ABSTRAK

Pengobatan infeksi yang resistan terhadap obat itu rumit dan mengkhawatirkan. Peningkatan
penyakit menular menimbulkan tantangan unik bagi perkembangan yang efektif strategi terapeutik.
Pembebasan bakteri terlarut antibiotik dari endotoksin bakteri lipopolisakarida (LPS) mungkin
memiliki efek samping yang segera mendorong syok septik pada pasien. Dalam penelitian ini,
pertama-tama kami mengkonfirmasi temuan sebelumnya yang dilingkarkan peptida antimikroba
CLP-19 memberikan aktivitas antibakteri langsung non-spesifik dengan Tidak beracun untuk sel
mamalia dan kedua mengungkapkan bahwa CLP-19 memiliki efek sinergis untuk meningkatkan
aktivitas antibakteri bakterisida konvensional lainnya (ampisilin dan ceftazidime) dan agen
bakteriostatik (eritromisin dan levofloksasin). Ketiga, Mekanisme efek antibiotik yang mendasari
kemungkinan terkait dengan rangsangan generasi radikal hidroksil. Terakhir, CLP-19 terbukti
mengurangi secara efektif pembebasan LPS secara antibiotik, melalui netralisasi langsung LPS.
Demikian, CLP-19 adalah agen terapeutik potensial untuk terapi antibiotik kombinatorial.

INTRODUCTION

Kemunculan cepat bakteri yang resistan terhadap obat membahayakan khasiat antibiotik, yang hadir

tantangan yang unik dan mengkhawatirkan terhadap perawatan klinis [1]. Terapi antibiotik yang
memadai adalah batu penjuru pengelolaan bakteri yang tepat dan pentin untuk menghentikan
evolusi bakteri dengan resistensi baru kemampuan. Namun berdasarkan intervensi terapeutik Pada
antibiotik konvensional saja tidak mencukupi dan mungkin berbahaya karena penggunaannya bisa
mempromosikan Proses patofisiologis syok septik. Walaupun Patofisiologi syok septik tidak
sepenuhnya dipahami, Hal ini mungkin karena pembebasan endotoksin dari dinding sel bakteri
selama penghancuran mikroorganisme [2]. Untuk mengatasi kendala ini, berbagai pengobatan
ajuvan Pendekatan telah dianalisis dengan cermat, mulai dari imunoglobulin intravena standar atau
antibodi antibodi endotoksin terhadap pengobatan dengan sitokin, sitokin antagonis reseptor, atau
imunomodulator; hasil, Namun, sebagian besar mengecewakan. Karena itu Pengembangan
pengobatan ajuvan baru yang tidak hanya menunjukkan efek sinergis dalam kombinasi dengan yang
ada Agen antibakteri tapi itu juga mengurangi berlebihan endotoksin-induced septic shock
merupakan langkah penting dalam Pertarungan melawan ancaman serius ini terhadap kesehatan
masyarakat. Peptida antimikroba (AMPs), diisolasi dari berbagai spesies (misalnya amfibi, ikan,
moluska, serangga, mamalia, dan tumbuhan, dll.), bertindak dalam pertahanan tuan rumah melawan
radang patologis dan mikroba infeksi. Immunomodulator seperti aspolymyxin B [3], Protein bakterial
/ permeabilitas-peningkatan [4, 5], CAP-18 [6, 7], dan peptida mastoparan [8] dapat melindungi
terhadap respon inflamasi mematikan Di sisi lain, ranalexin [9, 10], OH-CATH [11] dan peptida
arenalin-1 [12] mungkin membunuh bakteri (baik Gram-negatif maupun Gram-positif) virus, jamur,
protozoa, dan bahkan sel kanker. Di Selain itu, bila digunakan melawan berbagai jenis bakteri infeksi,
arenin-1 [12], ranaleksin [13] dan P5-18mer [13] telah ditunjukkan untuk menggunakan antibiotik
sinergis efek. Kami sebelumnya mencirikan domain inti dari Faktor Limulusanti-LPS (LALF; asam
amino 31-52), a Protein dasar kecil berasal dari arthropoda Tachypleus tridentatus dan Limulus
polyphemus, untuk menghasilkan sebuah novel peptida, CLP-19. Terdiri dari 19 residu asam amino,

CLP-19 adalah ikatan kepala ke ekor melalui ikatan disulfida dan memiliki struktur kationik,
amphipathic. Yang melekat Potensi CLP-19 ternyata tidak hanya melibatkan langsung aktivitas
antibakteri terhadap berbagai bakteri patogentetapi juga melakukan aktivitas anti-LPS yang kuat
yang mencegahnyastimulasi berikutnya dari sistem kekebalan bawaan aktivator, TLR4, serta induksi
berturut – turut produksi sitokin dan pelepasan [14-16]. Dalam penelitian ini, kami berusaha untuk
menyelidiki apakah co-treatment dengan CLP-19 dan antibiotik lainnya memiliki efek sinergis
terhadap pertumbuhan bakteri dan jelaskan mekanisme yang mendasarinya.

HASIL

CLP-19 menampilkan antibakteri langsung non-selektif

aktivitas dibandingkan dengan konvensional lainnya

antibiotik

Dalam pengujian ini, konsentrasi hambat minimum (MICs) CLP-19, ampisilin, ceftazidime,
eritromisin, levofloxacin dan S-LALF peptida ditentukan. ItuSensitivitas bakteri terhadap peptida dan
antibiotik tersebutdisajikan pada Tabel 1. Ampisilin menunjukkan antibakteri. aktivitas melawan E.
coli dan S. aureus pada nilai MIC 4 μg / mL dan 2 μg / mL namun tidak berpengaruh terhadap
kelangsungan hidup A. baumannii dan P. aeruginosa, bahkan sampaiMIC 256 μg / mL. MIC dari
ceftazidime melawan bakteri Gramnegatif dan Gram positif berkisar antara 0,25 μg / mL sampai 16
μg / mL. Eritromisin menunjukkan antibakteri aktivitas melawan S. aureus pada nilai MIC 1 μg / mL
namun tidak menunjukkan efek pada mikroba lain yang diuji, bahkan dengan MIC tertinggi diuji MICs
levofloxacin melawan E. coli, S. aureus dan P. aeruginosa relatif rendah (0,06 μg / mL, 0,5 μg / mL
dan 4 μg / mL), namun tinggi > 256 μg / mL) terhadap A. baumannii. Perlu dicatat CLP-19
menunjukkan aktivitas antibakteri pada MICs dari 16 ug / mL menjadi 32 μg / mL melawan E. coli, S.
Aureus andA. baumannii, menyarankan antibakteri non selektifaktivitas bakteri Gram negatif dan
Gram positif. Namun, CLP-19 tidak menunjukkan antibakteri yang dapat diamati aktivitas melawan.
aeruginosa (> 256 μg / mL). S-LALF, Peptida prekursor CLP-19, tidak menunjukkan antibakteri
aktivitas melawan bakteri yang disebutkan di atas.
Dosis terapeutik CLP-19 menunjukkan minimalSitotoksisitas

Untuk mengevaluasi toksisitas CLP-19 in vitro, uji hemolisis dan uji toksisitas sel mamalia dilakukan.
Perlakuan CLP-19 pada 128 μg / mL atau lebih rendah tidak menghasilkan hemolisis yang dapat
diamati atau toksisitas pada eritrosit dan sel Vero; Namun lebih jauh lagi peningkatan konsentrasi
peptida, sampai 256 μg / mL, menghasilkan sitotoksisitas yang signifikan (Tabel 2). Dengan
meyakinkan, konsentrasi CLP-19 dibutuhkan agar efektif Aktivitas antibakteri jauh lebih sedikit
daripada yang ditunjukkan

sitotoksisitas signifikan terhadap eritrosit dan sel Vero.

CLP-19 memiliki efek antibakteri sinergis saat Diaplikasikan dalam kombinasi dengan
konvensional lainnya antibiotik

Efek sinergis CLP-19 dievaluasi oleh menentukan indeks konsentrasi penghambatan fraksional(FICI).
Tabel 3 menunjukkan bahwa rata-rata FICI CLP-19 berkisar antara 0,375 sampai 0,5 bila digunakan
dalam kombinasi dengan ampisilin, ceftazidime atau levofloxacin, menunjukkan CLP-19 memiliki
efek antibakteri yang sinergis Saat mengkombinasikan dengan antibiotik konvensional ini. Meski
begitu, CLP-19 hanya menunjukkan sinergis parsial Efek bila digunakan dalam kombinasi dengan
eritromisin (FICI = 0,75) melawan S. aureus. Sejak MICs ampisilin melawan A. baumanniiandP.
aeruginosa, eritromisin melawan E. coli, A. baumanniiand P. aeruginosa,

levofloksasin melawan A. baumanniiand CLP-19 melawan

P. aeruginosawere tidak didapat karena mengatasi

konsentrasi uji, FICI di atas disebutkan

Senyawa tidak dapat dihitung.

Karakteristik sinergis CLP-19 dengan

antibiotik konvensional

Untuk mengetahui antimikroba sinergisnya

sifat CLP-19, kinetika pembunuhan CLP-19 saja,

ceftazidime saja, dan dalam kombinasi ditentukan.

Lonceng waktu membunuh menunjukkan bahwa pengobatan CLP-19 atau ceftazidime saja selama
60 atau 360 min sepenuhnya

dieliminasi E. coli. Selain itu, sel yang diobati dengan CLP-19 dan ceftazidime tidak menunjukkan
bakteri yang layak dalam 15

min. Temuan ini berbeda nyata dengan

kelompok kontrol dengan pengobatan PBS menunjukkan minimal tidak

perubahan viabilitas bakteri selama eksperimen 24 jam

periode (Gambar 1A).

Apalagi kestabilan aktivitas antibakteri

ditentukan dengan menggunakan metode disk diffusion. Cakram

mengandung MIC CLP-19 untuk E. coli menyebabkan 36,8 ±

2,0 mm

(mean ± SD) zona clear zone pada hari ke 1, dan ini

Zona sedikit membesar setiap hari sampai 77,9 ± 4,3 mm

pada hari

5. MIC dari ceftazidime menyebabkan area zona yang jelas

meningkat dari 76,1 ± 2,9 mm

pada hari ke 1 sampai 239,6 ± 16,7

mm2

pada hari ke 5. Area zona jelas gabungan CLP-19

dengan ceftazidime sangat tinggi, menjadi 161,0 ± 8,3

mm2on hari 1 dan mencapai 438,2 ± 13,0 mm

pada hari ke 5.

Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa antibakteri

aktif selama percobaan berlangsung (Gambar

1B). Kenaikan harian di daerah zona jernih yang disebabkan oleh

Senyawa dalam kombinasi secara signifikan lebih besar (p <

0,05) dibandingkan dengan jumlah zona yang jelas yang disebabkan oleh salah satu dari

Senyawa secara terpisah. Fenomena serupa adalah

diamati terhadap S. aureus dan A. baumannii (data tidak

ditunjukkan), menunjukkan bahwa kombinasi pengobatan memiliki

aktivitas antibakteri sinergis.

CLP-19 atau CLP-19 berbasis kombinasi perawatan

pembentukan radikal hidroksil yang diinduksi

Banyak antimikroba bakterisida telah terjadi

dikenal untuk berbagi jalur mematikan umum yang melibatkan

generasi / akumulasi radikal hidroksil [17].

Untuk mengeksplorasi ide ini, kami berusaha untuk menentukan apakah

salah satu dari berbagai CLP-19 dan antibiotik konvensional

Kombinasi mampu menghasilkan radikal hidroksil.

Uji dengan fluorescein dye30- (p-hydroxyphenyl) (HPF)

sebuah probe fluoresensi sel-permeabel yang selektif

mendeteksi spesies oksigen yang sangat reaktif seperti hidroksil

radikal, menunjukkan bahwa pengobatan CLP-19, ampisilin

atau ceftazidime sendiri secara signifikan menghasilkan hidroksil

radikal> 60% melawan E. Coli. Namun, levofloxacin

sendiri hanya menghasilkan radikal hidroksil sebesar <10%. Kapan

Perlakuan kombinasi diaplikasikan pada hidroksil

Radikal secara signifikan meningkat (p <0,05) untuk ampisilin,

ceftazidime atau levofloxacin (Gambar 2A). Pengujian terhadap

Strain S. aureus menunjukkan efek yang sama pada saat

Perlakuan kombinasi diaplikasikan dengan menggunakan tiga di atas

zat antibiotik (p <0,05). Selain itu, tingkat rendah

radikal hidroksil yang dihasilkan oleh pengobatan eritromisin

ditingkatkan dengan CLP-19 (p> 0,05), yang dapat menjelaskan

pengamatan kami sebelumnya hanya sebagian sinergis

efek antara CLP-19 dan eritromisin terhadap S.aureus

(Gambar 2B). Sementara itu, peningkatan yang ditandai

radikal hidroksil (p <0,05) juga diamati saat CLP-19 dikombinasikan dengan ceftazidime melawan A.
baumannii

CLP-19 atau CLP-19 berbasis kombinasi perawatan

menyebabkan deplesi NADH katabolik

Untuk memahami mekanisme yang mendasari

pembentukan radikal hidroksil, penipisan NADH

dirangsang oleh CLP-19, ceftazidime dan kombinasi mereka

diselidiki dengan mengukur NAD +

/ NADH rasio.

Hasilnya menunjukkan bahwa CLP-19 atau ceftazidime saja

meningkat tajam NAD +

/ NADH ragamnya

organisme bakteri diuji dengan> 3- sampai 7 kali lipat pada 0,5 jam setelahnya

agen ditambahkan. Khususnya, lebih dari 6 sampai 9 kali lipat

di NAD

Rasio NADH terjadi sebagai tanggapan terhadap

Perlakuan CLP-19 dikombinasikan dengan ceftazidime pada

0,5 h setelah agen ditambahkan, tapi NAD

/ NADH

nilai rasio kembali ke tingkat yang tidak dapat dibedakan dari

nilai awal pada titik waktu pengobatan setelah 1 jam. Ini

Perubahan tidak diamati pada kelompok kontrol yang tidak diobati,

dimana NAD +

Rasio NADH relatif rendah

konsisten (Gambar 3).

Konsentrasi LPS dalam supernatan adalah

diukur untuk mengetahui efek CLP-19 pada

pelepasan LPS yang bebas antibiotik.

CLP-19-dirawat

Kultur menunjukkan konsentrasi LPS terendah, dan

Pengobatan ceftazidim menyebabkan pembebasan LPS yang signifikan pada

2 × MIC Namun, saat sel bakteri diobati

kombinasi ceftazidime dan CLP-19, pelepasan

LPS mengalami penurunan yang luar biasa (p <0,05), dan ini terjadi

berbeda dengan budaya kontrol yang diobati dengan PBS

konsentrasi tertinggi LPS yang dibebaskan ditemukan di

supernatan (Gambar 4).

DISKUSI

Infeksi bakteri tahan obat memiliki tinggi

Angka kematian dan proses pengobatannya sulit

karena obat antibakteri konvensional telah berkurang

khasiat atau sama sekali tidak efektif. Novel alternatif

agen antibakteri atau kombinasi terapi antibiotik

mempertimbangkan strategi yang menjanjikan untuk mengatasi hal ini

hambatan. Penelitian ini mengkonfirmasi temuan kami sebelumnya

CLP-19 menunjukkan aktivitas antibakteri yang kuat melawan

Bakteri gram positif dan Gram-negatif. Menariknya,

Efek sinergis yang signifikan dengan potensi lebih tinggi, lebih cepat

membunuh kinetika dan durasi antibakteri yang lebih lama

diamati saat CLP-19 diaplikasikan dalam kombinasi dengan

antibiotik bakterisida dan bakteriostatik lainnya, dan ini

Temuan ini sesuai dengan AMP atau antibakteri lainnya

agen [18-21].

Namun, tidak semua kombinasi bersifat sinergis

efek. Misalnya antibiotik bakteriostatik

ditemukan untuk mengganggu bakteri yang dimediasi AMPs

dengan depolarisasi potensi transmembran [22]. Di

Investigasi kami, CLP-19 menunjukkan aktivitas tidak spesifik

terlepas dari status Gram dan menghasilkan sinergis

efek mengisyaratkan bahwa CLP-19 kemungkinan saham lain membunuh

atau mekanisme sinergi. Laporan sebelumnya menunjukkan hal itu

Agen antibakteri menginduksi hidroksil yang sangat merusak

produksi radikal, menunjukkan stres oksidatif bertindak sebagai

memicu kematian sel bakteri [17, 23]. Kami lebih lanjut

Mekanisme penelitian ini sesuai dengan penelitian ini

kombinasi CLP-19 dan CLP-19 secara signifikan

meningkatkan generasi radikal hidroksil dari bakteri

melalui transiently meningkatkan NAD

produksi (atau

kehabisan NADH), yang terkait erat dengan

Efek antibakteri langsung dan sinergis dari CLP-19

daripada konsekuensi pembunuhan bakteri.

Selain itu, pembebasan LPS yang diinduksi antibiotik,

terutama oleh beberapa kelas antibiotik β-laktam semacam itu

sebagai ceftazidime melawan bakteri Gram-negatif, telah

terbukti terkait dengan kemerosotan klinis yang cepat

pasien [24, 25]. Karya kami sebelumnya telah terungkap

CLP-19 di ruang ekstraselular bisa mengikat secara langsung

ke LPS dan secara kompetitif menghambat terbentuknya LPS /

Kompleks LBP, sehingga mencegah TLR4 berikutnya

aktivasi dan induksi sitokin berturut-turut [14].

Oleh karena itu, ceftazidime dan E. coli dipekerjakan untuk dipasang

up model untuk mendeteksi aktivitas anti-LPS CLP-19 berbasis kombinasi. Secara provokatif,
penemuan kita sekarang

menunjukkan bahwa aktivitas anti-LPS langsung dari CLP-19

berkontribusi untuk menghilangkan pembebasan LPS yang disebabkan antibiotik

dan efek samping yang fatal berturut-turut.

Sebagai kesimpulan, penyelidikan kami menunjukkan

Aktivitas antibakteri dan sinergisme yang menarik

dengan antibiotik bakterisida dan bakteriostatik. Lebih

Yang penting, pengobatan CLP-19 mampu mengurangi lainnya

pembiusan LPS konvensional yang diinduksi antibiotik. Kita

Oleh karena itu terungkap bahwa CLP-19 merupakan terapi potensial

agen dan ajuvan untuk pengobatan infeksi bakteri.

BAHAN DAN METODE

Persiapan peptida

Peptida CLP-19 dari kepala ke ekor (CRKPTFRRLKWKIKFKFKC; molekul

massa, 2511.1 Da) dan peptida S-LALF

(CHYRIKPTFRRLKWKYKGKFWC; massa molekul,

2945.5 Da) disintesis oleh Symphony Peptide

Synthesizer (Protein Technologies, Tucson, AZ, AS)

menggunakan prosedur perakitan peptida fase padat bertahap.

Sintesis peptida CLP-19 dimulai dengan a

Fmoc-Lys (Boc) -Wang resin. Setelah pengeringan, peptida

dibelah dan dimurnikan dengan campuran asam trifluoroasetat

solusi dan HPLC (Shen Zhen Hybio Engineering,

Shenzhen, China) untuk mencapai kemurnian 98,4% untuk CLP-19 dan 99,2% untuk S-LALF.

Antibiotik, strain bakteri dan kultur

kondisi

Ampisilin, ceftazidime, eritromisin dan

levofloxacin dibeli dari Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA). E. coli (ATCC 25922), S. aureus

(ATCC 29213), A. baumannii (ATCC 19606), dan P.

aeruginosa (ATCC 27853) diperoleh dari

Koleksi Budaya Tipe Amerika (Manassas, VA, USA).

Bakteri patogen ditanam di Difco Luria

Bertani (LB) pada suhu 37o

C.

Uji aktivitas antibakteri

Strain bakteri dikultur di Mueller-Hinton

(MH) kaldu dan konsentrasi suspensi bakteri

disesuaikan untuk mendapatkan populasi terstandardisasi

dengan mengukur kekeruhan dengan SpectraMax M2e

spektrofotometer (Perangkat Molekuler, Sunnyvale, CA,

AMERIKA SERIKAT). Pada fase pertengahan log, strain bakteri (1 × 106

/ mL)

diinokulasi ke dalam kaldu MH dan campurannya (0,1 mL)

disalurkan ke piring mikrotiter 96-well. Kerentanan

pengujian dilakukan dengan mikrodilusi kaldu pada pengujian

senyawa, seperti yang direkomendasikan oleh pedoman klinis

dan Laboratory Standards Institute (CLSI) (2015). Secara singkat,

Setelah 18 jam inkubasi pada 37 ° C, MIC dan pertumbuhannya

diuji dengan memantau kerapatan optik pada 620 nm (OD

620).

Uji Haemolysis

Darah kuda defibrinated (2%, Oxoid, Basingstoke,

Inggris) dan CLP-19 diinkubasi di dalam buffer PBS di

didefinisikan pH 7,4 (35 mM buffer fosfat / 150 mM NaCl).

Mengikuti inkubasi dalam spektrofotometer tabung mikro

37 ° C selama 4 jam, jumlah hemoglobin dilepaskan

diukur secara spektrofotometri dengan A

570

pembacaan setiap

2 menit. Pengukuran kemudian dihitung relatif terhadap

sampel kontrol positif dilisiskan dengan 1% natrium dodesil

sulfat, yang menyebabkan hemolisis 100%. Pengurangan

sebuah

570

membaca menunjukkan hemolisis.

Uji toksisitas sel mamalia

Sel Vero diperoleh dari Departemen

Imunologi di Universitas Kedokteran Militer Ketiga

(Chongqing, China) dan dibudidayakan di RPMI 1640

(Invitrogen, Shanghai, China) ditambah dengan 10%

serum bovine janin (TBD Sciences, Tianjing, China), 100

U / mL penisilin dan 100 U / mL streptomisin (Beyotime,

Jiangsu, Cina) di 37

oC di bawah 5% CO2

[26, 27]. Sel

dipanen oleh 0,05% trypsin untuk menyiapkan sel tunggal

suspensi, diunggulkan di piring 96-well dan dikultur selama 24 tahun

h sebelum perawatan CLP-19. Peningkatan jumlah

CLP-19 ditambahkan dan sel-sel diinkubasi untuk yang lain

48 h. Setelah dicuci, sel-sel dibudidayakan lebih segar

media yang mengandung 100 mg / L merah netral selama 90 menit sebelumnya

ke cuci PBS Kemudian sel diobati dengan 200 μL

diasamkan isopropanol (0,33% HCl), dan viabilitasnya adalah

dinilai dengan A

540. Penurunan A

540

nilai menunjukkan

mengurangi viabilitas sel.

Uji kombinasi

Efek antibakteri keseluruhan CLP-19 in

Kombinasi dengan antibiotik konvensional itu

diselidiki dengan analisis kotak-kotak viareadout

dari FICI. FICI dihitung menurut

persamaan: FIC

A + FIC

B, dimana FIC

A adalah [(MIC

Obat A

di

kombinasi) / (MIC

Drug Aalone)] dan FIC

B adalah [(MICDrug B

dalam kombinasi) / (MIC

Obat B

sendiri)] [28, 29]. Hasilnya

nilai ditafsirkan sebagai berikut: FICI <0,5, sinergi;

0,5 ≤ FICI <1, sinergi parsial; 1 ≤ FICI <4, aditif

efek atau ketidakpedulian; 4 ≤ FICI, antagonisme [30]. Papan-papan bertanda A2-dimensi dengan
pengenceran 2 kali lipat masing-masing

Agen disiapkan mengikuti pedoman CLSI (2015).

Kontrol pertumbuhan sumur mengandung media dan tidak ada antibiotik

Agen dimasukkan ke dalam masing-masing piring. Setiap tes itu

dilakukan dalam rangkap tiga

Uji kinetika antibakteri

Suspensi bakteri pada fase pertengahan log (1 × 10

mL) dilapisi pada piring microtiter 96-well dan diobati

dengan CLP-19, ceftazidime, atau diobati dengan CLP-19

dan ceftazidime. Setelah diinkubasi pada suhu 25 ° C selama 5 menit, 15

min, 30 menit, 1 jam, 3 jam, 6 jam dan 24 jam, jumlah yang layak

bakteri ditentukan dengan pengenceran serial di PBS dan

plating pada trypticase soy agar (TSA) dengan 24 jam

inkubasi pada suhu 37 ° C. Batas deteksi untuk masing-masing sumur adalah

100 CFU / mL.

Uji difusi disk

Untuk menilai kestabilan temporal antibakteri

Tindakan CLP-19 saja, ceftazidime sendiri dan

perlakuan gabungan, cakram kertas steril (AA, diameter 6

mm; Whatman International Ltd, Maidstone, Kent, Inggris)

diresapi dengan MICs masing-masing atau dengan PBS saja

sebagai kontrol Cakram dikeringkan selama 3 jam pada suhu 25 ° C dan ditempatkan

ke permukaan piring TSA yang telah diunggulkan

100 μL suspensi E. coli (1 × 10

/ mL; menyebar untuk mencapai

halaman pertumbuhan semi-konfluen) dan dibiarkan mengering

3 jam pada suhu 37 ° C. Pelat kemudian diinkubasi selama 5 hari

pada suhu 37 ° C dan diperiksa setiap 24 jam untuk penampilan

zona yang jelas di sekitar masing-masing cakram, yang diukur dengan

sebuah penggaris. Penghambatan pertumbuhan dihitung menurut

persamaan: [(luas zona total bersih) - (area disk)].

Uji pembentukan radikal hidroksil

Bakteri (1 × 106

/ mL) diobati dengan MICs

dari CLP-19, ampisilin, ceftazidime, eritromisin,

levofloxacin atau CLP-19 dalam kombinasi dengan masing-masing

antibiotik konvensional, dan PBS berfungsi sebagai kontrol. Semua

kelompok percobaan diinkubasi pada suhu 37

Hai

C selama 2 jam. 5

mM pewaris fluorescent dye30- (p-hydroxyphenyl)

fluorescein (HPF) (Invitrogen) kemudian ditambahkan.

Intensitas fluoresensi HPF diukur dengan a

spektrofluorofotometer pada eksitasi 490 nm dan 515 nm

panjang gelombang emisi. Persentase radikal hidroksil

formasi dihitung berdasarkan persamaan: [(OD

490

dari

dirawat dengan baik dengan agen antibakteri) - (OD490

tidak diobati

kontrol)] / (OD

490

dari kontrol yang tidak diobati) × 100.

NAD +

, Ekstraksi NADH

Ekstraksi batu pasir dan uji siklus

dilakukan, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [31]. Bakteri di

fase pertengahan log (1 × 106

/ mL) disentrifugasi pada 13000

rpm selama 5 menit dan resuspended dalam 1 mL LB. Untuk NAD

dan ekstraksi NADH, sampel bakteri dikumpulkan

dengan sentrifugasi (13000 rpm selama 1 menit) di setiap setengahnya

jam antara 0 dan 2 jam setelah penambahan MICs dari CLP-

19, ceftazidime, atau kombinasi. Supernatan itu

dihapus dan pelet dibekukan segera di a

kering es-etanol mandi dan disimpan pada -80 ° C sampai semua sampel

telah dikumpulkan Analisis pelet es dingin itu

dimulai dengan menambahkan 75 μL NaOH 0,2 M (untuk NADH

ekstraksi) atau 75 μL HCl 0,2 M (untuk NAD

ekstraksi),

setelah itu sampel dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100 ° C

dan kemudian disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit. NAD

Supernatan yang mengandung NADH dipindahkan ke segar

tabung dan disimpan dalam gelap di atas es sampai digunakan dalam bersepeda

pengujian kadar logam.

NAD

Uji bersepeda dilakukan di 96-well

piring. Campuran reaksi masing-masing mengandung 16

μL 1,0 M bicine (pH 8.0) (Sigma-Aldrich), 40 μL

ekstrak sampel, 40 μL buffer penetralisir (0,1M HCl

untuk NADH atau 0,1 M NaOH untuk NAD

), 16 μL 100%

etanol, dan 30 μL EDTA 40mM (pH 8.0). Ketika

Campuran reaksi diratakan di sumur, 16 μL

phenazine ethosulfate (PES) (Sigma-Aldrich) dan 16 μL

3- [4,5-dimetilthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium

bromida (MTT) (Sigma-Aldrich) ditambahkan dan

piring diinkubasi selama 3 menit pada 30 ° C. Kemudian, 3,2 μL

alkohol dehidrogenase (500 U / mL; Sigma-Aldrich) di

penyangga bure (pH 8,0) ditambahkan ke dalam campuran reaksi

untuk memulai reaksi dan meningkatkan absorbansi pada

570 nm selama 10 menit berikutnya tercatat. Tingkat

Pengurangan MTT sebanding dengan konsentrasi

NAD + atau NADH dalam sampel, dan NAD

dan NADH

standar (kisaran: 0,0375 dan 0,75 nM; Sigma-Aldrich)

digunakan untuk mengkalibrasi pengujian.

Studi pelepasan endotoksin

Bakteri pada fase pertengahan log (1 × 104

/ mL) adalah

diobati dengan 2 × MICs CLP-19, ceftazidime, atau in

kombinasi selama 6 jam pada suhu 37 ° C. Bakteri diobati dengan PBS

berfungsi sebagai kontrol Sampel disaring melalui a

bebas pirogen 0.2-pm pori polysulphone filter (Acrodisc;

Gelman Scientific, Northampton, Inggris) dan filtratnya

segera disimpan pada suhu -70 ° C sampai digunakan. Untuk analisis,

filtrat dicairkan pada suhu kamar, secara serial

diencerkan dengan air bebas pirogen (kisaran: 10

2
- sampai 10

-melipat)

dan bereaksi dengan reagen Limulus amebocytelysate (LAL)

(Rasio 1: 1). Kekeruhan kinetik diukur dengan menggunakan pembaca tabung ATi-321 (Lab Kinetics,
Somerset, Inggris).

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai rata-rata paling sedikit tiga

eksperimen independen ± standar deviasi. Statistik

signifikansi ditentukan oleh paired Student t test

jika dibandingkan hanya dua kelompok atau satu arah ANOVA

diikuti dengan uji apakah menganalisa lebih dari dua kelompok.

Perbedaan dianggap signifikan secara statistik

di P <0,05 [32].