, akan
sampai batas tertentu dipisahkan sepanjang kolom dan dapat
dipulihkan dengan menghentikan aparatus dan memompa
keluar isi kolom. Pendekatan alternatif adalah
untuk beralih fase tanpa menghentikan chromatogra-
phy. Di MLCPC, arah yang tepat untuk
memompa fase adalah kepala ke ekor untuk fase berat
dan ekor untuk menuju fase lebih ringan, jadi pendekatan ini
melibatkan berpindah saluran kolom juga. Untuk
CDCCC, arah yang terkait menurun
untuk fase berat dan ke atas untuk fase yang lebih ringan.
Namun pendekatan lain untuk memanipulasi CCC adalah untuk
mengisi kolom awalnya dengan rasio non-ekuilibrium
volume fase dengan secara bersamaan mengisi keduanya
fase sekaligus. Retensi dari nilai K tertentu bisa
ditingkatkan atau dikurangi dengan memilih yang sesuai
makan rasio fase-volume. Gradien juga bisa digunakan
untuk sejumlah sistem, terutama jika
posisi fase diam berubah sangat sedikit
polaritas fase gerak diubah.
Untuk zat asam dan basa, pengaturan pH
atau penggunaan gradien pH dapat bermanfaat. Kisaran dari
pH tidak terbatas sejauh aparatusnya
prihatin. Formasi pasangan ion dan penggunaan ion cair
penukar juga dapat dieksploitasi, dan berbagai chelat-
ing agen telah digunakan untuk pemisahan
logam, khususnya tanah jarang. Resolusi optik
telah dicapai dengan penambahan pemilih kiral
sebagian besar larut dalam salah satu fase ke
sistem pelarut.
Contoh di atas menunjukkan beberapa dari banyak
cara-cara di mana aparat CCC dapat dimanipulasi
mencapai perpisahan dengan cara selain langsung--
kromatografi lingkungan.
pH-Zone Re fi ning
Teknik CCC pengumpul zona-pH utamanya
dikembangkan oleh Weisz dan Scher bekerjasama dengan
Ito, pantas mendapat perhatian khusus karena unik
CCC. Ini berlaku untuk asam dan basa organik dan
jelas teknik pilihan untuk mendapatkan yang sangat tinggi
pewarna murni dan sampel dari kotoran yang terkandung
di dalamnya.
Untuk penjelasan yang sangat singkat itu mudah untuk dilihat
teknik sebagai semacam asam dua fase} titra- basis dasar
tion dilakukan di kolom CCC. Untuk mengilustrasikan ini,
bayangkan serangkaian asam karboksilat aromatik itu
372
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu

Halaman 9
Gambar 6 Pemisahan asam 2- dan 6-nitro-4-kloro-3-metoksibenzoat oleh CCC
pengikatan zona pH. Fase diam awal adalah 0,3%
(12 mM) asam trifluoroasetat dalam fase organik atas campuran metil t-butil eter /
asetonitril / air} 4: 1: 5 (v / v / v). Itu
fase gerak adalah 0,8% (100 mM) amonia dalam fase berair rendah dipompa pada
3 mL menit \ . Volume kolom adalah 310 mL.
1

Direproduksi dari Dudding T, Mekonnen B, Ito Y dan Ziffer H (1998) dengan izin
dari Marcel Dekker.
sedikit berbeda dalam p K a serta lipofilisitas. Khas
sistem pelarut sederhana seperti metil t-butil eter
(MTBE) dan air saling jenuh dan
fase dimasukkan ke dalam wadah terpisah. Fase organik
diasamkan dengan asam trifluoroasetat (TFA) dan
kolom diisi dengan itu sebagai fase diam. Di
latihan, baik fase dapat berfungsi sebagai stasioner
fase tetapi fase organik dipilih dalam contoh ini.
Sampel asam campuran dilarutkan, atau ditunda
jika tidak larut sepenuhnya, dalam bagian yang diasamkan
fase diam dan diperkenalkan pada inlet kolom.
Fase berair dibuat dasar dengan amonia dan
dipompa ke kolom berputar. Yang diasamkan
sampel akan larut dalam zona yang relatif kecil
diasamkan MTBE pada inlet kolom dan sebagai dasar
fase air aktif diperkenalkan akan menetralkan
bagian dari sampel, yang kemudian akan diekstraksi
ke dalam fase berair. Namun, saat bergerak turun
kolom, zona akan menghadapi lebih banyak TFA,
menjalani re-asidifikasi dan kembali ditransfer ke
fase organik stasioner. Netralisasi ini dan
Transfer akan dilanjutkan, seperti pada titrasi, pertama dengan
asam termurah p K a , dimodifikasi juga dengan lipophilicity yang
asam tertentu, mereka yang termurah p K a dan
lipofilisitas terendah bermigrasi tercepat.
Memantau eluen dengan penyerapan UV biasanya
tidak informatif, tetapi memantau pertunjukan pH
serangkaian langkah luas untuk meningkatkan pH
sampel yang sangat murni dari asam individu dengan
kotoran terkonsentrasi pada antarmuka antara
zona. Basis dapat dipisahkan dengan cara yang sama.
Teknik ini menyediakan beberapa kapasitas sampel
gram.
Contoh yang menunjukkan pemisahan dua
asam nitrochloromethoxybenzoic isomer oleh pH-
pemurnian zona disajikan pada Gambar 6 . Memantau
Absorbsi UV dari efluen hanya menghasilkan jejak yang datar,
yang tidak menunjukkan pemisahan. Namun, itu
pH efluen menunjukkan langkah-langkah yang tajam pada awal dan akhir
zona komponen. Menggunakan 310 mL-kolom dan
ukuran sampel 20 g, pemisahan menghasilkan 9 g
senyawa 2-nitro murni, 5,3 g isomer 6-nitro
dan 2 g campuran dari keduanya.
Kesimpulan
CCC modern adalah bentuk baru dari persiapan LLC itu
menawarkan lebih banyak keserbagunaan dalam pemilihan pelarut,
mulai dari sangat lipofilik hingga sedang polar atau
sistem ganic atau berair. Ini memberikan hasil yang dapat diprediksi
perilaku tention dan pemulihan sampel lengkap
karena retensi hanya bergantung pada partisi zat terlarut
Koefisien dan adsorpsi dihalangi oleh inert
sifat dari aparat. Kemampuan pemisahannya adalah
lebih ditingkatkan dengan berbagai manipulasi teknis
komposisi pelarut dan mengalir selama kromatografi-
phy, yang tidak dapat direproduksi dalam jenis lain
kromatografi. CCC telah banyak digunakan oleh
II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu
373

Halaman 10
kimiawan produk alami untuk isolasi dan pemurnian
kation bahan bioaktif yang tidak stabil dari kompleks
Matriks. Teknik ini layak mendapat perhatian lebih dari
kimia analitik dihadapkan dengan pemisahan
campuran kompleks, kimiawan sintetis yang menghadap purifika-
tion produk non-kristal, diastereomer atau op-
Resolusi tical rasemat, dan kimia fisik
mencari pendekatan baru untuk mempelajari interaksi pelarut
tindakan atau pengukuran sifat kimia
seperti koefisien partisi atau konfigurasi disosiasi
stants. Melanjutkan studi tentang aplikasi baru CCC
di beberapa laboratorium, serta komersial
pengembangan aplikasi yang lebih dapat diandalkan dan mudah digunakan
paratus, berjanji untuk memperpanjang penggunaan CCC di
masa depan yang bisa diduga.
Sastra CCC
Referensi untuk aplikasi CCC ditemukan melalui-
keluar literatur produk analitis dan alami dan
dalam monograf yang dikutip di bawah ini. Sejumlah besar
referensi ditemukan dalam Journal of Chromatography
dan dalam Jurnal Kromatografi Cair dan
Teknik Terkait , banyak yang dikumpulkan di
edisi khusus berkala jurnal-jurnal ini, yang terakhir dari
yang berisi lebih dari 20 artikel. Daftar sebelumnya
masalah khusus dapat ditemukan di Conway (1995).
Lihat juga: III / Alkaloid: Kecepatan Arus Tinggi
Kromatografi. Antibiotik: Pengendali kecepatan tinggi
sewa Kromatografi. Pemisahan kiral: Countercur-
sewa Kromatografi. Pewarna: Kecepatan arus tinggi
Kromatografi. Analisis Ion: Pengendali Kecepatan Tinggi-
sewa Kromatografi. Produk Alami: Kecepatan tinggi
Kromatografi arus balik. Protein: Kecepatan tinggi
Kromatografi arus balik.
Bacaan lebih lanjut
Conway WD (1990) Kromatografi Melawan Waktu ,
Teori dan Aplikasi Aparatur . New York: VCH
Conway WD dan Petroski RJ (eds) (1995) Modern
Kromatografi arus balik . ACS Simposium
Seri 593. Washington, DC: American Chemical
Masyarakat.
Conway WD, Bachert EL, Sarlo AM dan Chan CW (1998)
Perbandingan kromatografi arus balik dengan
kromatografi flash. Jurnal Kromatografi Cair
phy dan Teknologi Terkait 21: 53} 63.
Du QZ, Ke CQ dan Ito Y (1998) Daur ulang berkecepatan tinggi
kromatografi berlawanan arah untuk pemisahan taksol
dan cephalomanine. Jurnal Kromatografi Cair
dan Teknologi Terkait 21: 157} 162.
Dudding T, Mekonnen B, Ito Y dan Ziffer H (1998) Penggunaan
kromatografi kromatografi arus balik pH-zona untuk
memisahkan 2- dan 6-nitro-4-chloro-3-methoxybenzoic
AC id. Jurnal Kromatografi Cair dan Terkait
Teknologi 21: 195} 201.
Foucault AP (ed) (1995) Centrifugal Partition Chromato-
graphy . New York: Marcel Dekker.
Ito Y dan Conway WD (eds) (1996) Penghitung Kecepatan Tinggi-
Kromatografi saat ini . New York: John Wiley.
Mandava NB (ed) (1998) Kromatografi arus balik.
Jurnal Kromatografi Cair dan Teknologi Terkait
nologies 21 (Edisi Khusus No 1 & 2): 1} 261.
Mandava NB dan Ito Y (eds) (1988) Melawan arus
Kromatografi , Teori , dan Praktik . New York:
Marcel Dekker.
Menet JM dan ThieHbaut D (eds) (1999) Melawan arus
Kromatografi , Chromatographic Science Series Vol
82. New York: Marcel Dekker.
Detektor: Laser Light Hamburan
RPW Scott , Avon, CT, USA
Hak Cipta ^ 2000 Academic Press
pengantar
Ada dua jenis detektor hamburan cahaya yang digunakan
dalam kromatografi cair, penghamburan cahaya menguap
tering detektor dan detektor hamburan cahaya cair.
Yang pertama menguap pelarut dari kolom
eluen dalam aliran gas dan mengukur cahaya yang tersebar
oleh partikel zat terlarut sisa; jenis detektor ini
dijelaskan di tempat lain dalam ensiklopedia ini. Kedua,
detektor hamburan cahaya cair, merasakan yang sebenarnya
molekul terlarut sendiri dengan penghamburan cahaya
pengukuran. Cairan mengandung molekul besar
seperti polimer sintetik, biopolimer, misalnya poli
peptida, protein dan polisakarida, menyebarkan cahaya
dan, menyediakan cahaya insiden yang cukup kuat,
cahaya yang tersebar dapat dirasakan dan digunakan untuk mendeteksi
kehadiran zat terlarut. Dalam prakteknya eluen kolom adalah
dibiarkan mengalir melalui sel yang dilewatinya
sinar cahaya intensitas tinggi. Sumber cahayanya
biasanya sinar laser paralel (amplifikasi cahaya oleh
374
II / CHROMATOGRAPHY / Detectors: Laser Light Hamburan