BAB II

ISI

2.1 Pengertian Blotting

Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau protein
ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau protein tersebut dapat
dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel.
Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki
kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama
pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas
diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu diazophenylthioeter (DPT).
Keuntungan teknik blot:
- Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran
dibandingkan kepada molekul yang masih berada didalam gel atau matriks.
- Reagen yang dibutuhkan lebih sedikit.
- Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum
dianalisis
- Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode
analisis yang dipakai

2.2 Macam-Macam Teknik Blotting dan Penjelasannya

2.2.1 Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini
mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu
dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada
diatas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan
diatas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap diatasnya. Buffer kemudian akan
mengalir pelan-pelan ke membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen
DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan
DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi
sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari
fragmen DNA tersebut.
2.2.2 Northern Blot
Nothern Blot merupakan teknik yang sama dengan Southern Blot, namun
menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Dalam proses ini RNA
dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian
diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan
melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam
pernyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band
ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini
umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak bahwa RNA hadir dalam
sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan pada
waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu dinyatakan dalam jaringan hidup.
 2.2.3 Eastern Blot
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud
(1982), adalah proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari
gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik. Teknik eastern blotting adalah untuk mendeteksi
modifikasi pasca-translasi protein. Protein dihapuskan ke PVDF atau membran nitroselulosa
yang diperiksa untuk modifikasi menggunakan substrat tertentu.

2.2.4 Western Blot

Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western Blot
untuk mengikuti teknik Southern Blot yang pertama kali ditemukan. Western blot adalah
proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran ini dapat
diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat
dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian
kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi
primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan
membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di ruang gelap.

2.3 Perbedaan Teknik Blotting Berdasarkan DNA, RNA, dan Protein

2.3.1 Blotting berbasis DNA
Teknik blotting berbasis DNA menggunakan teknik Southern Blot. Keuntungan
teknik ini adalah selain dapat menunjukkan integrasi gen juga dapat mengetahui jumlah
salinan DNA yang terintegrasi. Analisa Southern Blot dapat digunakan untuk mengetahui
sejumlah salinan gen dan kejadian transformasi yang berbeda serta membedakan integrasi
ekstra kromosomal dan kromosomal. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan DNA
dalam jumlah banyak dengan kemurnian tinggi serta waktu yang lama.

2.3.2 Blotting berbasis RNA

Hibridisasi Nothern merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk identifikasi
dan trakskrip RNA. RNA tidak dapat berikatan secara efisien pada membran, sehingga pada
analisis nothern digunakan suatu membran spesifik dimana RNA dapat berikatan secara
kovalen. Dalam analisis nothern, sekuen RNA spesifik dideteksi menggunakan teknik
blotting yaitu RNA ditransfer dari agarose ke membran. Hasil blotting dianalisis melalui
proses hibridisasi dengan probe RNA. RNA mempunyai bentuk utas tunggal, sehingga dapat
membentuk struktur sekunder melalui pasangan basa intramolekul, sehingga harus
dielektroforesis dibawah kondisi denaturasi. Denaturasi dilakukan dengan penambahan
formaldehid ke gel maupun loading buffer, atau perlakuan glyoxal dan dimethyl sulfoxide
(DMSO) pada loading buffer.

2.3.3 Blotting berbasis protein

Dalam blotting berbasis protein teknik analisis yang digunakan adalah Western Blot
yang merupakan metode untuk mendeteksi DNA-binding protein. Dalam metode ini, protein
dipisahkan dengan elektroforesis dan ditransfer ke suatu membran sehingga protein akan
terikat secara kovalen. Prinsip dasar western blot adalah identifikasi pemisahan protein tidak
berlabel dengan SDS gel elektroforesis polycrylamide (PAGE) yang didasarkan pada
immunoradioaktivitasnya dengan menggunakan antibodi monoklonal. Kemudian protein
ditransfer ke membran dan diberi perlakuan awal untuk mereduksi ikatan non spesifik dari
antiserum ke membran. Inkubasi membran dilakukan dengan antiserum spesifik, kemudian
diinkubasi dengan antibodi yang berkonjugasi dengan reagen pendeteksi dan berikatan pada
antiserum primer. Setelah itu diikuti deteksi dari immunoreaksi diantara antiserum primer
dan target protein spesifik.
Ringkasan Prosedur Blotting
 DAFTAR PUSTAKA

Brown, T. A. (1993). Recombination in Genetics Molecular Approach. London: Chapman & Hall.

Listonsiburian. (2012). Southern Blotting dan Western Blotting.

https://listonsiburian.wordpress.com/2012/03/28/southern-blotting-dan-northernblotting/ .
diakses pada 28 Februari 2019.