PENDAHULUAN

ELISA adalah singkatan dari “enzym linked immunosorbent assay.” Tes ELISA menggunakan
komponen dari sistem kekebalan tubuh dan bahan kimia untuk mendeteksi respon imun dalam
tubuh (misalnya, untuk mikroba menular). Uji ELISA melibatkan enzim (suatu protein yang
mengkatalisis reaksi biokimia), hal ini juga melibatkan antibodi atau antigen (molekul
kekebalan). Tes ELISA secara luas digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki sifat
antigenik, terutama protein (sebagai lawan dari molekul kecil dan ion seperti glukosa dan
kalium). Zat yang terdeteksi oleh tes ELISA termasuk hormon, antigen bakteri dan antibodi.
Metode ELISA didasarkan pada kerja immunologi yang dikombinasi dengan reaksi enzimatik,
reaksi imunologi dalam sistem ELISA adalah adanya ikatan antigen-antibodi atau sebaliknya.
Reaksi enzimatik antara enzim dan reaktan digunakan untuk menandakan adanya reaksi yang
kemudian dapat diukur secara kuantitatif berdasarkan pada perubahan warna dalam sistem.
Keunggulan metode ini adalah reaksinya yang cepat dan relatif murah jika dibandingkan dengan
metode molekuler lainnya.
Berdasarkan sistem kerja dalam reaksinya ELISA terbagi menjadi tiga kelompok
yaitu Direct ELISA, Indirect ELISA dan Sandwich ELISA. Pengelompokan tersebut didasarkan
pada kompetisi atau inhibisi dari ELISA. Direct ELISA adalah salah satu jenis ELISA yang
paling sederhana dalam reaksinya. Jenis ELISA ini hanya membutuhkan antigen, antibodi,
enzim dan substrat.
Dengan berkembangnya teknologi saat ini telah banyak tersedia Kit-ELISA yang sudah lengkap
untuk suatu pengujian antigen atau antibodi tertentu. Kit yang ada biasanya sudah ditempeli
antigen atau antibodi pada wells-nya. Dengan demikian akan lebih mudah dalam pengerjaan di
laboratorium.
Teknik ELISA sudah banyak di kembangkan di hampir seluruh laboratorium di Indonesia. Untuk
itu dalam praktikum ini telah di praktekkan beberapa prinsip dasar penerapan uji ELISA untuk
mendeteksi adanya infeksi Avian Influenza. Sampel yang diperikasa merupakan sampel yang
secara klinis di lapangan menunjukkan gejala terinfeksi oleh virus Avian Influenza Tipe A.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam
suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi
tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen
yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan
pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat
dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh
enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu.
Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid
(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan
pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk
antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi
pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat
berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang
berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan
larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat.
Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk
memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik
ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.
Dalam penelitian dengan metode ELISA didasarkan pada ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan
antibody(Ab) yang terdiri dari :
Teknik Qualitatif : Tiap berikatan pada Ag spesifik
Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.
Antibody pada elisa yaitu Antibodi yang disekresi oleh Sel Plasma (Sel B), Biasanya yang
digunakan adalah monoklonal Antibody karena lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada
policlonal
Antibodi. Dapat dibeli terpisah atau dalam paket ELISA Kit, biasanya diproduksi dengan cara
induksi respon imun humoral pada hewan coba ( rat, mouse) dengan cara injeksi Antigen
berulang, dengan dilakukan ekstraksi sel dan purifikasi Ab. Dapat juga diekstraksi dari manusia
yang telah diimunisasi dengan Ag tertentu.
Test elisa ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana,
ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.
Test ini juga memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan besar
terjadinya hasil positif palsu, karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan
antigen lain. Dan hasil negatif palsu dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period,
yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi
tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.

Aplikasi ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodI dalam suatu sampel, karenanya
merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam
serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga
bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan
seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang
toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam
suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi
tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen
yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan
pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat
dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh
enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu.
Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid
(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan
pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk
antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi
pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat
berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang
berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plateharus dicuci dengan
larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat.
Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk
memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik
ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif .
2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang
menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA
nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA
nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi
sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA
sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut
sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA
yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich, dll.
1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct
menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang
diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel
yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada
bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen
yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan
enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan
antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang
antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-
lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,
sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi.
Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan
menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.
b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada
percobaan yang berbeda.
d. Amplifikasi signal hanya sedikit.
e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan
untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody
lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.
2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT
ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya
saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibody.
ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder
spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada
sampel yang diuji.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi
dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar
yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang platemikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking,
karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk
antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik,
maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,
bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap
ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia
lainnya.

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap
terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari
metodeindirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap
protein pada sampel akan menempel pada lubang platemikrotiter, sehingga konsentrasi analit
yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada
permukaan lubang.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena
ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara
antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan
antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1
kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan
enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa
epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
3. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) SANDWICH
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang
diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen
yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct,
hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody
primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA
sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi
interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau
protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap,
sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody
sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi
keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat
kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi
terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi
dengan kedua antibody.
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang.
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/
elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas dari
hasil pengujian, antara lain :
· Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding
microtiter.
· Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya,
teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu
ELISA direct.

Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang
relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis
antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector, kemampuannya menguji sampel yang
tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan
pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat
diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang
terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya
dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua
jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda
(epitopnya harus berbeda).
Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai
teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich,
hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector
(antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut
dengan enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang
bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi antibody
streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin
(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat
akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.
5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Multiplex
Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara
simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.
6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) COMPETITIVE
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip dasar
dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang mikrotiter.Teknik
ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat berinteraksi
dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal, sehingga antibody
spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubangmikrotiter. Lalu larutan
yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel
yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter
sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang
diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas
mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak
berinteraksi dengan antibody spesifik.
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan
telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan
antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang dapat
berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim signal,
sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding mikrotiter,
kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada
dinding-dinding mikrotiter.
Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan
larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang
mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan
antibody yang diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan
dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau
antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.
Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan
antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif
juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan
telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi
dengan antigen spesifik.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal
yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap
larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang
diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan
antigen.
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:
2.3 Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa
microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non
spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan
menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang
diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen
spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila
sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa
antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga
dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas
permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada
saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya,
enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

2.4 Contoh Cara Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
a. Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan
berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein
yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody
spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik
(sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc
pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim
akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar
antibody spesifik dalam sampel.

b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein
yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk
berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope
yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim
akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar
kadarantigen spesifi dalam sampel.

Sebagai Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG :

Pada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluranTuba fallopi, sel telur akan
bergerak menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah plasenta
akan mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic gonadotropin
(hCG) pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel normal trofoblat
pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air seni.
hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat molekul total
39 kD. Subunit rantai identic dengan subunit rantai dari hLH (human Luteinizing Hormone),
hFSH (human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human Thyreoidea Stimulating
Hormone). Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG
yang sempurna dan keberadaan subunit memberi hasil yang sama pada darah dan urin, tapi tidak
pada subunit . Produksi hormone hCG akan bertambah banyak selama trimester pertama, dimana
level hCG yang sempurna mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml (1 ng
= 15 mIU).
Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan haid, yaitu
kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar hormone tersebut akan
terus-menerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak hari terakhir
menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormone hCG
sebanyak dua kali lipat setiap 3 hari.
Peningkatan kadar hormone ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang sering dialami
oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG akan menurun terus secara perlahan, dan hamper
mencapai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan pada saat
wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setalah berhubungan.Sampel
yang sigunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan menggunkan air seni yang
keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut konsentrasi hormone hCG
relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan yang dilakukan di laboratorium juga
memiliki prinsip kerja yang relatif sama, yait mendekati kadar hCG. Namun, tes darah
mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam
Rahim seorang ibu.
Perkiraan Kadar hCG dalam Darah Kehamilan Trimester kedua

Kurang dari 5 IU/L

Perempuan yang tidak hamil dan laki-laki (international units per
liter)
24-28 hari setelah haid terakhir 5-100 IU/L
IIbu
4-5 minggu (1 bulan) setelah haid terakhir 50-500 IU/L
hamil:
5-6 minggu setelah haid terakhir 100-10.000 IU/L
 14-16 minggu (4 bulan) setelah haid
terakhir 12.000-270.000 IU/L
kehamilan trimester ketiga 1.000-50.000 IU/L
Perempuan pasca menopause Kurang dari 10 IU/L

Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone hCG antara lain:
1. Analisa yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.
2. Efisien dan fleksibel: sampel yang berbeda dapat dianalisa secara stimulant dengan jumlah
cekungan uji yang fleksibel.
3. Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik berikatan dengan -
hCG.
4. Prosedur yang sederhana.
Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan sebagai test kehamilan
untuk mengetahui keberadaan janin dalam Rahim,juga dapat digunakan untuk berbagai uji
kehamilan lainnya, antara lain:
1. Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.
2. Diagnosis kehamilan yang abnormal.
3. Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.
4. Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.
5. Invertigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.
Alat tes hCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di pasaran, yaitu:
1. Berupa alat yang digunakan dengan cara memaparkannya pada aliran urin saat pertama
berkemih di pagi hari selama beberapa saat. Jenis alat ini sangat umum digunakan, karena dijual
bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikut ini adalah cara kerjanya:
a. Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul garis pada jedela berbentuk lingkaran (Jendela
control).Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja
secara benar.
b. Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis muncul pada jendela
berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone hCG dan
mununjukkan adanya kehamilan.
c. Hasil negatif: Munculnya satu garis pada jendela konttrol (berbentuk lingkaran) menandakan
bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar.
d. Hasil positif: Muncul 2 garis pada jendela control (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil
(berbentuk persegi) menandakan anda hamil
e. Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela control tidak muncul berarti tes tidak dilakukan
dengan benar.
Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter. Berikut ini
adalah cara kerjanya:
a. Mengandalkan antibody -hCG yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan -
hCG yang bebas dari sampel (urin)
b. Antibodi kelinci anti- -hCG berkonjungsi dengan horseladish peroxidase (HRP) sebagai
larutan konjugasi antibody-enzim.
c. Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan -hCG antara
fase padat denga antibody-enzim.
d. Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.
e. Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah
warna kuning.
f. Konsentrasi -hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan
dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.
2.5 Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
Ø Teknik pengerjaan relatif sederhana
Ø Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Ø Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Ø Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut
sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat
spesifik)
Ø Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
Ø Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi
monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
Ø Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
Ø Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif
yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga
antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan
menimbulkan signal.
Ø Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus
dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan
larutan untuk menghentikan reaksi).