Microbiology

LAPORAN KEGIATAN PPDH
ROTASI DIAGNOSA LABORATORIK MIKROBIOLOGI

yang dilaksanakan di
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI VETERINER
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
Oleh:
M. RIFA’IS, S.KH
160130100111011
PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2017
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena berkat Rahmat dan
Anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan laporan
Pendidikan Profesi Dokter Hewan (PPDH) Rotasi Diagnosa Laboratorik
Mikrobiologi di Laboratorium Mikrobiologi Veteriner FKH-UA. Penulis
mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dr. Sri Murwani, drh., MP., drh. Dahliatul Qosimah, M.Kes., drh. Indah Amalia
Amri, M.Si. selaku Dosen Koordinator Rotasi Diagnosa Laboratorik
Mikrobiologi yang selalu membantu penulis dalam mengarahkan, memberi
bimbingan, kesabaran, waktu yang telah diberikan serta dukungan kepada
penulis dalam penyusunan dan penyempurnaan laporan ini.
2. Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya yang selalu membantu penulis dalam mengarahkan,
memberi bimbingan, kesabaran, fasilitas dan waktu yang telah diberikan serta
dukungan kepada penulis dalam penyusunan dan penyempurnaan laporan ini.
3. Dosen dan karyawan Laboratorium Mikrobiologi FKH-UA yang telah
menerima dengan baik, mengarahkan, memberi bimbingan, kesabaran, fasilitas,
dan waktu yang telah diberikan kepada penulis dalam penyusunan laporan ini.
4. Bapak, Ibu, Kakak serta seluruh keluarga besar yang telah memberikan doa,
kasih sayang, dan dukungan sehingga penulis mampu menyelesaikan laporan
ini.
5. Sahabat CADOHE USIL, Rifa’i, Darmawan, Yudha, Artul, Noni, Afril, Nailul,
Min, Putri, Bismi, dan Nur atas kerja sama, diskusi, semangat dan dukungannya
sehingga penulis mampu menyelesaikan laporan ini.
6. Kolega PPDH Gelombang VII Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Brawijaya yang selalu memberikan dorongan, semangat, inspirasi dan
keceriaan.
7. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian laporan ini yang tidak
mungkin penulis sebutkan satu persatu.
Mengingat keterbatasan dan kemampuan yang dimiliki, penulis menyadari

bahwa laporan PPDH Rotasi Diagnosa Laboratorik Mikrobiologi ini masih jauh dari
ii
sempurna, oleh karena itu penulis menerima segala kritik yang bersifat membangun
dan saran dari pembaca untuk dapat menyempurnakan penulisan selanjutnya. Akhir
kata, penulis menyampaikan mohon maaf apabila terdapat banyak kesalahan dalam
penulisan laporan ini.
Malang, Desember 2017
Penulis
iii
LEMBAR PENGESAHAN
LAPORAN KEGIATAN PPDH

ROTASI DIAGNOSA LABORATORIK MIKROBIOLOGI
yang dilaksanakan di
UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA
(26 Januari 2017 - 13 Februari 2017)
Oleh :
M. RIFA’IS, S.KH
NIM.160130100111011
Menyetujui,
Komisi Penguji
Penguji 1
Dr. Sri Murwani, drh., MP

NIP. 19630101 198903 2 001
Penguji 2 Penguji 3
drh. Dahliatul Qosimah, M.Kes drh. Indah Amalia Amri, M.Si

NIP. 19820127 201504 2 001 NIK. 20130487 09252001
Mengetahui,
Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

NIP. 19600903 198802 2 001
iv
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

KATA PENGANTAR .......................................................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. iv
DAFTAR ISI......................................................................................................... v
DAFTAR TABEL ................................................................................................ vii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ viii
BAGIAN 1. PEMERIKSAAN BAKTERI .........................................................
BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 2
1.3 Tujuan ................................................................................................... 2
1.4 Manfaat ................................................................................................. 2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA........................................................................... 3
2.1 Sistem Respirasi (Pernafasan) pada Unggas ......................................... 3
2.2 Penyakit Bakterial pada Sistem Pernafasan Unggas ............................. 5
2.2.1 Chronic Respiratory Disease (CRD) ............................................ 5
2.2.2 Coryza .......................................................................................... 7
2.2.3 Fowl Cholera ................................................................................ 8
BAB 3 METODOLOGI ...................................................................................... 10
3.1 Tempat dan Waktu................................................................................ 10
3.2 Alat dan Bahan ..................................................................................... 10
3.2.1 Alat .............................................................................................. 10
3.2.2 Bahan ........................................................................................... 10
3.3 Metode .................................................................................................. 11
3.3.1 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ .................................. 11
3.3.2 Pembuatan Media ........................................................................ 11
3.3.2.1 Blood Agar (BA)............................................................. 11
3.3.2.2 Chocolate Agar (CA) ...................................................... 12
3.3.2.3 Trypticase Soy Agar (TSA) ............................................ 12
3.3.2.4 Mac Conkey Agar (MCA) .............................................. 12
3.3.2.5 Media gula-gula .............................................................. 13
3.3.2.6 Triple Sugar Iron Agar (TSIA) ....................................... 13
3.3.2.7 Urea Agar ........................................................................ 13
3.3.2.8 Simmon Citrat Agar ........................................................ 13
3.3.2.9 Sulphide Indol Motility (SIM) ........................................ 14
3.3.3 Isolasi dan Identifikasi................................................................. 14
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 16
4.1 Pemeriksaan Klinis ............................................................................... 16
4.1.1 Sampel Ayam .............................................................................. 16
4.2 Pemeriksaan Patologi ........................................................................... 17
4.3 Pemeriksaan Mikrobiologi ................................................................... 18
4.3.1 Isolasi Primer ............................................................................... 18
4.3.2 Isolasi Sekunder atau Pemurnian ................................................ 25
4.3.3 Identifikasi ................................................................................... 27
4.4 Hasil Diagnosa ...................................................................................... 32
BAB 5 PENUTUP ............................................................................................... 34
5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 34
v
5.2 Saran ...................................................................................................... 34
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 35
BAGIAN 2. PEMERIKSAAN VIRUS ...............................................................
BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................. 2
1.3 Tujuan .................................................................................................... 2
1.4 Manfaat .................................................................................................. 2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA........................................................................... 3
2.1 Newcastle Disease (ND) ........................................................................ 3
2.2 Etiologi .................................................................................................. 3
2.3 Cara Penularan ....................................................................................... 4
2.4 Gejala Klinis .......................................................................................... 4
2.5 Pemeriksaan Patologi ............................................................................ 4
2.6 Diagnosa ................................................................................................ 5
2.7 Penanganan ............................................................................................ 5
BAB 3 METODOLOGI ....................................................................................... 6
3.1 Tempat dan Waktu................................................................................. 6
3.2 Uji AGP ................................................................................................. 6
3.2.1 Alat dan Bahan ............................................................................. 6
3.2.2 Metode .......................................................................................... 6
3.3 Inokulasi Virus pada TAB ..................................................................... 6
3.3.1 Alat dan Bahan ............................................................................. 6
3.3.2 Metode .......................................................................................... 7
3.3.2.1 Pengamatan Telur Melalui Peneropongan ....................... 7
3.3.2.2 Pengumpulan Sampel Virus dari Organ .......................... 7
3.3.2.3 Inokulasi Virus ke dalam Ruang Alantoik ....................... 7
3.3.2.4 Mengumpulkan Cairan Alantoik (Panen virus) ............... 8
3.4 Uji HA-HI .............................................................................................. 8
3.4.1 Alat dan Bahan ............................................................................. 8
3.4.2 Metode .......................................................................................... 8
3.4.2.1 Persiapan membuat eritrosit 0,5% ................................... 8
3.4.2.2 Uji HA Mikroplate ........................................................... 9
3.4.2.3 Uji HI Mikroplate............................................................. 9
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 10
4.1 Uji Agar Gel Precipitation (AGP) ........................................................ 10
4.1.1 AGPT Positif ............................................................................... 11
4.1.2 AGPT Negatif .............................................................................. 13
4.2 Inokulasi Virus pada Telur Ayam Berembrio (TAB) ........................... 14
4.3 Uji Hemaglutination (HA) .................................................................... 18
4.4 Uji Hemaglutination Inhibition (HI) ..................................................... 21
BAB 5 PENUTUP ............................................................................................... 24
5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 24
5.2 Saran ...................................................................................................... 24
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 25
vi
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
Bagian 1. Pemeriksaan Bakteri
4.1 Perubahan makroskopis patologi anatomi ...................................................... 17
4.2 Sampel pemeriksaan dan media isolasi ........................................................... 18
Bagian 2. Pemeriksaan Virus

4.1 Lama kematian sampel TAB........................................................................... 17
4.2 Gambaran skematis hasil uji HA .................................................................... 20
4.3 Gambaran skematis hasil uji HI ...................................................................... 22
vii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
Bagian 1. Pemeriksaan Bakteri
2.1 Sistem respirasi ayam ................................................................................... 4
4.1 Hasil nekropsi ayam ...................................................................................... 17
4.2a Hasil isolasi pada media MCA ...................................................................... 20
4.2b Hasil mikroskopis pada media MCA ............................................................ 20
4.3a Hasil isolasi pada media BA ......................................................................... 22
4.3b Hasil mikroskopis pada media BA ............................................................... 22
4.4a Hasil isolasi pada media TSA ....................................................................... 23
4.4b Hasil mikroskopis pada media TSA ............................................................. 23
4.5a Hasil isolasi pada media CA ......................................................................... 24
4.5b Hasil mikroskopis pada media CA ............................................................... 24
4.6a Koloni hasil pemurnian pada media MCA .................................................... 26
4.6b Uji KOH terbentuk lendir ............................................................................. 26
4.6c Hasil mikroskopis pemurnian MCA ............................................................. 26
4.7 Hasil (+) uji gula-gula ................................................................................... 28
4.8 Hasil (+) uji Sulfat Indol Motility (SIM) ...................................................... 29
4.9 Hasil (+) uji TSIA ......................................................................................... 30
4.10 Hasil (-) uji Simmon Sitrat ............................................................................ 31
4.11 Hasil (-) uji pada media Urea Agar ............................................................... 32
Bagian 2. Pemeriksaan Virus

4.1 Hasil positif uji AGP antara Ag-X dengan As-ND ........................................ 12
4.2 Hasil positif uji AGP antara As-X dengan Ag-ND ........................................ 12
4.3 Hasil positif uji AGP antara As-X dengan Ag-ND ........................................ 13
4.4 Hasil negatif uji AGP ..................................................................................... 14
4.5a Telur ayam berembrio (TAB) ....................................................................... 15
4.5b Suspensi gerusan organ ayam terduga ND ................................................... 15
4.6a Proses peneropongan TAB ............................................................................ 16
4.6b Proses inokulasi virus ................................................................................... 16
4.7 Teknik inokulasi virus pada ruang chorioalantois ......................................... 16
4.8 Hasil uji HA sampel terduga ND ................................................................... 19
4.9 Hasil uji HI sampel terduga ND ..................................................................... 22
viii
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Besarnya potensi kontribusi sektor pertanian di Jawa Timur terhadap
pembangunan ekonomi nasional tidak terlepas dari posisi subsektor peternakan di
dalam struktur perekonomian. Salah satunya adalah peternakan unggas yang setiap
tahunnya mengalami peningkatan. Seiring dengan peningkatan jumlah populasi
unggas beserta pengaruh perubahan cuaca yang tidak menentu di setiap tahunnya
dapat berdampak pada kesehatan unggas. Hal ini akan mempermudah masuknya
berbagai agen infeksi penyakit pada unggas. Berbagai agen infeksius tersebut dapat
masuk ke dalam tubuh unggas dan menyerang berbagai sistem penting di dalam
tubuh termasuk sistem pernafasan. Gejala klinis yang paling tampak pada kasus ini
berupa gangguan pada sistem pernafasan.
Infeksi pada sistem pernafasan unggas dapat menyebabkan kerugian yang
cukup besar. Hal ini disebabkan oleh pengaruh infeksi penyakit yang dapat
menyebabkan stres, penurunan produksi dan kematian pada unggas. Oleh sebab itu
perlu dilakukan tindakan pencegahan dan pengobatan yang tepat terhadap penyakit
infeksius tersebut agar kerugian yang disebabkan oleh agen infeksi penyakit dapat
dihindari. Pengobatan merupakan salah satu alternatif yang sering digunakan untuk
mengatasi infeksi saluran pernafasan pada unggas. Namun pengobatan yang
dilakukan saat ini dalam penerapanya masih kurang didukung dengan identifikasi
terhadap agen penyebab penyakit saluran pernafasan, sehingga hasil diagnosa
terkadang kurang tepat. Hal inilah yang menyebabkan kejadian penyakit akan terus
mewabah meski sudah dilakukan pengobatan.
Oleh karena itu dilakukan kegiatan PPDH rotasi diagnosa laboratorik
mikrobiologi tentang pemeriksaan klinis dan mikrobiologi terhadap unggas yang
menunjukkan gejala penyakit pada sistem pernafasan. Serangkaian pemeriksaan
bakteri atau pengujian mikrobiologi harus dilakukan seperti isolasi dan identifikasi
bakteri penyebab penyakit sehingga nantinya akan didapatkan diagnosa yang
akurat. Dengan diketahuinya agen penyebab penyakit beserta diagnosa yang akurat,
maka diharapkan tindakan pencegahan dan pengobatan yang dilakukan dapat
membuahkan hasil yang memuaskan dan tentunya dapat menekan kerugian
ekonomi.
1
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa saja jenis pemeriksaan yang dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri atau
agen penyebab penyakit pada sistem pernafasan ayam ?
2. Apa jenis bakteri atau agen penyebab yang mengakibatkan gangguan pada
sistem pernafasan ayam ?
1.3 Tujuan
1. Dapat mengetahui berbagai macam pemeriksaan yang dilakukan untuk
mengetahui jenis bakteri atau agen penyebab penyakit pada sistem pernafasan
ayam.
2. Dapat mengetahui jenis bakteri atau agen penyebab yang mengakibatkan
gangguan pada sistem pernafasan ayam.
1.4 Manfaat
Melalui kegiatan PPDH rotasi diagnosa laboratorik mikrobiologi ini
diharapkan dapat meningkatkan kemampuan mahasiswa dalam melakukan berbagai
macam pemeriksaan yang dibutuhkan untuk menentukan diagnosa yang akurat
terhadap jenis bakteri atau agen penyebab penyakit serta tindakan penanganan yang
tepat terhadap penyakit tersebut terutama pada sistem pernafasan ayam.
2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sistem Respirasi pada Ayam

Sistem respirasi adalah suatu proses pertukaran gas oksigen dari udara oleh
organisme hidup yang digunakan untuk serangkaian metabolisme yang akan
menghasilkan karbondioksida yang harus dikeluarkan, karena tidak dibutuhkan
oleh tubuh. Setiap makhluk hidup melakukan pernafasan untuk memperoleh
oksigen yang digunakan untuk pembakaran zat makanan di dalam sel-sel tubuh
(Frandson, 1992).
Ayam merupakan salah satu ternak yang termasuk dalam kelas aves. Adapun
organ-organ yang berkaitan dalam sistem pernafasan pada aves, yaitu:
1. Nares Anteriores (lubang hidung), berjumlah sepasang terdapat pada pangkal
rostrum bagian dorsal.
2. Nares Posteriores, lubang pada palatum, hanya 1 buah, terletak di tengah.
3. Glottis, terletak tepat di belakang pangkal lidah dan melanjutkan ke caudal, ke
dalam larynx. Glottis ini berhubungan dengan rongga mulut melalui celah yang
disebut rima Glottis.
4. Larink, bagian yang disokong oleh cartilago cricoidea, dan cartilago arytenoidea
yang berjumlah sepasang.
5. Trachea adalah lanjutan larynx ke arah caudal. Ini berupa suatu pipa mempunyai
cincin-cincin tulang yang disebut annulus trechealis.
6. Bronchus adalah percabangan trachea ke kanan dan ke kiri, disebut Bronchus
dexter dan sinister. Tempat percabangan bronchi tadi disebut bifurcatio tracheae.
Bronchi ini masih terbagi, ke dalam bronchi leteralis yang masing-masing akan
terbagi lagi parabronchi.
7. Pulmo, terdapat pada ujung-ujung bronchi berjumlah sepasang, melekat pada
dinding dorsal thorax. Pulmo ini dibungkus oleh selaput yang disebut pleura.
Pulmo mempunyai hubungan dengan kantong-kantong hawa yang disebut
saccus pneumaticus yang terdiri dari:
 Saccus abdominalis, terdapat diantara lipatan intestinum.
 Saccus trhoracalis anterior, terletak pada dinding sisi tubuh pada rongga dada
sebelah muka.
 Saccus thoracolis posterior, terletak tepat di belakang saccus thoracolis
anterior.
3
 Saccus interclavicularis, terletak di median, hanya satu buah dan
berhubungan dengan kedua pulmo.
 Saccus cervicalis, terletak pada pangkal leher, berjumlah sepasang.
 Saccus axillaris, yaitu saccus yang dibentuk oleh penonjolan sisi-sisi dari
saccus interreclavicularis yang terdapat pada daerah ketiak.
8. Syrinx, terdapat pada bifurcatio tracheae. Tersusun dari beberapa annulus
trachealis yang paling caudal dan annulus bronchialis yang paling cranial. Alat
ini membatasi suatu ruangan yang agak melebar yang disebut tympanum.
Sedangkan pada bagian trakea, bronkus dan bronkeolus dilengkapi dengan
sel-sel epitel yang juga mempunyai bulu getar dan sel tak bersilia yang akan
menghasilkan lendir yang mengandung enzim proteolitik dan surfaktan. Adanya
enzim dan surfaktan (penurun tegangan permukaan) tersebut mampu
menghancurkan beberapa mikroorganisme patogen. Silia hidung hanya mampu
menahan partikel berukuran 3,7-7,0 mikron, sedangkan partikel yang lebih kecil
lagi akan lolos dan bertahan di saluran pernapasan ayam (Irmaeni, 2006).
Dalam sistem respirasi unggas tidak memiliki diafragma, melainkan udara
berpindah dan keluar dari sistem pernapasan melalui perubahan tekanan pada
kantung udara. Otot yang berada di dada menyebabkan sternum yang akan
mendorong ke luar. Hal ini mengakibatkan tekanan negatif di udara kantung,
sehingga udara memasuki sistem pernapasan (Suprijatna, 2005).
Gambar 2.1 Sistem respirasi ayam

(Sumber: Suprijatna, 2005)
4
Selama inspirasi pertama, perjalanan udara melalui lubang hidung (juga
disebut nares yang terletak di sambungan antara bagian atas paruh atas dan kepala).
Seperti dalam mamalia, udara bergerak melalui lubang hidung ke rongga hidung.
Dari rongga hidung udara melalui larink dan ke trakhea. Udara bergerak melalui
trakhea ke syrink, yang terletak di titik sebelum trakhea membagi dua. Lalu
kemudian mengalir melalui syrink. Udara tidak pergi langsung ke paru-paru, tetapi
perjalanan ke posterior (kantung udara ekor). Sejumlah kecil udara akan melewati
melalui kantung udara ekor untuk paru-paru. Ketika burung mengulangi inspirasi
kedua kalinya, udara bergerak ke kantung-kantung udara tengkorak.
Selama expirasi pertama, udara dipindahkan dari posterior menuju ke kantung
udara melalui ventrobronchi dan dorsobronchi ke paru-paru. Bronkus akan
membelah udara ke saluran kapiler dengan diameter yang lebih kecil. Darah kapiler
mengalir melalui kapiler udara dan ini adalah tempat oksigen dan karbondioksida
dipertukarkan. Pada saat ekpirasi yang kedua, udara bergerak keluar dari udara
tengkorak kantung, melalui syrink ke trakhea, melalui laring, dan akhirnya melalui
rongga hidung dan keluar dari lubang hidung (Sembiring, 2009).
2.2 Penyakit Bakterial pada Sistem Pernafasan Ayam

2.2.1 Chronic Respiratory Disease (CRD)
Chronic respiratory disease (CRD) merupakan penyakit menular
menahun pada unggas yang disebabkan oleh Mycoplasma gallisepticum yang
ditandai dengan sekresi pada hidung berupa cairan kataralis, kebengkakan
muka, batuk dan terdengarnya suara sewaktu bernafas. Pada infeksi yang
kompleks dengan infeksi lain seperti infeksi Escherichia coli atau viral maka
gejala klinis menjadi lebih parah. Chronic respiratory disease (CRD) pada
unggas menimbulkan kerugian yang besar dalam industri perunggasan
dikarenakan sifatnya yang endemik dan terjadi tidak hanya di Indonesia
melainkan di banyak negara di dunia (Kleven, 1998; Ley, 2003).
Mycoplasma gallisepticum (MG) merupakan organisme prokaryotik
terkecil, termasuk dalam kelas Molicutes yang memiliki dinding sel lunak.
Sel mikoplasma dikelilingi oleh 3 lapis plasma membran yang elastis, oleh
karena itu mikoplasma resisten terhadap penisilin dan derivatifnya yang
memiliki target pada dinding sel. Ukuran sel MG bervariasi antara 0,2-0,8
µm, berbentuk pleomorpik bervariasi dari sperikal atau seperti buah pear
5
sampai filamen bercabang atau helikal. Sel dapat diwarnai dengan pewarnaan
Giemsa atau Gram. Bentuk koloni pada media agar seperti telur mata sapi
dengan ukuran 0,1-1,0 cm, bulat, permukaan halus dan ditengahnya ada
bagian padat dan menonjol yang disebut bleb (Tajima et al., 1982). Sel
mikoplasma sangat rentan terhadap suhu udara luar dan dapat bertahan hidup
diluar tubuh ayam 1 hari pada suhu 37oC atau sampai 3 hari pada suhu 20°C
(Ley, 2003).
Diagnosis dapat dilakukan dengan melihat gejala klinis dan
pemeriksaan laboratorium. Akurasi diagnosis harus dilakukan dengan isolasi
atau deteksi kuman penyebab. Isolasi MG biasanya memerlukan waktu yang
panjang, karena pertumbuhannya memakan waktu 5-7 hari atau lebih lama.
Untuk identifikasi cepat dapat digunakan teknik immunofluorescent atau
immunoperoxidase. Teknologi PCR yang sangat peka dapat juga digunakan
untuk identifikasi antigen MG. Serologi seperti uji serum aglutinasi cepat
(SAC), inhibisi hemaglutinasi (IH), enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA) dapat digunakan untuk monitoring antibodi MG (Razin et al., 1998).
Pengobatan biasanya dilakukan dengan menggunakan antibiotika
makrolid seperti tiamulin, tylosin, lincomycin, oxytetracyclin dan
enrofloxacin yang memiliki daya kerja menghambat sintesis protein. Usaha
pencegahan CRD didasarkan atas pelaksanaan higiene, sanitasi dan
membesarkan anak ayam hanya yang berasal dari peternakan bebas CRD.
Tindakan vaksinasi dapat dilakukan dengan vaksin inaktif. Vaksinasi penting
dilakukan sebelum kelompok tersebut terinfeksi M.gallisepticum. Vaksinasi
inaktif terdiri dari suspensi M.gallisepticum yang pekat pada emulsi minyak.
Perlakuan dengan vaksin inaktif untuk pertumbuhan ayam dan untuk
mencegah turunnya produksi serta vaksinasi dua kali lebih baik daripada
sekali (Ferguson et al., 2012).
Monitoring dengan uji serologi untuk mendeteksi terjadinya infeksi
harus dilakukan secara berkala, sehingga jika terdeteksi adaya infeksi, MG
maka pengobatan dini dapat segera dilakukan. Uji serologi seperti SAC, IH
dan ELISA sangat baik untuk monitoring infeksi. Program all-in all-out,
merupakan program yang sangat baik untuk pencegahan penyakit infeksius
yang masuk ke dalam peternakan (Ley, 2003).
6
2.2.2 Coryza
Coryza adalah penyakit menular pada unggas yang menyerang sistem
pernapasan dan disebabkan oleh bakteri. Penyakit biasanya bersifat akut
sampai subakut dan dalam progresnya biasanya menjadi kronis. Penyakit ini
ditandai dengan radang katar pada selaput lendir alat pernafasan bagian atas
(rongga hidung, sinus infraobitalis dan trakea bagian atas) (Shankar, 2008).
Penyakit Coryza disebabkan oleh bakteri, berbentuk batang yang
pleomorfik tidak bergerak, bersifat gram negatif dan disebut Hemophilus
gallinarum. Didalam media buatan tidak mudah dibiakkan karena
memerlukan faktor XV dan V Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD).
Bakteri ini akan sangat baik tumbuhnya bila dibiakkan dalam media agar
darah dan dieramkan secara mikroaerofilik. Sifat alami bakteri ini tidak bisa
hidup lama, dan akan mati dalam waktu 4-5 jam (Quinn et al., 2002).
Pada saat ini dikenal sekurang-kurangnya 3 serotipe H.gallinarum.
Ketiga serotipe memiliki antigen bersama, oleh karena itu uji aglutinasi
dengan antigen yang dibuat dari salah satu serotipe dapat dipakai sebagai cara
diagnose untuk ketiga serotipe tersebut.
Gejala terlihat jika sekitar lubang hidung terdapat kerak eksudat yang
berwarna kuning. Sinus inftraorbital membengkak sangat besar, unilateral
maupun birateral. Akibatnya lipatan sekitar mata membengkak dan mata
menjadi tertutup. Suara ngorok terdengar pada saat hewan kesulitan bernafas,
diare dan pertumbuhan ayam menjadi terlambat dan kerdil. Diagnosa perlu
didasarkan atas anamnesa dan sejarah penyakit peternakan, gejala klinis dan
patologi-anatomi, yang terpenting harus didasarkan atas isolasi dan
identifikasi penyakit (Horner et al., 2012).
Terapi obat sulfonamide seperti sulfadimethoxine, sulfaquinoxaline,
sulfamethazine semuanya efektif, tapi sulfadimethoxine merupakan obat yang
paling aman. Pengobatan melalui air minum akan memberikan respon yang
cepat. Sedang pemakaian antibiotik yang menguntungkan antara lain
menggunakan tetracycline, erythromycin, spectinomycin dan tylosin, dimana
pemakaiannya relatif aman dan efektif untuk unggas. Bila suatu peternakan
tertular, supaya segera dilakukan pengobatan, ayam yang mati harus dibakar
pada tempat pembakaran yang khusus. Bila vaksin inaktif yang
diperdagangkan sudah cukup efektif maka vaksinasi yang teratur perlu
7
dilakukan. Selain pengobatan manajemen peternakan juga sama pentingnya
untuk mengendalikan penyakit antara lain sanitasi kandang, biosecurity dan
pemberian obat-obatan yang bersifat untuk pencegahan (Plumb, 1999;
Direktur Kesehatan Hewan, 2002).
2.2.3 Fowl Cholera

Kolera unggas adalah penyakit menular pada sistem pernapasan yang
menyerang unggas peliharaan dan unggas liar dengan angka morbiditas dan
mortalitas tinggi, disebabkan oleh bakteri Pasteurella multocida
(P.multocida) dan tersebar diseluruh dunia. Penyakit bersifat septikemik dan
biasanya berjalan akut, tetapi di daerah endemik pada bangsa burung yang
kurang peka penyakit ini dapat terjadi secara kronis.
Bakteri penyebab kolera unggas relatif tahan terhadap pengaruh alam.
Di dalam kotoran ayam, bakteri ini tahan sampai 1 bulan, pada bangkai ayam
dapat tetap hidup sampai 2 minggu dan di dalam air suhu -7°C sampai 18
hari. P.multocida masih tetap infektif pada preparat ulas darah yang
dikeringkan dalam suhu kamar selama 8 hari atau pada “cotton swab” kering
selama 118 jam. P.multocida mati pada pemanasan 60°C selama 10 menit. Di
alam terbuka, cahaya matahari mematikan bakteri ini dalam waktu 48 jam.
Desinfektan seperti kresol 3%, fenol 1%, formalin 1%, NaOH 0,5% atau
larutan HgCL2 1:5.000 juga dapat membunuh bakteri ini.
Pasteurella multocida, disebut juga P.aviseptica, P.avicida atau
P.cholera gallinarum adalah penyebab kolera unggas. Bakteri ini bersifat
aerob atau fakultatif anaerob dan tumbuh subur dalam agar darah atau serum
agar. Biakan yang masih muda berbau seperti rambut terbakar. Di bawah
mikroskop bakteri ini berbentuk ovoid, terkadang terlihat bipoler, berukuran
0,2-0,4x0,6-2,5 mikrometer, bersifat gram negatif dan tidak membentuk spora
(Quinn et al., 2002).
Masa inkubasi pada infeksi alam 4-9 hari, tetapi dalam percobaan 2
hari. Penyakit ini lebih banyak menyerang unggas umur 4 bulan ke atas.
Kolera unggas dapat berjalan perakut, akut dan kronis. Pada bentuk perakut
biasanya unggas mati tanpa tanda-tanda klinis yang jelas. Bentuk akut
ditandai dengan konjungtivitis dan keluar kotoran dari mata. Daerah facial,
balung dan pial membesar, serta terdapat gangguan pernapasan. Feses encer
8
berwarna hijau kekuningan. Unggas mengalami kelumpuhan akibat
peradangan pada sendi tarsus. Bentuk kronik dapat terjadi beberapa minggu
sampai beberapa bulan, yang dapat berupa infeksi lokal pada pial, sendi kaki
dan sayap hingga basal otak. Pial membengkak berisi cairan oedema sampai
masa perkejuan, terutama pada bangsa unggas yang mempunyai pial besar.
Infeksi di daerah kaki dan sayap ditandai dengan kebengkakan pada sendi
kaki dan sayap, diikuti kelumpuhan. Gejala tortikolis menandakan ada infeksi
lokal pada telinga dan basal otak.
Diagnosa didasarkan sejarah kejadian penyakit, tanda-tanda klinis,
kelainan post infeksi mati dan diperkuat dengan pemeriksaan laboratorium.
Pemeriksaan langsung dengan tempel jaringan diwarnai dengan pengecatan
Gram atau Wright Mehtylen Blue kemudian diperiksa secara mikroskopik
akan terlihat kuman berbentuk ovoid dan bipoler. Diagnosa akhir harus
didukung dengan identifikasi bakteri. Bahan isolasi bakteri dapat diambil dari
sunsum tulang, darah, jantung, hati, atau lesi fokal yg terbentuk pada infeksi
kolera unggas kronis. Pengobatan kolera unggas dapat menggunakan
antimikroba sebagai berikut: preparat sulfa, streptomycin dan terramisin.
Tindakan pencegahan dan pengendalian dapat dilakukan dengan jalan
vaksinasi, sanitasi peternakan, dan adanya hewan sakit harus segera
dipisahkan dan diobati (Direktur Kesehatan Hewan, 2002).
9
BAB 3 METODOLOGI
3.1 Tempat dan Waktu

Kegiatan PPDH rotasi diagnosa laboratorik mikrobiologi ini dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi (Bakteriologi) Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Airlangga selama delapan hari mulai tanggal 27 Januari 2017 sampai dengan
tanggal 3 Februari 2017.
3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam pemeriksaan mikrobiologi antara lain
autoclave, inkubator, cawan petri, tabung reaksi, tabung durham, erlenmeyer,
refrigerator, timbangan mikro, inoculating loop terdiri dari ose bulat dan ose
lurus, mikroskop, bunsen, pemanas, rak tabung reaksi, object glass,
alumunium foil, spuit, botol pewarnaan gram, dissecting set, nampan, cawan
petri, bak pewarnaan, timer, kertas bungkus sterilisasi, plastik tahan panas,
cotton bud steril, spidol marker, kertas label, alat tulis, kapas, tissue, masker,
gloves dan korek api.
3.2.2 Bahan
Sampel berupa ayam yang kemudian dinekropsi dan diambil sampel
organ pernafasan pada ayam tersebut yang diduga terserang penyakit
pernafasan. Sampel berupa swab discharge nasal, gerusan organ pangkal
trakea (laring dan faring), jantung dan hepar. Bahan yang digunakan untuk
isolasi meliputi media Blood Agar (BA), Trypticase Soy Agar (TSA), Mac
Conkey Agar (MCA), Chocolate Agar (CA) darah kelinci, antikoagulan
(sitrat), larutan gula-gula (manitol, sukrosa, glukosa, laktosa, dan maltosa),
Simon Sitrat Agar, Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Urea Agar, Sulphide
Indol Motility Agar (SIM), aquades steril, spiritus dan alkohol 70%. Bahan
identifikasi biokimia meliputi Hydrogen peroksida (H2O2), gentian violet,
kalium hidroksida (KOH), cloroform dan reagen kovacs. Bahan pewarnaan
gram (kristal violet, lugol, alkohol aseton, safranin), tap water dan minyak
emersi.
10
3.3 Metode
3.3.1 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ
 Unggas masih dalam keadaan hidup, diperiksa tubuh bagian luar dan
diamati gejala klinis.
 Unggas yang masih dalam kondisi hidup dibunuh (eutanasi) dengan cara
emboli udara ke dalam foramen magnum.
 Diamati warna pial dan cuping telinga. Diperhatikan adanya diare, leleran
dari paru, nares dan mata serta kemungkinan adanya kebengkakan dan
perubahan warna daerah wajah. Dilakukan pengambilan swab discharge
nasal kemudian diletakkan dalam tabung reaksi yang telah diberi aquades
steril.
 Bangkai dibasahi dengan air, untuk menghindari bulu tidak berterbangan,
hal ini dilakukan untuk mengurangi kontaminasi.
 Bangkai dibaringkan pada bagian dorsal dan dibuat irisan pada kulit di
bagian medial paha dan abdomen pada kedua sisi tubuh.
 Paha ditarik ke bagian lateral dan diteruskan irisan dengan pisau sampai
persendian coxo femoralis.
 Dilakukan irisan kulit pada bagian medial dari kaki atau paha dan
diperiksa otot dan persendian.
 Dilakukan pengirisan melintang pada kulit daerah abdomen, selanjutnya
kulit ditarik ke bagian anterior dan irisan tersebut diteruskan ke daerah
thorax sampai mandibula. Irisan pada kulit juga diteruskan ke bagian
posterior di daerah abdomen.
 Pemotongan dan menyingkirkan bagian dada sehingga tampak organ
dalam, selanjutnya diamati letak organ, adanya cairan pada rongga perut/
peritoneum dan rongga dada.
 Dilakukan pengambilan sampel organ (pangkal trachea, hepar dan jantung)
secara aseptis, yaitu dengan memanaskan alat pemotong dengan bunsen
untuk ditempelkan pada permukaan organ hepar dan jantung.
3.3.2 Pembuatan Media

3.3.2.1 Blood Agar (BA)
 Media BA ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan ke dalam
aquades lalu dihomogenkan.
11
 Setelah itu dilakukan sterilisasi pada media dengan menggunakan
autoclave dengan suhu 121°C selama 15 menit.
 Kemudian ditambahkan dengan darah kelinci 7% (5-10%) pada
suhu 40-45°C dan dihomogenkan.
 Media dituangkan ke dalam petridish steril ditunggu hingga
memadat.
 Setelah itu dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasi pada suhu
37°C selama 18-24 jam.
3.3.2.2 Chocolate Agar (CA)
 Media BA ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan ke dalam
aquades lalu dihomogenkan.
 Setelah itu dilakukan sterilisasi pada media dengan menggunakan
autoclave dengan suhu 121°C selama 15 menit.
 Kemudian ditambahkan dengan darah kelinci 7% (5-10%) pada
suhu 85°C dan dihomogenkan.
 Media dituang dalam petridish steril ditunggu hingga memadat.
 Setelah itu dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasi pada suhu
37°C selama 18-24 jam.
3.3.2.3 Trypticase Soy Agar (TSA)
 Media TSA ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan ke dalam
aquades steril, dihomogenkan diatas pemanas hingga larutan jernih.
 Media disterilkan dengan menggunakan autoclave pada suhu
121°C selama 15 menit.
 Media dituang ke dalam cawan petri steril ditunggu hingga
memadat dan dilabel.
 Setelah padat, dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasikan di
inkubator pada suhu 37°C selama 18-24 jam.
3.3.2.4 Mac Conkey Agar (MCA)
 Ditimbang media MCA sesuai kebutuhan, lalu dimasukkan dalam
erlenmeyer steril.
 Dilarutkan dengan aquades steril kemudian dihomogenkan diatas
pemanas hingga larutan menjadi jernih.
 Dilakukan sterilisasi pada media dengan menggunakan autoclave
pada suhu 121°C selama 15 menit.
12
 Media dituangkan ke dalam cawan petri steril ditunggu hingga
memadat dan dilabel.
 Dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasi pada suhu 37°C
selama 18-24 jam.
3.3.2.5 Media gula-gula
 Ditimbang pepton dan ditambahkan aquadest untuk membuat
larutan pepton dan dihomogenkan.
 Panaskan larutan pepton sampai mendidih.
 Sterilkan larutan peptop menggunakan autoclave pada suhu 121°C
selama 15 menit.
 Dalam 100 ml larutan peptop steril tambahakan masing-masing 2
gram glukosa, manitol, laktosa, sukrosa dan maltosa.
 Ditambahkan 1,5 ml methyl red.
 Dimasukkan dalam tabung reaksi yang terdapat tabung durham di
dalamnya sebanyak 5 ml.
3.3.2.6 Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
 Ditimbang serbuk TSIA dan dilarutkan dalam aquades.
 Didihkan hingga terlarut sempurna.
 Disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit menggunakan
autoclave.
 Setelah agak dingin (±50°C) dituang dalam tabung dan dimiringkan
sedemikian rupa (dengan sudut ± 45°).
3.3.2.7 Urea Agar
 Ditimbang serbuk urea dan dilarutkan dalam aquades.
 Dibiarkan selama 15 menit.
 Didihkan kemudian disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit
menggunakan autoclave.
 Setelah agak dingin (± 50°C) ditambahkan 5 ml urea cair 40%
(SR20) dan dicampur.
 Dituangkan ke dalam tabung reaksi dan dimiringkan sedemikian
rupa (dengan sudut kemiringan 25°).
3.3.2.8 Simmon Citrat Agar
 Ditimbang serbuk simon citrat dan dilarutkan dalam aquades.
13
 Didihkan hingga terlarut sempurna, kemudian disterilkan pada
suhu 121°C selama 15 menit menggunakan autoclave.
 Dituangkan ke dalam tabung reaksi dan dimiringkan sedemikian
rupa (dengan sudut kemiringan 25°).
3.3.2.9 Sulphide Indol Motility (SIM)
 Ditimbang serbuk SIM dan dilarutkan dalam aquades.
 Didihkan hingga terlarut sempurna, kemudian disterilkan pada
suhu 121°C selama 15 menit menggunakan autoclave.
 Dituangkan ke dalam tabung reaksi.
3.3.3 Isolasi dan Identifikasi

Sampel berupa swab discharge nasal, gerusan organ pangkal trakea,
hepar dan jantung dari ayam kampung. Isolasi bakteri dari organ hepar,
jantung dan pangkal trakhea ditanam pada media TSA (Trypcase Soy Agar),
lalu pada media Blood Agar (BA) ditanam sampel dari pangkal trakea dan
jantung. Sedangkan isolasi bakteri dari organ hepar ayam ditanam pada Mac
Conkey Agar (MCA) untuk melihat adanya infeksi sekunder E.coli pada
hepar. Isolasi bakteri dari sampel swab discharge nasal dilakukan penanaman
pada media pada Chocolate Agar (CA). Media yang digunakan untuk
penanaman bakteri diinkubasikan 37°C selama 24 jam guna mengetahui sifat,
jenis dan tipe koloni yang tumbuh. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gram
lalu diamati di bawah mikroskop.
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan untuk mengetahui bentuk, ukuran,
susunan dan warna bakteri yang tumbuh, sehingga perlu dilakukan
pewarnaan. Pada pemeriksaan ini dilakukan pewarnaan gram untuk
membedakan bakteri gram positif (+) atau gram negatif (-).
Metode pewarnaan gram dilakukan dengan membuat preparat ulas
koloni dan media, kemudian difiksasi hingga kering. Ditambahkan gentian
violet, diamkan selama 5-10 menit Dibilas dengan air yang mengalir.
Ditambahkan lugol dan diamkan selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir
kemudian ditetesi alkohol aseton selama 5-10 detik. Dibilas dengan air.
Setelah itu ditetesi safranin selama 10-30 detik, kemudian cuci dengan air
14
mengalir. Peparat dikeringkan dengan tissue lalu diperiksa di bawah
mikroskop dengan perbesaran 1000x dan tambahkan dengan minyak emersi.
Koloni yang tumbuh pada media dilakukan isolasi sekunder untuk
pemurnian koloni dan identifikasi dengan pewarnaan gram, untuk mengetahui
sifat gram dan morfologi secara mikroskopis. Selanjutnya koloni yang
didapat dilakuan identifikasi dengan uji katalase dan uji gram dengan KOH.
Uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan larutan H2O2 3% pada
objek glass. Diambil koloni bakteri dengan ose dan didiamkan dengan larutan
H2O2 3%. Diamati, apabila timbul gelembung maka reaksi positif (+), jika
tidak ada maka reaksi negatif (-). Reaksi negatif menunjukan bahwa koloni
tersebut termasuk genus Diplococcus spp. Reaksi positif menunjukan bahwa
koloni tersebut termasuk genus Bacillus spp.
Uji gram juga dapat dilakukan dengan cara meneteskan larutan KOH
3% pada objek glass. Diambil koloni bakteri dengan ose dan dihomogenkan
dengan larutan KOH 3%. Diamati, apabila terbentuk lendir atau gel maka
reaksi positif (+) menunjukkan bahwa koloni bakteri tersebut adalah gram
negatif (-).
15
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 PEMERIKSAAN KLINIS

4.1.1 Sampel Ayam
a. Signalement
Jenis Hewan : Ayam
Ras : Gallus domestica
Asal Hewan : Peternakan Ayam di Blitar
Jenis Kelamin : Jantan
Usia : ± 20 minggu
Berat badan : ± 0,5 kg
b. Anamnesa
Berdasarkan keterangan pemilik, ayam tersebut tidak mau makan
lebih dari 3 hari, memisah dari kelompok ayam yang lain dan tampak
murung. Ayam tersebut juga tampak lemas, kurus, mengalami
kesulitan bernapas, bersin, keluar leleran dari hidung serta terdengar
suara ngorok.
c. Temuan klinis
Hasil pemeriksaan fisik menunjukkan bahwa ayam mengalami
pembengkakan pada daerah wajah sampai daerah pial. Ayam
mengalami kesulitan bernafas yang ditandai sesekali menengadahkan
kepala ke atas diikuti suara ngorok dan membuka mulut untuk
mengambil udara serta pada daerah kloaka terlihat kotor. Pertautan
massa otot pada ayam tampak jelek, dengan terlihatnya os sternum
pada ayam. Pertumbuhan bulu ayam juga jelek dan tampak kusam.
d. Diagnosa banding
Berdasarkan hasil anamnesa dan temuan klinis, maka diagnosa
banding yang diperoleh yaitu penyakit bakterial pernafasan seperti
Cronic Respiratory Disease, Fowl Cholera, atau Coryza.
e. Pemeriksaan penunjang
Pemeriksaan penunjang yang dilakukan untuk meneguhkan
diagnosa tersebut, yaitu dengan melakukan bedah bangkai,
pemeriksaan patologi dan pemeriksaan mikrobiologi pada organ
16
pangkal trakea, jantung dan hepar serta pengambilan sampel swab
discharge nasal.
4.2 PEMERIKSAAN PATOLOGI

Pada sampel ayam tersebut kemudian dilakukan pemeriksaan secara
makroskopis patologi anatomi untuk mengetahui adanya perubahan pada organ.
Berikut adalah hasil pemeriksaan makroskopis patologi anatomi dari sampel
ayam tersebut:
Gambar 4.1 Hasil nekropsi ayam

(Sumber: Dokumentasi pribadi)
Tabel 4.1 Perubahan makroskopis patologi anatomi
No Organ Perubahan
1 Kepala Ada pembengkakan
2 Mata Ada pembengkakan daerah konjungtiva
3 Hidung Ada leleran
4 Mulut Normal
5 Trakea Ada hemoragi
6 Paru-paru Normal
7 Hepar Ada ptechiae
8 Jantung Selaput jantung tampak keruh
9 Proventrikulus Normal
10 Ventrikulus Normal
11 Intestine Normal
12 Air sac Keruh pada daerah thoracocranialis
17
Berdasarkan hasil pemeriksaan patologi anatomi, tampak terjadi
perubahan yaitu pada daerah kepala yang mengalami pembengkakan, pada mata
terjadi konjungtivitis, terdapat discharge pada hidung, pada trakea terjadi
peradangan, pada hepar tejadi peradangan yang ditandai oleh adanya ptechiae,
pada jantung lapisan pericardium tampak keruh serta pada air sac terjadi
airsaculitis. Hal ini kemungkinan pada sampel yang diperiksa diduga terserang
penyakit bakterial yang menyebabkan gangguan pernapasan pada ayam
tersebut. Oleh sebab itu perlu dilakukan pemeriksaan mikrobiologi untuk
menentukan diagnosa yang tepat melalui isolasi dan identifikasi agen penyebab
penyakit tersebut.
4.3 PEMERIKSAAN MIKROBIOLOGI

Setelah dilakukan pemeriksaan patologi, kemudian sampel organ ayam
yaitu pangkal trakea, jantung, hepar dan swab discharge nasal dilakukan
pemeriksaan mikrobiologi yang meliputi isolasi primer, isolasi sekunder atau
pemurnian dan identifikasi bakteri penyebab penyakit pada saluran pernafasan.
Tabel 4.2 Sampel pemeriksaan dan media isolasi
No Sampel Media
1 Swab discharge nasal CA
2 Pangkal trakea TSA, BA
3 Hepar TSA, MCA
4 Jantung TSA, BA
Keterangan: BA : Blood Agar

CA : Chocolate Agar
MCA : Mac Conkey Agar
TSA : Trypticase Soy Agar
4.3.1 Isolasi Primer

Isolasi mikroorganisme merupakan upaya pembiakkan suatu jenis
mikroorganisme tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu
media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi
dan konfirmasi. Media spesifik merupakan media yang digunakan untuk
mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroorganisme.
18
Setiap mikroorganisme memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang
spesifik sehingga hal ini dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media
untuk isolasi, identifikasi dan konfirmasi (Pelczar, 2006).
Pada umumnya media yang digunakan untuk menumbuhkan atau
membiakkan mikroorganisme mengandung; air, protein, karbohidrat,
sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen, asam amino
dan vitamin. Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroorganisme
untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya secara normal
diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroorganisme tertentu. Setiap
media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat
mendukung pertumbuhan mikroorganisme tertentu tetapi menghambat
pertumbuhan mikroorganisme lainnya (Lay, 1994). Dalam hal ini, media
yang digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme tertentu dari sampel
gerusan organ ayam dan swab discharge nasal adalah media MCA, BA,
CA dan TSA. Berikut adalah hasil pemeriksaan isolat mikrooganisme
pada beberapa media tersebut:
a. Media Mac Conkey Agar (MCA)
Mac Conkey Agar (MCA) adalah salah satu jenis media padat
yang digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Mac Conkey Agar
(MCA) termasuk dalam media selektif dan diferensial bagi bakteri.
Jenis bakteri tertentu akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang
khas apabila ditumbuhkan pada media ini. Mac Conkey Agar (MCA)
merupakan media selektif untuk isolasi dan identifikasi bakteri gram
negatif. Media ini digunakan untuk membedakan bakteri yang
memfermentasi laktosa dan yang tidak memfermentasi laktosa. Media
ini mengadung agar, peptone, laktosa, garam empedu, sodium chloride,
dan neutral red sebagai indikator warna. Media ini akan menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dengan adanya garam empedu yang
akan membentuk kristal violet. Bakteri gram negatif yang tumbuh
dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasikan laktosa.
Koloni bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata
dan dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu. Endapan ini
disebabkan oleh penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi
19
dengan garam empedu. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa
biasanya bersifat patogen. Golongan bakteri ini tidak memperlihatkan
perubahan pada media. Hal ini berarti warna koloninya sama dengan
warna media. Warna koloni dapat dilihat pada bagian koloni yang
terpisah (Lay, 1994).
Gambar 4.2a Hasil isolasi pada Gambar 4.2b Hasil mikroskopis

media MCA pada media MCA
(Sumber: Dokumentasi pribadi) (Sumber: Dokumentasi pribadi)
Hasil pemeriksaan pada media MCA menunjukkan bahwa isolat

bakteri yang tumbuh berwarna merah bata, dengan koloni kecil hingga
besar dan beberapa ada yang mucoid (Gambar 4.2a). Sesuai dengan
fungsinya, media MCA digunakan untuk membedakan jenis bakteri
yang mampu memfermentasi laktosa dengan bakteri yang tidak mampu
memfermentasi laktosa. Bakteri yang dapat tumbuh pada media ini
antara lain Pseudomonas, Salmonella, E.coli, Enterobacter, Klebsiella
dan Shigella. Menurut Luis et al. (2004), koloni Pseudomonas,
Salmonella dan Shigella yang tumbuh di media ini cirinya halus dan
tak berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Sedangkan
koloni E.coli, Klebsiella dan Enterobacter gram negatif akan
memproduksi asam dan berwarna merah bata karena mempunyai
keistimewaan dapat memfermentasi laktosa. Beberapa jenis bakteri
seperti Klebsiella dan Enterobacter dapat memproduksi mucoid
sehingga tampak lembab. Hal ini terjadi karena bakteri membentuk
kapsul melalui metabolisme kandungan laktosa di dalam media.
Anderson (2013) juga menambahkan, kemampuan bakteri E.coli dalam
20
memfermentasi laktosa menyebabkan terjadinya penurunan pH,
sehingga mempermudah absorbsi neutral red untuk mengubah koloni
menjadi merah bata. Sedangkan pada hasil pemeriksaan mikroskopis
dengan pewarnaan gram didapatkan hasil bakteri berbentuk batang
pendek dan bersifat gram negatif atau berwarna merah (Gambar 4.2b).
Sehingga pada pemeriksaan ini bakteri yang diduga tumbuh pada
media ini adalah E.coli. Oleh karena itu untuk mengetahui secara pasti
jenis bakteri yang tumbuh pada media isolasi maka perlu dilakukan
pemurnian.
b. Media Blood Agar (BA)
Blood Agar (BA) merupakan media padat dan media diferensial.
Media diferensial adalah media yang ditambah zat kimia tertentu
sehingga suatu mikroorganisme membentuk pertumbuhan untuk
mengklasifikasikan suatu kelompok jenis bakteri. Media ini dapat
membedakan bakteri patogen berdasarkan efek exotoksin hemolitik
bakteri terhadap eritrosit. Media Blood Agar (BA) juga bukan termasuk
jenis media selektif karena semua jenis bakteri dapat tumbuh pada
media ini. Komposisi Blood Agar (BA) yaitu mengandung trypton, soy
peptone, sodium khloride, lithium khloride, magnesium sulphate, agar
dan eritrosit domba/kelinci (Madigan dan Martinko, 2005).
Media Blood Agar (BA) digunakan untuk membedakan bakteri
hemolitik dan nonhemolitik yaitu berdasarkan kemampuan bakteri
tersebut untuk melisiskan sel-sel darah merah. Ada tiga jenis hemolisis
yaitu beta hemolisis, alfa hemolisis, dan gamma hemolisis. Beta
hemolisis merupakan lisis lengkap sel darah merah dan hemoglobin
sehingga bakteri pada media berwarna kehijauan. Alfa hemolisis
mengacu pada lisis parsial/lisis sebagian dari sel darah merah dan
hemoglobin sehingga bakteri pada media berwarna kecoklatan. Hal ini
menghasilkan perubahan warna disekitar menjadi abu-abu kehijauan.
Gamma hemolisis yaitu tidak terjadi hemolisis dimana tidak ada
perubahan warna dalam media (Lay, 1994).
Hasil pemeriksaan pada media BA menunjukkan bahwa isolat
bakteri yang tumbuh berwarna putih kekuningan, dengan koloni kecil
21
hingga besar, beberapa koloni tampak mucoid dan terdapat koloni yang
mampu menghemolisis media menjadi kehijauan (Gambar 4.3a).
Golongan bakteri yang dapat tumbuh pada media ini antara lain
Pasteurella, Klebsiella, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus,
Listeria, Clostridium, E.coli dan Bacillus (Luis et al, 2004).

media BA pada media BA
Menurut Madigan dan Martinko (2005), beberapa jenis bakteri

yang mampu menghemolisis media dan menyebabkan perubahan
warna pada media menjadi kehijauan adalah bakteri golongan
Pasteurella dan Streptococcus. Terjadinya hemolisis dan perubahan
warna media menjadi kehijauan disebut golongan beta hemolisis. Hal
ini disebabkan karena golongan bakteri ini memiliki exotoksin yang
mampu melisiskan atau menghancurkan eritrosit. Sedangkan pada hasil
pemeriksaan mikroskopis menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh
berbentuk basil/batang dan terlihat berspora serta bersifat gram positif
(Gambar 4.3b). Sehingga kemungkinan koloni bakteri yang tumbuh
pada media ini bukanlah bakteri pathogen penyebab penyakit
pernafasan melainkan bakteri pencemar yaitu Bacillus sp.
c. Media Trypticase Soy Agar (TSA)
Trypticase Soy Agar (TSA) merupakan media agar yang
digunakan untuk kegiatan pengisolasian dan pembudidayaan berbagai
macam mikroorganisme yang bersifat aerobik. Medium ini digunakan
untuk berbagai tujuan yang mencakup pemeliharaan stok budidaya,
22
isolasi berbagai macam spesies mikroorganisme, serta sebagai dasar
untuk media termasuk darah. Komposisi dari TSA ini antara lain
Approximate Formula, Per Liter Purified Water, Pancreatic Digest of
Casein, Papaic Digest of Soybean, Sodium Chloride, dan agar
(Biberstein and Yuan, 2004). Namun pada media ini terdapat
kelemahan yaitu pada media TSA semua mikroorganisme mampu
tumbuh di media ini karena TSA termasuk media universal sehingga
mempersulit untuk identifikasi koloni.

media TSA pada media TSA
Hasil dari penanaman pada media TSA didapatkan koloni

berwarna putih kekuningan, konsistensi lunak (Gambar 4.4a) dan
hasil pemeriksaan mikroskopis terlihat bakteri batang pendek, gram
negatif (Gambar 4.4b), sehingga dapat disimpulkan bahwa pada
media TSA tidak ditemukan bakteri Pasteurella multocida yang
berbentuk coccus melainkan pada media TSA telah ditemukan bakteri
E.coli yang berbentuk batang. Untuk mempertimbangkan tumbuhnya
koloni Pasteurella sp. pada media TSA yaitu dengan ciri membentuk
koloni berwarna putih kebiruan atau putih kehijauan fluorosence,
berbentuk mukoid (berlendir) dan semakin lama menjadi bentuk
smooth (halus) atau rough (kasar). Bakteri Pasteurella multocida dapat
menimbulkan gas yang berbau (Priadi dan Natalia, 2000).
Sedangkan bakteri E. coli merupakan kuman dari kelompok gram
negatif, berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas
23
antara satu dengan yang lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-
dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti rantai pendek,
tidak membentuk spora maupun kapsula, berdiameter ± 1,1-1,5 x 2,0-
6,0 µm (Anderson, 2013).
d. Media Chocolate Agar (CA)
Chocolatea Agar (CA) adalah media pertumbuhan non selektif
diperkaya. Media CA berisi sel-sel darah merah yang telah dilisiskan
pada suhu 80°C. Media CA digunakan untuk pertumbuhan bakteri yang
membutuhkan Nictonamide Adenine Dinucleotida (NAD) dan hematin
yang berada di dalam sel darah merah. Bakteri yang membutuhkan
NAD dan hematin seperti Haemophilus spp, Neisseria spp, dan
Gardnerella. Media CA sama seperti Blood Agar (BA), tetapi pada CA
darah yang digunakan dilisiskan terlebih dahulu sebelum dimasukan ke
larutan agar. Setelah lisis sel eritrosit mengeluarkan bahan-bahan
intraseluler seperti haemoglobin, hemin dan jenis ko-enzim
Nicotinamide Adenine Dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh
bakteri yang sukar tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna
cokelat pada media sehingga disebut agar cokelat (Smith, 1997).

media CA pada media CA
Penanaman sampel dari swab discharge nasal ayam kampung

pada media CA diharapkan dapat menumbuhkan koloni bakteri dan
dapat mengidentifikasi adanya bakteri Haemophilus spp., yang ditandai
dengan koloni bulat putih dan mengkilat (Biberstein and Yuan, 2004).
24
Namun hasil penanaman pada media CA didapatkan koloni berwarna
putih krem, non hemolisis (Gambar 4.5a) dan hasil pemeriksaan
mikroskopis menunjukkan bahwa bakteri berbentuk coccus dan bersifat
gram negatif (Gambar 4.5b). Berdasarkan hasil isolasi primer diatas,
tidak menunjukan adanya pertumbuhan koloni bakteri Haemophilus
spp. Bakteri Haemophilus adalah jenis bakteri yang menyerang saluran
pernafasan pada unggas. Menurut Quinn et al. (2002), bakteri
Hemophilus gallinarum berbentuk batang, pleomorfik, non motil,
bersifat gram negatif.
4.3.2 Isolasi Sekunder atau Pemurnian

Dalam pemurnian mikroba dikenal istilah isolasi mikroba dan kultur
murni. Pemurnian merupakan kegiatan untuk mendapatkan koloni murni
mikroorganisme yang ditumbuhkan sebelumnya (Rohimat, 2002). Kultur
murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari
satu sel tunggal, artinya mikroba ditumbuhkembangkan dari bakteri yang
dihomogenkan dengan kata lain bakteri di isolasikan agar didapatkan
bakteri murni yang dibutuhkan nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek
yang harus diperhatikan adalah bakteri (Suriawiria, 2005).
Pada pemeriksaan ini media yang dilakukan isolasi sekunder atau
pemurnian adalah sampel bakteri yang berasal dari media MCA yang
didapatkan dari isolasi primer. Pemurnian ini dilakukan dengan memindah
sebagian koloni mikroorganisme ke dalam media pertumbuhan yang baru
sehingga di dapat koloni murni yang di harapkan. Pemurnian bakteri
dilakukan dengan cara penggoresan menggunakan jarum ose yang
dipanaskan terlebih dulu sampai berwarna merah dan didiamkan sebentar
hingga tidak panas lagi kemudian digunakan untuk mengambil koloni
bakteri, setelah pengambilan koloni bakteri baru dilakukan penggoresan
dengan pola zig-zag pada cawan petri yang talah diberi media tumbuh
bakteri (Rohimat, 2002).
a. Media Mac Conkey Agar (MCA)
Hasil pemeriksaan makroskopis isolasi primer pada media MCA
sebelumnya menunjukkan bahwa isolat bakteri yang tumbuh berwarna
25
merah bata, dengan koloni kecil hingga besar dan beberapa ada yang
tampak mucoid (Gambar 4.2a). Koloni yang tampak mucoid diduga
merupakan koloni bakteri E. coli, sehingga perlu dilakukan isolasi
sekunder untuk memastikan jenis koloni tersebut.
Gambar 4.6a Koloni hasil pemurnian pada media MCA

Hasil dari isolasi sekunder atau pemurnian pada media MCA

menunjukkan bahwa koloni yang tumbuh berukuran sedang, berwarna
merah bata, metalik, smooth, keping atau sedikit cembung (Gambar
4.6a). Koloni yang telah dimurnikan kemudian dilakukan uji
morfologi. Uji morfologi dilakukan melalui uji KOH dan pewarnaan
gram dari koloni bakteri tersebut.
Gambar 4.6b Uji KOH Gambar 4.6c Hasil mikroskopis

terbentuk lendir pemurnian MCA
Pemeriksaan menggunakan larutan KOH 3% berguna untuk

memperjelas pemeriksaan terhadap sifat gram. KOH dinyatakan positif
26
pada bakteri yang diamati adalah termasuk gram negatif jika terdapat
lendir atau gel (Lay, 1994). Berdasarkan pemeriksaan tersebut, bakteri
yang dibiakkan pada media MCA dari sampel termasuk gram negatif
karena terdapat bentukan lendir atau gel (KOH +) pada uji KOH
(Gambar 4.6b). Hasil pewarnaan gram juga menunjukkan bahwa
bakteri yang tumbuh merupakan kelompok bakteri gram negatif
berbentuk batang (Gambar 4.6c).
Hasil pemurnian dan uji morfologi bakteri memperkuat dugaan
bahwa isolat koloni merupakan bakteri E. coli. Bakteri E. coli
merupakan kuman dari kelompok gram negatif, berbentuk batang dari
pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang lainnya
tetapi ada juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga
yang bergandeng seperti rantai pendek, tidak membentuk spora
maupun kapsula, berdiameter ± 1,1-1,5 x 2,0-6,0 µm (Anderson, 2013).
Hal tersebut terlihat dari hasil pewarnaan dan uji KOH yang
menunjukkan bakteri gram negatif dengan bentuk batang. Koloni E.
coli memiliki ukuran sedang, berwarna merah bata, metalik, smooth,
keping atau sedikit cembung (Biberstein, 2004). Adanya bakteri ini
dalam pemeriksaan kelainan sistem pernafasan biasanya bersifat
patogen yang terdistribusi melalui aliran darah.
4.3.3 Identifikasi
a. Uji Gula-gula
Uji gula-gula yang dilakukan pada pemeriksaan ini adalah uji
maltosa, laktosa, sukrosa, manitol, dan glukosa. Uji gula-gula bertujuan
untuk mendeterminasi kemampuan bakteri dalam mendegradasi gula
dan menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap-tiap jenis gula.
Pertama-tama kaldu karbohidrat ditandai dengan etiket,
kemudian biakan bakteri diinokulasikan ke dalam kaldu karbohidrat,
selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Uji gula-
gula bersifat positif apabila terlihat perubahan warna menjadi
kekuningan dan negatif apabila warnanya tetap merah (Lay, 1994).
27
Berdasarkan hasil uji yang telah dilakukan, menunjukkan bahwa
bakteri dapat memfermentasi gula yang ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna media menjadi kekuningan (Gambar 4.7).
Fermentasi adalah proses pemecahan senyawa makromolekul organik
menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada
kondisi anaerob. Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi
dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya difermentasi
menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, piruvat, format,
asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas (Pelczar,
2006).
A B C
D E
Gambar 4.7 Hasil (+) uji gula-gula: Glukosa positif (A), Laktosa positif (B),
Maltosa positif (D), Manitol positif (D), dan Sukrosa positif (E)
b. Uji Sulfat Indol Motility (SIM)

Uji SIM dilakukan untuk membedakan bakteri motil dan bakteri
non motil. Motilitas bakteri dapat diamati dari pertumbuhan bakteri
pada media. Diambil bakteri dengan menggunakan jarum ose,
kemudian bakteri ditanam secara tegak lurus ditengah medium SIM
(sulfat indol motility) dengan cara ditusukkan, diinkubasi pada suhu
37°C selama 24 jam. Hasil positif (+) ditunjukkan dengan pertumbuhan
bakteri menyebar menjauhi garis inokulasi (pergerakan) sehingga
media manjadi keruh. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan
28
pertumbuhan hanya terlihat disepanjang garis inokulasi dan media
tidak menjadi keruh (Hadioetomo, 1990).
Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah positif (+) pada indol
dan motilitas, yaitu terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih
keruh seperti akar menjalar disekitar inokulasi dan terbentuk cincin
berwarna merah pada permukaan biakan (Gambar 4.8). Hal ini
menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan dan
berarti bahwa bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai
sumber karbon. Namun didapatkan hasil negatif (-) pada hidrogen
sulfat (H2S) karena tidak terbentuk endapan berwarna hitam (Waluyo,
2004).
Gambar 4.8 Hasil (+) uji Sulfat Indol Motility (SIM)

c. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Triple Sugar Iron Agar (TSIA) adalah media deferensial yang
digunakan dalam menentukan bakteri yang dapat melakukan
fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, uji TSIA ini juga
dapat mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. Uji
TSIA dapat membedakan bakteri berdasarkan kemampuannya dalam
memfermentasi laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi hidrogen
sulfida. Uji TSIA paling sering digunakan dalam mengidentifikasi
Enterobacteriaceae, meskipun juga berguna untuk bakteri gram negatif
lainnya yang mampu memfermentasi glukosa/laktosa/sukrosa dan
produksi H2S yaitu dengan ditunjukkannya perubahan warna agar
menjadi berwarna kuning (Lehman, 2005). Fermentasi merupakan
29
salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi
adalah proses pemecahan senyawa makromolekul organik menjadi
senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi
anaerob (Pelczar, 2006).
Gambar 4.9 Hasil (+) uji TSIA

Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukkan

hasil yang positif karena terjadi perubahan warna pada media
(Gambar 4.9) serta produksi gas namun negatif pada H2S. Warna
kuning pada keseluruhan media tersebut dikarenakan E. coli pada
media TSIA dapat memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa
menjadi asam organik sebagai sumber energi. Fermentasi dapat
menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi
karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti
asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dan gas (Leboffe, 2011).
d. Simmon Sitrat
Uji Simmon Sitrat bertujuan untuk mendeteksi kemampuan suatu
organisme untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber
karbon dan energi. Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung
natrium sitrat dan indikator pH bromothymol biru. Media juga
mengandung garam amonium anorganik, yang digunakan sebagai satu-
satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat melibatkan enzim citrat
permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat.
Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi
Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium
30
masing-masing menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan
perubahan warna medium dari hijau menjadi biru (Hemraj, 2013).
Simmon sitrat atau nama lainnya Simmons Citrate Medium
mengandung amonium dihidrogen fosfat, natrium klorida, natrium
sitrat, magnesium sulfat, agar, bromtimol biru, aquades dan memiliki
pH 6,9 (Waluyo, 2004).
Berdasarkan hasil uji yang telah dilakukan didapatkan hasil yang
negatif. Hal ini berarti bahwa tidak ada pertumbuhan atau bakteri tidak
menggunakan citrat sebagai sumber energi dan bakteri tidak
mempunyai enzim sitrat permiase yang merupakan enzim pembawa
sitrat, yang ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan menjadi warna
biru dan media tetap berwarna hijau (Gambar 4.10). Media ini
digunakan untuk mengetahui suatu organisme yang mempunyai
kemampuan dalam menggunakan citrat sebagai sumber karbon utama.
Simmon Citrate Agar digunakan untuk mengidentifikasi bakteri
golongan Enterobacteriaceae dan beberapa bakteri Gram negatif
lainnya (Pelczar, 2006).
Gambar 4.10 Hasil (-) uji Simmon Sitrat

e. Urea Agar
Media ini digunakan untuk mengetahui adanya aktifitas urease
pada mikroorganisme. Interpretasi hasil apabila urea dihidrolisis, maka
amonia akan dibebaskan dan menyebabkan medium berubah menjadi
alkalis. Hasil positif bila berwarna merah dan negatif bila berwarna
kuning atau tidak ada perubahan warna.
31
Berdasarkan hasil pengujian tersebut, pada media tidak
menunjukkan adanya perubahan warna, sehingga hasilnya adalah
negatif (Gambar 4.11). Media tetap berwarna kuning yang berarti
bahwa bakteri tidak dapat menguraikan urea. Uji urease berguna untuk
mengidentifikasi mikroorganisme yang mampu menghidrolisis urea
yang dapat menghasilkan amonia dan karbondioksida terutama untuk
mengetahui mikroorganisme tersebut mempunyai enzim urease atau
tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis urea
menjadi karbondioksida dan amonia (Brink, 2013).
Gambar 4.11 Hasil (-) uji pada media Urea Agar

4.4 HASIL DIAGNOSA

Berdasarkan hasil pemeriksaan klinis dan didukung dengan pemeriksaan
patologi dan mikrobiologi, maka diagnosa dari sampel ayam yang telah
diperiksa tersebut adalah gangguan pernapasan akibat infeksi E.coli karena telah
didapatkan isolat bakteri E.coli yang merupakan agen infeksi dari penyakit ini.
Bakteri E.coli adalah bakteri koliform yang merupakan flora normal bagi usus.
Namun bakteri ini akan menjadi patogen apabila kondisi lingkungannya
terganggu. Infeksi bakteri ini pada saluran pernapasan diakibatkan karena
bakteri E.coli dapat masuk dalam sirkulasi darah melalui kerusakan mukosa
saluran pernapasan akibat agen infeksi maupun non infeksi (Pelczar, 2006).
Bakteri E.coli tergolong gram negatif, tidak tahan asam, motil, dapat
memfermentasi gula, merupakan basil yang tidak membentuk spora, berbentuk
batang dengan ukuran 0,5x1.0-3.0 mikrometer. E.coli mudah ditumbuhkan pada
berbagai media laboratorium. Biakan di atas media padat umur muda berbentuk
32
granular halus (dengan diameter 1-3 mm) yang menjadi kasar bila umur biakan
menjadi bertambah tua. Pada medium agar Mac Conkey pertumbuhan E.coli
berwarna merah dadu atau bata. Dalam media cair pertumbuhannya ditandai
dengan kekeruhan dan adanya endapan dibagian bawah tabung. Bakteri dapat
tumbuh pada berbagai media yang lazim digunakan untuk mengisolasi bakteri
dan membutuhkan temperatur 18-44°C atau lebih rendah (Direktur Kesehatan
Hewan, 2002).
Quinn et al. (2002) menyebutkan bahwa banyak E.coli yang patogen
mempunyai suatu struktur dinding sel yang disebut pili, yang tidak ditemukan
pada serotipe yang tidak patogen. Faktor patogenitas bakteri dipengaruhi oleh
ketahanan terhadap fagositosis dan kemampuan perlekatan pada epitel saluran
pernafasan. Chang et al. (1996) menambahkan bahwa telah diketahui sekitar
48% dari berbagai serotipe E.coli adalah patogen pada ayam muda, embrio, atau
keduanya.
33
BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pemeriksaan klinis, pemeriksaan patologi dan
pemeriksaan mikrobiologi didapatkan hasil bahwa sampel ayam tersebut
didiagnosa mengalami gangguan pernapasan akibat infeksi E.coli, yang ditandai
dengan ditemukannya bakteri E.coli pada hasil pemeriksaan mikrobiologi. Pada
pemeriksaan patologi juga menunjukkan adanya perubahan makroskopis organ
yang mengarah ke penyakit tersebut. Selain itu pada prosedur pemeriksaan
mikrobiologi yang sudah dilakukan yaitu meliputi isolasi primer, isolasi
sekunder atau pemurnian dan yang terakhir adalah identifikasi menunjukkan
bahwa isolat bakteri yang didapatkan adalah E.coli. Sehingga dapat dipastikan
bahwa agen penyebab gangguan sistem pernafasan pada sampel ayam yang
diperiksa ini tidak lain adalah akibat adanya infeksi E.coli.
5.2 Saran
Dalam melakukan pemeriksaan mikrobiologi sangat perlu dilakukan
dengan penuh ketelitian dan kehati-hatian serta alat dan tempat yang sangat
steril sehingga hasil yang didapatkan akan lebih memuaskan.
34
DAFTAR PUSTAKA
Anderson, C. 2013. Great Adventures in the Microbiology Laboratory 7th Ed.

Pearson. Pp: 175-176.
Biberstein, E. L. and Yuan C.Z. 2004. Review of Veterinary Microbiology.

Blackwell Scientific Publications, Inc. Boston. USA.
Brink, B. 2013. Urease Test Protocol. American society for microbiology.

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2871-urease-testprotocol
Chang, L.L., Yunshu B., Gan Zhou L., Wen Liang W., Ji Gao T.L., Hey S., Li G.Z.,
Wang W.L., and Tang J.G. 1996. Diagnosis and Treatment of Chickens with
Mixed Infectious of E.coli and Infectious Bursal Disease Virus Followed by
Coccidiosis. Chinese Journal of Veterinary Medicine 22; 2, Hal. 11-12.
Direktur Kesehatan Hewan, 2002. Manual Penyakit Hewan Unggas. Direktorat

Kesehatan Hewan, Direktorat Bina Produksi Peternakan, Departemen
Pertanian RI, Jakarta Indonesia.Manual Penyakit Unggas 110.
Ferguson, N.M., Laibinis V.A and Kleven S.H. 2012. Evaluation of Mycoplasma
gallisepticum K-Strain as a Live Vaccine in Chickens. Avian Diseases. Vol.
56, No.1.
Frandson, R.D. 1992. Anatomi dan Fisiologi Ternak. UGM Press. Yogyakarta.
Hadioetomo, R.S. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. Penerbit PT Gramedia, Jakarta. Hal 103-104
Hemraj, V., Diksha S., and Avneet G. 2013. A Review On Commonly Used
Biochemical Test For Bacteria. Innovare Journal of Life Science. 1-7.
Horner, F., Bishop G.C., and Haw C. 2012. An Upper Respiratory Disease of
Commercial Chickens Resembling Infectious Coryza, but Caused by A V
Factor- Independent Bacterium. Avian Pathology. Volume 21, Issue 3, pages
421-427.
Irmaeni, W. 2006. Fisiologi Hewan. Kanisius.Yogyakarta.
Kleven, S.H. 1998. Summary of Discussions of Avian Mycoplasma Team. Avian

Pathol.19: 795-800.
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.

Jakarta. 167 hlm.
Lehman, L. 2005. Microbiology: a Laboratory Manual.Adison-Wesley. Publishing

company: California.
35
Ley, D.H. 2003. Mycoplasma gallisepticum Infection. In: Diseases of Poultry. 11th
Ed. Iowa State Press. A Blackwell Publishing Company. Pp 722-744.
Luis, M.D.L., Pezzlo M.T., Janet T.S., and Paterson E.M. 2004. Color Atlas of
Medical Bacteriology. Washington D.C: ASM Press. Pp: 103.
Madigan, M., dan Martinko J. 2005. Brock Biology of Microorganism 11th Ed.
Prentice Hall.
Pelczar, M.J. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press.
Plumb, D.C. 1999. Veterinary Drug Handbook 3rd Edition. Iowa State University
Press Ames.
Priadi, A dan L. Natalia. 2000. Gejala Klinis, Perubahan Patologis, Reisolasi,

Deteksi P. multocida dengan Media Kultur dan PCR. JITV. 5(1):65-71.
Quinn, P.J., Markey B.K., Carter M.E., Donnelly W.J.C., Leonard F.C and Maghire
D. 2002. Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Blackwell Science
Ltd. Australia.
Razin, S.K., S. Pratik, S. Amer, J.A. Newman, P. Singh and A. Silm. 1998.
Lymphoproliferative Response of Specific Pathogen Free Chickens to
Mycoplasma gallisepticum Strain PG31. Avian Pathol. 27 : 277-283.
Rohimat, S. 2002. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo: Jakarta.
Sembiring, P. 2009. Buku Ajar dan Penuntun Dasar Ternak Unggas. USU Press,
Medan.
Shankar, B.P. 2008. Common Respiratory Diseases of Poultry. Veterinary World,

Vol.1(7): 217-219
Smith A. 1997. Cefsulodin Chocolate Blood Agar: A Selective Medium for the
Recovery of Haemophilus influenzae from the Respiratory Secretions of
Patients with Cystic Fibrosis. J. Med. Microbiol. Vol. 46: 883-885.
Suprijatna, E. 2005. Ilmu Dasar Ternak Unggas. Penebar Swadaya. Bogor.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Tajima, M., T. Yagihashi and Y. Miki. 1982. Capsular Material of Mycoplasma

gallisepticum and Its Possible Relevance to the Pathogenic Process. Infect.
Immun 36:830-833.
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhammadiyah Malang Press.

Malang.
36
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Usaha peternakan ayam sudah banyak berkembang pesat di Indonesia.
Perkembangan usaha ternak ayam khususnya ayam ras ditunjang oleh peningkatan
jumlah penduduk Indonesia serta pendapatan per kapita yang semakin meningkat
pula. Daging dan telur ayam merupakan sumber bahan pangan hewani yang
mengandung gizi cukup tinggi berupa protein dan energi. Permintaan terhadap
pangan hewani ini, cenderung terus menerus meningkat seiring meningkatnya
jumlah penduduk dan tingkat pendapatan (Rout, 2007).
Produk pangan asal hewan terutama ayam sering mendapat ancaman yang
serius dari berbagai macam penyakit. Salah satunya adalah penyakit Newcastle
Disease (ND) atau tetelo. Penyakit ini telah menyebar di seluruh Indonesia dan
menimbulkan kerugian besar karena memiliki tingkat morbiditas dan mortalitas
yang tinggi. Penyakit ND disebabkan oleh golongan virus ribonucleat acid (RNA)
yaitu virus dari genus paramyxovirus yang memiliki hemaglutinin yang dapat
mengikat permukaan eritrosit satu dengan yang lainnya sehingga menyebabkan
hemaglutinasi (Ernawati dkk., 2008).
Virus ND merupakan agen infeksi yang dapat menyerang semua jenis
unggas. Virus ND yang menyerang ternak unggas akan mengakibatkan terjadinya
penurunan produksi, gangguan sistem reproduksi, dan kematian. Namun tidak
hanya ND, unggas juga rentan terserang virus lain seperti AI. Sehingga diperlukan
cara untuk membedakannya dengan tujuan mendapatkan diagnosa yang akurat serta
penanganan yang tepat. Salah satu cara tersebut adalah melalui pemeriksaan
serologis. Pemeriksaan serologis merupakan suatu metode mendiagnosa etiologis
virus penyebab infeksi pada hewan. Pemeriksaan serologis dapat dimanfaatkan
untuk mendeteksi antibodi dengan menggunakan antigen yang telah diketahui.
Dasar dari uji serologis ialah mereaksikan antara antigen dan antibodi dengan
menggunakan serum yang merupakan dasar pada reaksi imunologis (Hofstad,
2004).
Uji serologis merupakan salah satu cara untuk mendiagnosa penyakit seperti
ND. Pemeriksaan ini dipakai untuk mengevaluasi tingkat keberhasilan vaksinasi
dan respon kekebalan yang optimal pada ayam. Antibodi terhadap virus ND dapat
diukur dengan uji hemaglutinasi (HA) dan hemaglutinasi inhibisi (HI). Diagnosa
1
definitif terhadap ND dapat dilakukan dengan cara isolasi dan identifikasi virus
dengan menggunakan berbagai hewan percobaan, kultur jaringan dan telur ayam
bertunas (TAB). Metode yang paling praktis dan sering digunakan adalah
pembiakan di dalam TAB umur 8-10 hari. Selain itu terdapat uji lain yang relatif
mudah untuk mengidentifikasi virus ialah menggunakan agar gel presipitation test
(AGPT).
Oleh karena itu, sangat penting dilakukan pemeriksaan terhadap unggas yang
menunjukkan gejala penyakit viral. Serangkaian pemeriksaan serologis atau
pengujian mikrobiologi harus dilakukan seperti isolasi dan identifikasi virus
penyebab penyakit sehingga nantinya akan didapatkan diagnosa yang akurat.
Dengan diketahuinya agen penyebab penyakit beserta diagnosa yang akurat, maka
diharapkan tindakan pencegahan dan pengobatan yang dilakukan dapat
membuahkan hasil yang memuaskan dan tentunya dapat menekan kerugian
ekonomi.
.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa saja pemeriksaan serologis yang dilakukan pada ayam yang diduga
terserang penyakit ND ?
2. Bagaimana cara menentukan diagnosa yang akurat pada penyakit ND ?
1.3 Tujuan
1. Dapat mengetahui berbagai macam pemeriksaan serologis yang dilakukan pada
ayam yang diduga terserang penyakit ND.
2. Dapat mengetahui cara menentukan diagnosa yang akurat pada penyakit ND.
1.4 Manfaat
Dengan dilakukannya kegiatan PPDH rotasi diagnosa laboratorik
mikrobiologi ini diharapkan dapat meningkatkan kemampuan mahasiswa dalam
melakukan pemeriksaan serologis atau mikrobiologi, menentukan diagnosa yang
akurat serta tindakan penanganan yang tepat terhadap suatu penyakit seperti
penyakit ND.
2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Newcastle Disease (ND)

Newcastle Disease (ND) merupakan penyakit menular akut yang menyerang
ayam dan jenis unggas lainnya dengan gejala klinis berupa gangguan pernafasan,
pencernaan dan syaraf disertai mortalitas yang sangat tinggi. Penyakit ini
ditemukan pertama kalinya oleh Kreneveld di Indonesia pada tahun 1926, karena
menyerupai pes ayam, sehingga disebut pseudovogelpest. Kerugian yang
ditimbulkan ND berupa kematian yang tinggi, penurunan produksi telur dan daya
tetas, serta hambatan terhadap pertumbuhan (Tabbu, 2000).
2.2 Etiologi
Penyebab ND adalah virus yang tergolong Paramyxovirus, termasuk virus ss-
RNA yang berukuran 150-250 milimikron, dengan bentuk bervariasi tetapi
umumnya berbentuk spherik. Beberapa strain memiliki bentuk pleomorfik atau
bulat panjang. Virus ND memiliki amplop dan kapsid berbentuk heliks yang
simetris. Virus ND atau avian paramyxovirus serotype 1 (APMV-1) termasuk
genus Avulavirus, family Paramyxoviridae, Ordo Mononegavirales. Virus RNA ini
memiliki total panjang genom sekitar 15,2 kb dan menyandi 2 protein penting,
yakni Fusion (F) dan hemagglutininneuramnidase (HN).
Protein H merupakan protein yang melekat dan mengikat pada reseptor pada
bagian luar membran sel inang, termasuk sel darah merah. Perlekatan virus
ke sel darah merah adalah sifat penting yang digunakan di laboratorium untuk
mendeteksi keberadaan virus dan untuk mendeteksi antibodi terhadap virus. Bagian
N (neuraminidase) merupakan enzim aktif yang membantu dalam pelepasan virus
dari membran sel inang. Aktivitas enzim ini mempengaruhi waktu yang dibutuhkan
bagi virus untuk mengelusi dari sel darah merah.
Protein F berfungsi untuk fusi antara amplop virus dengan membran sel
inang. Hal ini memungkinkan penetrasi sel inang oleh genom virus. Pada saat fusi
terjadi, bentuk protein fusi asli harus diubah. Perubahan ini terjadi ketika protease
inang membelah atau memotong protein virus pada tempat pembelahan spesifik.
Setelah ini terjadi, protein fusi diaktifkan dan pada saat inilah terjadinya fusi.
Urutan asam amino di sekitar tempat pembelahan akan menentukan berbagai enzim
protease yang dapat mengaktifkan pembelahan protein. Urutan ini selanjutnya akan
menentukan virulensi virus. Dasar molekuler untuk tingkat keganasan virus
3
didasarkan pada perbedaan urutan substrat dari protein prekursor F0 yang
digunakan untuk aktivasi enzim proteolitik (Ghiamirad et al., 2010).
2.3 Cara Penularan
Penularan dari satu tempat ke tempat lain terjadi melalui alat transportasi,
pekerja kandang, burung dan hewan lain, debu kandang, angin, serangga, makanan
dan karung makanan yang tercemar. Dapat pula melalui transportasi dari karkas
ayam yang tertular virus ND dan ayam dalam masa inkubasi. Masa inkubasi ND
antara 2-15 hari atau rata-rata 6 hari. Ayam tertular virus ND akan mengeluarkan
virus melalui alat pemafasan 1-2 hari setelah infeksi. Penularan ND dari suatu
hewan ke hewan lainnya melalui kontak (persentuhan) dengan hewan sakit, sekresi,
ekskresi dan hewan sakit serta juga bangkai penderita tetelo. Jalan penularan
melalui alat pencernaan dan pernafasan. Virus yang tercampur lendir atau virus
yang ada dalam faeces dan urine tahan sampai 2 bulan, bahkan dalam keadaan
kering tahan lebih lama lagi. Demikian pula virus yang mencemari litter dan
perlengkapan kandang lainnya (Hofstad, 2004).
2.4 Gejala Klinis
Gejala yang muncul pada penyakit ND tergantung pada virulensi virus yang
menulari, gejala klinis yang ditimbulkan juga bermacam-macam, mulai dari
asymptomatis, gejala pernafasan ringan, pernafasan disertai dengan gangguan
syaraf, atau kombinasi gangguan respirasi, syaraf dan digesti. Penyakit ND ditandai
dengan hilangnya nafsu makan, diare yang kadang disertai darah, lesu, sesak nafas,
megap-megap, ngorok, bersin, batuk, paralysis partialis atau komplit dan sekali-
sekali tortikolis. Produksi telur turun atau terhenti sama sekali. Warna pial tampak
cyanosis. Angka kematian yang ditimbulkan 80-100%.
2.5 Pemeriksaan Patologi
Perubahan patologi yang disebabkan oleh virus ND yang patognomonis
berupa ptechiae (bintik-bintik perdarahan) pada proventrikulus (perut kelenjar) dan
nekrosa pada usus. Kelainan-kelainan pada saluran pernafasan seperti rhinitis,
tracheitis, laryngitis, pneumonia dengan ekusudat katarrhalis sampai mukopurulent
dapat pula ditemui, akan tetapi tanda ini tidak khas untuk penyakit tetelo saja.
Kelainan susunan syaraf berupa degenerasi dan nekrose otak (Tabbu, 2000).
2.6 Diagnosa
Diagnosa penyakit ini dapat didasarkan atas epizootiologi, tanda-tanda klinis,
4
kelainan patologi anatomi yang dikukuhkan dengan hasil pemeriksaan
laboratorium, yaitu sebagai berikut (Ghiamirad et al., 2010):
 Isolasi dari swab trachea atau kloaka atau suspensi 10% dari otak atau paru,
dalam larutan NaCl fisiolofis yang mengandung antibiotik diinokulasikan pada
telur ayam berembrio (TAB) umur 9-11 hari. Pasca inkubasi, cairan allantois
diperiksa terhadap adanya aglutinasi dengan uji haemagglutination (HA test).
Apabila uji HA positif dapat dilanjutkan dengan identifikasi virus dengan uji
hambatan hemagglutinasi (Hemagglutinasi Inhibition, HI) atau uji Neutralisasi
Virus (VN test) dengan serum kebal terhadap ND. Bila salah satu dari kedua uji
tersebut positif dapat dipastikan bahwa isolat yang diperiksa adalah ND.
 Pemeriksaan serologi dengan uji HA-HI. Adanya antibodi di dalam tubuh ayam
diuji dengan uji HI, uji Serum Neutralization (SN) dan Enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA). Pada uji HI, jika rata-rata titer antibodi yang
terukur lebih besar atau sama dengan 64 menunjukkan hewan kebal, sedangkan
rata-rata titer ukur kurang dari 64 perlu dilakukan pengulangan vaksinasi. Indeks
Neutralisasi lebih dari 4 menunjukkan hewan kebal, sedangkan kurang dari 2
serum tidak memberi perlindungan. Pada ELISA hewan dinyatakan kebal jika
memiliki titer antibodi ≥ 2.290. Pengujian adanya antigen dapat dilakukan pula
dengan uji Flourescent Antibody Technique (FAT) atau dengan rapid test.
2.7 Penanganan
Belum ada obat yang efektif terhadap penyakit ND. Usaha yang dapat
dilakukan adalah membuat kondisi badan ayam cepat membaik dan merangsang
nafsu makannya dengan memberikan tambahan vitamin dan mineral, serta
mencegah infeksi sekunder dengan pemberian antibiotik. Dapat pula diberikan
pemanasan tambahan pada kandang. Pencegahan penyakit dapat dilakukan dengan
vaksinasi secara teratur, serta menjaga kebersihan dan sanitasi kandang (Tabbu,
2000).
5
BAB 3 METODOLOGI
3.1 Tempat dan Waktu

Kegiatan PPDH rotasi diagnosa laboratorik mikrobiologi ini dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi (Virologi) Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Airlangga selama delapan hari mulai tanggal 6 Februari 2017 sampai dengan
tanggal 13 Februari 2017.
3.2 Uji AGP

3.2.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan untuk pengujian agar gel presipitasi ini
adalah cawan petri, gelas obyek, gel punch dan kertas hisap. Sedangkan
bahan yang digunakan antara lain adalah larutan agar (8 gram NaCl; 1,5 gram
agar No.1 (oxoid), Buffer Sorensen (10x) ditambah 100 ml), antigen dan
antibodi standard, antigen dan antibodi yang akan diuji.
3.2.2 Metode
 Larutan agar dituang pada cawan petri dan dibiarkan memadat.
 Setelah memadat dibuat lubang pada agar menggunakan gel punch dengan
pola yang sudah ditentukan, biasanya berbentuk lingkaran.
 Setelah lubang terbentuk, lubang diisi dengan antibodi (As) (berupa
serum) sebanyak 0.025 ml dan pada lubang lainnya diisi dengan antigen
(Ag) sebanyak 0.025 ml di sebelah lubang yang berisi antibodi sesuai pola.
 Setelah semua lubang terisi, agar gel diinkubasi selama 48 jam pada suhu
kamar.
 Setelah itu dilakukan pengamatan. Interpretasi hasil positif ditunjukkan
oleh adanya bentukan garis presipitasi.
3.3 Inokulasi Virus pada TAB

Alat dan bahan yang digunakan pada pengujian ini antara lain; telur
ayam berembrio umur 9-11 hari, lampu teropong, selotip, etanol 70%, bor
atau paku, gunting, spuit 1 cc, kapas, cawan petri, incubator, sampel gerusan
organ trakea, limpa, paru, dan otak yang berasal dari ayam diduga mengalami
Suspect Newcastle Disease.
6
3.3.2 Metode
3.3.2.1 Pengamatan Telur Melalui Peneropongan
 Pilih tempat yang gelap.
 Tekan lubang terowong lampu teropong kepada cangkang telur.
 Nyalakan lampu.
 Diamati telur ayam yang masih hidup.
 Diamati bagian dalam telur. Pastikan pembuluh darah dan ruang
korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio
bergerak-gerak, bentuk embrio juga jelas kelihatan, khususnya
mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara.
3.3.2.2 Pengumpulan Sampel Virus dari Organ
 Organ yang diduga mengandung virus suspect Newcastle Disease
berupa trakea, limpa, paru-paru, dan otak terlebih dahulu ditimbang
seberat 0,4 gram dan dilakukan penggerusan organ sampai halus
dengan penambahan pasir kuarsa.
 Setiap sampel organ ditambahkan 3,6 ml larutan PZ dan dicampur
rata.
 Setelah terampur rata, cairan tersebut dimasukkan ke dalam tabung
steril dan ditutup dengan sumbat karet.
 Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm
selama 15 menit sampai terbentuk supernatan dan endapan.
 Supernatan inilah yang siap diinokulasikan ke dalam telur ayam
berembrio.
3.3.2.3 Inokulasi Virus ke dalam Ruang Alantoik
 Telur disinari dengan bantuan lampu peneropong, diberi tanda
batas dengan pensil antara ruang hawa dan isi telur.
 Kulit telur pada daerah ruang hawa ±3-5 mm dari tanda batas ruang
hawa dibuat lubang dengan bor/paku.
 Jarum spuit dimasukkan ke dalam lubang paku sedalam ±1 cm
sejajar dengan sumbu panjang telur.
 Suspensi virus disuntikkan sebanyak 0,1 ml ke dalam korioalantoik
telur ayam berembrio.
 Lubang paku ditutup dengan selotip. Telur berembrio diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 4 hari dengan posisi vertikal (ruang hawa
7
sebelah atas). Setiap hari diamati, apabila terdapat embrio mati,
telur disimpan di dalam kulkas. Telur yang embrionya sudah mati
lebih dari 24 jam atau yang masih hidup sampai akhir pengamatan
(setelah 4 hari), dimasukkan dalam lemari es untuk pengamatan.
 Telur dipecah pada daerah ruang hawa dan dilakukan pengujian
terhadap cairan alantois atau perhatikan adanya perubahan pada
embrio.
3.3.2.4 Mengumpulkan Cairan Alantoik (Panen virus)
 Letakkan telur di dalam almari es selama beberapa jam atau di
dalam peti beku suhu -20°C selama 1 jam. Hal ini bertujuan untuk
membunuh embrio serta mengecilkan pembuluh darah supaya
pengumpulan cairan yang mengandung virus dilakukan tanpa
pencemaran dengan sel darah merah.
 Bersihkan lapisan cangkang di bagian atas ruang udara telur
dengan etanol.
 Pecahkan cangkang di atas ruang udara dan gunting cangkang
hingga membentuk lubang.
 Gunakan pipet Pasteur untuk menghindari embrio dan kuning
telur, ambil cairan alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur
lain. Cairan ini siap digunakan untuk pengujian HA-HI.
3.4 Uji Hemaglutinasi dan Inhibisi Hemaglutinasi (HA-HI)

Alat yang digunakan pada uji ini antara lain; mikroplate, mikropipet,
cawan petri, yellow tip, gunting dan pinset. Bahan yang digunakan untuk uji
HA dan HI adalah PZ, Antigen ND sampel, Eritrosit ayam 0,5%, antiserum
positif ND dengan titer 105 serta antigen kontrol ND 4HA unit.
3.4.2 Metode
3.4.2.1 Persiapan membuat eritrosit 0,5%
 Pencucian eritrosit dengan cara menambahkan PZ pada darah dan
mencampurnya sampai homogen.
 Dilakukan sentrifugasi pada larutan tadi selama 10 menit pada
2500 rpm.
 Dibuang supernatan dan buffy coat.
8
 Diulangi kedua langkah di atas sebanyak tiga kali/sampai PZ
tampak bersih.
 Dibuat campuran eritrosit 0,5% dari eritrosit 10% dengan
mencampurkan 3 ml eritrosit 10% dalam 60 ml PZ.
3.4.2.2 Uji Hemaglutinasi (HA)
 Diisi lubang mikroplate nomor 1-12 dengan 0,025 ml PZ
menggunakan mikropipet. Lubang yang diisi sebanyak 6 baris
(baris A, B, C, E, F dan G).
 Diisi lubang nomor 1 dari baris A sampai G dengan sampel antigen
(cairan alantois) sebanyak 0,025 ml.
 Dilakukan titrasi atau pengenceran dengan cara mengambil dari
lubang nomor 1 sebanyak 0,025 ml dan mencampurkannya ke
lubang nomor 2. Demikian seterusnya sampai lubang terakhir.
 Ditambahkan eritrosit 0,5% ke semua lubang sebanyak 0,05 ml.
 Diinkubasikan mikroplate selama 30 menit pada suhu kamar
sebelum kemudian membaca titernya.
3.4.2.3 Uji Inhibisi Hemaglutinasi (HI)
 Diisi lubang mikroplate nomor 1-7 dari baris A dan B dengan
0,050 ml PZ menggunakan mikropipet.
 Diisi lubang nomor 1-7 dari baris A dengan serum ND sebanyak
0,025 ml dengan pengenceran bertingkat.
 Diisi lubang nomor 1-7 dari baris B dengan antigen sampel dari
cairan alantois TAB sebanyak 0,025 ml.
 Diinkubasi selama 10-15 menit.
 Ditambahkan eritrosit sebanyak 0,050 ml pada semua lubang 1-7
dari baris A dan B.
 Diinkubasi selama 15 menit.
 Dibaca hasilnya.
9
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Uji Agar Gel Precipitation (AGP)

Agar gel precipitation test (AGPT) merupakan uji serologis imunodifusi yang
digunakan untuk melihat reaksi pengendapan antara antigen dengan antibodi
spesifik. Pengendapan akibat reaksi antigen dengan antibodi ini diperlihatkan oleh
adanya garis presipitasi di media agar gel. Antibodi dan antigen yang homolog atau
identik akan menunjukkan adanya garis presipitasi, namun sebaliknya pada
antibodi yang tidak homolog dengan antigen maka tidak akan menunjukkan adanya
bentukan garis presipitasi pada media agar. Selain itu teknik uji ini juga digunakan
untuk mengetahui adanya reaksi silang dari beberapa macam antigen (Swayne et
al., 2006).
Salah satu syarat dari uji AGP adalah antigen yang digunakan harus antigen
yang larut. Apabila antigen berupa partikel besar, maka antigen tersebut harus
dipecah menjadi antigen terlarut supaya dapat berdifusi ke dalam media agar.
Selain itu menurut Crowle (2014) terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
keberhasilan dari hasil uji agar gel presipitasi (AGP) yaitu;
 Keasaman (pH)
Sampel yang diuji dapat mengalami presipitasi jika media berada pada pH
7,0-7,2. Sedangkan pada pH 5,0-5,5 tidak menyebabkan terjadinya presipitasi.
pH yang optimal untuk terjadinya reaksi antara antigen dan antibodi berkisar
pada pH 6-8. Antigen tidak akan membentuk garis presipitasi apabila kondisi pH
dibawah standar, dikarenakan antigen akan terlarut dan tidak berdifusi melalui
agar pada konsentrasi garam yang tinggi atau pH yang rendah.
 Temperatur
Temperatur inkubasi pada reaksi aglutinasi bervariasi, kurang lebih 50-
56°C. Sedangkan pada yang lain pada suhu 27°C. Suhu optimal untuk terjadinya
reaksi antara antigen dan antibodi ialah berada pada kisaran suhu 40°C. Sampel
pada uji AGP yang diletakkan dalam suhu ruang kemungkinan mengakibatkan
berkurangnya kelembaban dan akan menyebabkan pori-pori dari agar sebagai
tempat berdifusinya antigen dan antibodi akan mengecil karena kering.
 Kelembaban
Media agar tidak boleh disimpan dalam lemari es karena agar akan
menjadi kering, pada temperatur panas media akan menjadi cair. Sehingga
10
tempat penyimpanan dibuat menyerupai lembah dengan nampan yang diberi
kapas dan air.
 Media Agar
Media yang digunakan adalah media agar semisolid, dapat juga dipakai
agar gelatin/silika. Media yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Tidak
dianjurkan membiarkan media agar menjadi padat lalu mencairkannya kembali
lebih dari 2 kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik.
 Jarak sumuran
Jika jarak sumuran terlalu jauh atau tidak sama antara kiri dan kanan dapat
mengakibatkan tidak terbentuknya garis presipitasi karena kecepatan antara
antigen atau antibodi berdifusi tidak sama sehingga jarak yang jauh
mengakibatkan tidak terbentuknya garis presipitasi.
 Lama inkubasi
Pembentukan ikatan antara antigen dan antibodi membutuhkan waktu
sekitar 2-3 hari. Jadi jika waktu inkubasinya kurang dari waktu yang ditentukan
kemungkinan garis presipitasi belum terbentuk.
 Perbandingan antigen dan antibodi
Keseimbangan konsentrasi antara antigen dan antibodi mutlak diperlukan.
Kelebihan antigen akan mengakibatkan melarutnya kembali presipitasi yang
terjadi, keadaan ini disebut postzone effect. Sedangkan kelebihan antibodi dapat
menyebabkan komplek antigen dan antibodi tetap berada dalam larutan, kondisi
seperti ini disebut prozone effect.
 Aviditas dan afinitas seimbang
Uji AGP membutuhkan antibodi dan antigen dengan konsentrasi tinggi,
apabila antibodi yang digunakan memiliki afinitas (daya gabung) dan aviditas
(daya kekuatan) yang rendah maka tidak akan terbentuk garis presipitasi.
Semakin tinggi afinitas antibodi terhadap antigen maka akan terbentuk interaksi
yang stabil. Antibodi yang memiliki aviditas yang tinggi berupa antibodi yang
bersifat multivalent dengan antigen multivalent akan lebih stabil ikatannya dan
mudah terdeteksi.
Uji AGP ini meliputi dua tahap yaitu tahap pertama adalah interaksi antara
antigen dengan antibodi, sedangkan tahap kedua ditentukan oleh keadaan fisik
antigen tersebut. Antibodi yang di pasangkan dengan antigen yang terlarut dalam
11
larutan dengan kondisi tepat membentuk komplek. Pada jumlah yang tepat antigen
yang dicampur dengan antibodi yang homolog dan diinkubasi pada keadaan
lembab, dalam waktu kurang lebih dua hari akan membentuk garis presipitasi.
Perbandingan konsentrasi antigen dan antibodi adalah faktor terpenting dalam
reaksi presiptasi. Dalam campuran, rasio antara antigen dan antibodi harus
seimbang, sehingga akan terbentuk ikatan silang atau ikatan kompleks. Ikatan
kompleks antigen-antibodi yang mengendap dan terlihat sebagai garis berwarna
putih ini disebut garis presipitasi (Ernawati dkk, 2008).
Hasil uji AGP dengan menggunakan antigen dan antiserum yang diduga
sebagai virus ND dan AI dengan berbagai variasi titer pada 5 plate menunjukkan
hasil berupa sampel positif dan sampel negatif. Pada hasil sampel positif dan
negatif dapat dijelaskan sebagai berikut:
4.1.1 AGPT Positif
Sampel pada uji AGP yang hasilnya positif ditunjukkan pada Gambar
4.1 yaitu berupa Antigen-X (Ag-X) yang direaksikan dengan Antiserum-
Newcastle Disease (As-ND), kemudian pada Gambar 4.2 yaitu Antiserum-X
(As-X) yang direaksikan dengan Antigen-Newcastle Disease (Ag-ND). Pada
Gambar 4.1 yaitu plate Ag-X yang direaksikan dengan As-ND menunjukkan
terbentuknya garis presipitasi lurus yang berwarna putih. Garis presipitasi
tersebut terbentuk akibat adanya reaksi antara antigen yang homolog dengan
antibodi yang digunakan serta menandakan terjadinya ikatan komplek antara
antigen dengan antibodi tersebut (Syukron, 2013). Garis presipitasi tersebut
menandakan bahwa Ag-X yang direaksikan dengan As-ND merupakan Ag
terhadap ND.
As-ND Ag-X
As-ND Ag-X
Gambar 4.1 Hasil positif uji AGP antara Ag-X dengan As-ND yang
ditandai dengan adanya garis presipitasi
12
Pada Gambar 4.2 yaitu plate As-X yang direaksikan dengan Ag-ND
juga menunjukkan terbentuknya garis presipitasi lurus berwarna putih.
Garis presipitasi tersebut terbentuk akibat adanya reaksi antigen yang
homolog dengan antibodi dan menandakan terjadinya ikatan komplek
antara antigen dengan antibodi tersebut (Syukron, 2013). Garis presipitasi
tersebut menandakan bahwa As-X yang direaksikan dengan Ag-ND
merupakan As terhadap ND.
Ag-ND As-X
Gambar 4.2 Hasil positif uji AGP antara As-X dengan Ag-ND yang
ditandai dengan adanya garis presipitasi
Selanjutnya pada Gambar 4.3 yaitu plate As-X yang direaksikan

dengan Ag-ND dan Ag-AI (Avian Influenza) menunjukkan terbentuknya
garis presipitasi berwarna putih antara sumuran As-X dengan Ag-ND,
namun tidak ada garis presipitasi antara As-X dengan Ag-AI.
Terbentuknya garis presipitasi tersebut menandakan bahwa As-X yang
direaksikan dengan Ag-ND merupakan antiserum yang homolog terhadap
Ag-ND, namun antiserum tersebut tidak homolog dengan Ag-AI, sehingga
ikatan komplek hanya terjadi antara antigen ND dengan antibodi ND.
Ag-ND
Ag-AI
As-X As-X
Gambar 4.3 Hasil positif uji AGP antara As-X dengan Ag-ND
namun tidak dengan Ag-AI
13
4.1.2 AGPT Negatif
Pada plate As-X yang direaksikan dengan Ag-AI dan As-AI yang
direaksikan dengan Ag-X menunjukkan tidak adanya garis presipitasi
setelah diinkubasi selama 48 jam (Gambar 4.4A dan 4.4B). pada gambar
tersebut menunjukkan kedua plate tidak terdapat reaksi antara antiserum
dan antigen yang diujikan atau berarti kedua sampel tidak homolog. Hal
ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor yang mempengaruhi hasil
negatif tersebut; seperti jarak antar sumuran yang tidak sama, afinitas dan
aviditas antibodi tidak seimbang, suhu inkubasi, keasaman (pH) dan
perbandingan antara antigen dan antibodi tidak sama (Ernawati, 2008).
Pada salah satu plate terbukti bahwa jarak antar sumuran tidak sama yang
membuktikan bahwa difusi antigen dan atibodi serta reaksi ikatan antar
keduanya tidak dapat terjadi dan tidak terbentuk garis presipitasi.
As-AI
Ag-AI Ag-X
As-X
A B
Gambar 4.4 Hasil negatif uji AGP, (A) As-X dengan Ag-AI yang ditandai
dengan tidak adanya garis presipitasi, (B) As-AI dengan Ag-X yang
ditandai dengan tidak adanya garis presipitasi
4.2 Inokulasi Virus pada Telur Ayam Berembrio (TAB)

Pada pemeriksaan ini dilakukan penanaman virus pada ruang chorioalantois. Telur
yang digunakan adalah telur Spesific Pathogenic Free (SPF) yaitu telur yang tidak
mengandung bakteri-bakteri pathogen yang dapat menimbulkan antibodi dalam telur
tersebut sehingga dapat menimbulkan kegagalan pertumbuhan bagi virus yang akan
ditanam (OIE, 2008). Virus yang ditanam adalah virus Newcastle Disease (ND) yang
berasal dari suspensi gerusan beberapa organ ayam (otak, pulmo, trakea, limpa) yang
diduga terserang ND. Sebelum dilakukan penggerusan, sampel organ perlu dilakukan
pemeriksaan makroskopik untuk meilhat adanya perubahan pada sampel organ tersebut.
14
Pada pemeriksaan makroskopik perlu dilihat adanya perubahan organ akibat infeksi
virus ND. Pada kasus ND, organ akan mengalami nekrosis dan hemoragi pada saluran
pencernaan seperti proventrikulus, ventrikulus, dan usus. Selain pada saluran
pencernaan, ND dapat mengakibatkan kerusakan pada trakea dan paru-paru (pulmo)
berupa hemoragi dan kongesti berat. Menurut Tabbu (2000), otak akan mengalami
ptechiae ataupun hemoragi akibat infeksi virus ND. Infeksi ND juga akan
mengakibatkan terjadinya pembesaran limpa. Untuk dapat menanam virus secara in ovo
ini digunakan telur ayam berembrio dengan kondisi embrio masih hidup.
A B
Gambar 4.5 (A) Telur ayam berembrio (TAB), (B) Suspensi gerusan
organ ayam terduga ND
(Sumber: Dokumentasi pribadi )
Tahap inokulasi virus ND pada TAB menyebabkan TAB tersebut mengalami

kematian. Kematian tersebut akan terlihat pada saat TAB diamati dibawah sinar
lampu dengan candler. Embrio yang mati akan terlihat tidak ada pergerakan embrio
saat diamati di bawah cahaya, embrio tidak menjauhi sinar dan pembuluh darah
tidak terlihat. Pertama kali yang harus dilakukan adalah telur berembrio yang
berumur 9-11 hari diteliti dengan lampu teropong di kamar gelap untuk mengetahui
apakah embrio tersebut masih hidup atau sudah mati, indikasi bahwa embrio
tersebut masih hidup adalah adanya gerakan embrio di dalam telur (embrio akan
menjauhi sinar) dan adanya pembuluh darah. Digunakan telur ayam berembrio
(TAB) umur 9-11 hari karena pada saat itu ruang dan cairan chorioalantoisnya
sedang berkembang sehingga daerahnya menjadi luas, maka inokulasi pada ruang
chorioalantois ini akan lebih mudah dan mengurangi resiko. Telur yang digunakan
berjumlah 12 butir sehingga inokulasi virus dari suspensi organ (otak, pulmo,
trakea, limpa) pada TAB masing-masing adalah 3 butir. Kemudian bagian atas atau
rongga hawa embrio diberi tanda pada kulit telurnya. Lalu tanda ini diberi lubang
15
setelah kulit telur didesinfeksi dengan menggunakan alkohol untuk menjaga agar
daerah sekitar lubang tetap aseptis.
A B
Gambar 4.6 (A) Proses peneropongan TAB, (B) Proses inokulasi virus
Kemudian inokulasi virus dilakukan dengan cara memasukkan suspensi virus

ke dalam lubang yang berada di atas embrio dengan menggunakan spuit 1 ml.
Penyuntikan dilakukan dengan sudut 45° ke arah bagian runcing telur agar tidak
mengenai embrio. Injeksi dilakukan ke dalam cairan chorioalantois untuk membuat
daerah aman sehingga lingkungan internal embrio tidak terganggu dan agar virus
mudah menyebar dan melekat pada sel yang mempunyai reseptor yang cocok
dengan virus tersebut.
Gambar 4.7 Teknik inokulasi virus pada ruang chorioalantois

(Sumber: Ernawati dkk, 2008)
Penambahan bahan ke dalam telur akan meningkatkan tekanan di dalam telur

yang dapat mempengaruhi pertumbuhan embrio dan virus, oleh karena itu dibuatlah
lubang pada kulit telur di atas rongga hawa untuk membuat jalan keluar sedikit
udara sehingga tekanan dalam telur tetap konstan saat diinokulasi. Kemudian
16
lubang tersebut ditutup dengan menggunakan selotip untuk mengembalikan kondisi
dalam telur yang steril dan terhindar dari kontaminasi lingkungan luar. Telur yang
telah diinokulasi kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 5 hari untuk
kemudian diamati pertumbuhan atau kematian embrio, perubahan yang terjadi, dan
dilakukan panen virus (Purchase, 1999). Berikut adalah hasil daripada pengujian
pada TAB tersebut;
Tabel 4.1 Lama kematian sampel TAB
Lama Kematian TAB
No Sampel
>60 Jam >72 Jam > 90 Jam
1 Trakea 1 Mati
2 Trakea 2 Mati
3 Trakea 3 Mati
4 Limpa 1 Hidup Hidup Mati
5 Limpa 2 Mati
6 Limpa 3 Hidup Hidup Hidup
7 Otak 1 Mati
8 Otak 2 Hidup Hidup Mati
9 Otak 3 Hidup Mati
10 Paru – paru 1 Mati
11 Paru – paru 2 Mati
12 Paru – paru 3 Hidup Mati
Pada hari pertama dan kedua setelah inokulasi virus, embrio dalam TAB
belum ada yang mengalami kematian. Kemudian pada hari ketiga (>60 jam)
kematian sebanyak 7 TAB. Hari keempat (>72 jam) kematian sebanyak 2 TAB
sampai pada hari kelima (>90 jam) kematian sebanyak 2 TAB dan masih hidup ada
1 TAB. Kematian embrio dalam TAB tersebut dapat disebabkan oleh keganasan
atau virulensi dari virus dan juga bisa disebabkan oleh kesalahan perlakuan.
Tingkat virulensi berhubungan dengan tropisme jaringan dan sistem kekebalan
inang. Spesies inang, status imun, umur, lingkungan, ko-infeksi dengan organisme
lain, dosis virus, dan jalur paparan juga dapat memengaruhi keparahan penyakit
(Umali et al., 2013).
Virus Paramyxovirus dapat ditumbuhkan di embrio ayam berumur 9 hingga
11 hari pada cairan allantois. Menurut Alexander (2001), virus jenis paramyxovirus
dapat ditumbuhkan di embrio ayam karena embrio ayam memiliki sensitifitas untuk
pertumbuhan virus. Selain itu inokulasi virus ND dapat dilakukan di cairan
allantois dan kuning telur. Pada lokasi tersebut virus dapat menyebabkan kematian
17
embrio karena pada allantois merupakan bagian penting proses sirkulasi embrio
ayam sehingga virus dapat tumbuh dan menyebar hingga ke embrio ayam.
Virulensi virus juga dapat dilihat dari waktu munculnya kematian embrio;
virus yang mampu mematikan embrio dalam waktu <60 jam setelah inokulasi
digolongkan ke dalam galur velogenik, jika kematian embrio terjadi antara 60-90
jam termasuk ke dalam galur mesogenik dan virus yang mematikan embrio dalam
waktu >90 jam termasuk dalam galur lentogenik (Cattoli et al., 2011). Lalu
kesebelas embrio dalam TAB yang mati tersebut kemudian disimpan pada
refrigerator untuk menghindari kebusukkan daripada TAB tersebut. Kemudian pada
hari keenam dilakukan pengujian terhadap seluruh TAB tersebut menggunakan uji
Hemaglutination (HA) untuk membuktikan bahwa penyebab kematian dari TAB
tersebut adalah virus ND. Apabila didapatkan hasil positif pada uji HA, maka
dilanjutkan dengan uji Hemaglutination Inhibition (HI).
4.3 Uji Hemaglutination (HA)

Isolasi virus pada cairan alantois dilakukan dengan cara mengambil cairan
alantois yang berisi virus dari organ yang diduga terkena ND dan telah diinkubasi
selama 5 hari. Pengambilan cairan alantois dilakukan pada semua sampel telur
menggunakan mikropipet yang sebelumnnya telah dilubangi pada bagian kantung
hawa. Identifikasi virus pada TAB yang diduga virus ND dilakukan dengan
menggunakan uji HA dan HI. Uji HA adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui
ada tidaknya virus yang dapat mengaglutinasi eritrosit pada sampel. Virus yang
mampu mengaglutinasi eritrosit ini adalah golongan virus yang memiliki
hemaglitinin.
Sampel eritrosit yang digunakan harus murni sehingga membutuhkan darah
ayam tanpa divaksin. Pencucian eritrosit dilakukan tiga kali dengan menggunakan
larutan PBS pH 7,2, larutan ini digunakan sebagai pencuci eritrosit, selain PBS
larutan yang digunakan dan memiliki fungsi yang sama yaitu NaCl fisiologis.
Penggunaan larutan PBS pH 7,2 ini agar eritrosit tidak mengalami difusi osmosis.
Apabila eritrosit mengalami difusi dapat mengakibatkan lisis pada sel darah.
Apabila eritrosit mengalami osmosis dapat mengakibatkan krenasi pada sel darah.
Sehingga larutan PBS dan NaCl dapat digunakan sebagai larutan isotonis pada
eritrosit. Selanjutnya eritrosit dibuat sediaan 10% yaitu 1 ml eritrosit diencerkan
menggunakan larutan PBS 9 ml. Kemudian eritrosit dijadikan 0,5% yaitu sediaan
18
larutan eritrosit 10% diambil 0,5 ml selanjutnya ditambahkan 4,5 ml larutan PBS.
Pengenceran ini dilakukan agar eritrosit tidak terlalu pekat agar antigen dapat
mengikat dan mengaglutinasi eritrosit. Hemaglutinasi terlihat jelas berupa lapisan
eritrosit secara merata pada dasar lubang dan penjernihan dari cairan bagian atas
tanpa terjadinya pengendapan eritrosit berbentuk titik ditengah lubang. Hal ini
menunjukkan tinggi dari titer HA. Titer antigen (HA) adalah angka kebalikan
pengenceran tertinggi yang masih mampu menunjukkan reaksi aglutinasi
(mengaglutinasi eritrosit). Satu unit HA dalam titrasi hemaglutinin adalah jumlah
minimum virus yang akan menyebabkan aglutinasi lengkap dari sel-sel darah
merah. Lubang terakhir yang menunjukkan aglutinasi lengkap merupakan lubang
yang berisi satu unit HA.
A B
C D
Gambar 4.8 Hasil uji HA sampel terduga ND; (A) Otak, (B) Pulmo,
(C) Limpa, (D) Trakea
Hasil uji HA pada gambar di atas, terlihat adanya aglutinasi eritrosit pada
sampel pulmo dengan titer HA 23 dan limpa dengan titer HA 24. Hal ini
menunjukkan bahwa virus yang terdapat di dalam cairan alantois adalah virus yang
dapat mengaglutinasi eritrosit. Selanjutnya dikarenakan terdapat hasil positif, maka
dilakukan uji lanjutan HI, sehingga antigen yang diduga ND perlu dilakukan
retitrasi atau pengenceran antigen menjadi 4HA unit. Retitrasi merupakan suatu
metode untuk menguji ketepatan pengenceran antigen yang akan digunakan dalam
uji hambatan hemaglutinasi. Sedangkan 4HA unit merupakan standar untuk
memastikan bahwa pengenceran yang dilakukan sudah benar.
19
Tabel. 4.2 Gambaran skematis hasil uji HA
Organ Sampel Pengenceran
1 2 3 4 5 6
Otak A Blank
B
C
Pulmo A Blank
B
C
Limpa E Blank
F
G
Trakea E Blank
F
G
Keterangan :
: Tidak aglutinasi
: Aglutinasi
Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini

sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi
tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor
mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi
reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim
virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke
dalam larutan. Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen
dari virus digunakan untuk uji hemaglutinasi (Swayne et al., 2006).
Kemampuan ND mengaglutinasi eritrosit disebabkan oleh ikatan
hemaglutinin pada reseptor permukaan sel. Adanya enzim neuraminidase yang
dimiliki oleh virus ND berperan untuk melepaskan progeni virus dari permukaan
sel dan mencegah reattachment sehingga dapat menginfeksi sel-sel baru. Aktivitas
enzim neuraminidase akan menghambat kerja hemaglutinin untuk menempel pada
sel inang dengan menghilangkan reseptor sialic acid (Rout, 2007). Alexander dan
20
Senne (2008) juga menambahkan bahwa perlekatan ND pada reseptor diikuti
dengan fusi membran virus pada membran sel. Reaksi fusi dapat menyebabkan
penggabungan dua atau lebih sel inang hingga membentuk syncytia ketika partikel
virus membentuk tunas pada sel. Dinding eritrosit yang kaku akan lisis ketika virus
keluar dari sel.
Kebanyakan virus avian dapat mengaglutinasi sel darah merah, termasuk di
dalamnya NDV (Newcastle Disease Virus), virus influenza dan adenovirus.
Hambatan dari aglutinasi oleh antibodi spesifik merupakan dasar dari uji HA dan
HI cepat pada plate. Uji HA dan HI cepat pada plate merupakan uji yang sesuai dan
cepat dilakukan yang penerapannya lebih luas untuk kontrol berbagai penyakit
avian seperti Newcastle Disease (Swayne et al., 2006).
Tes HA positif akan menunjukkan adanya suspensi agregat eritrosit yang
berkeping-keping. Sedangkan tes HI cepat plate menunjukkan positif apabila tidak
terlihat aglutinasi pada cairan korioalantois yang diberi antiserum NDV. Uji HA
cepat biasanya dipakai untuk mengidentifikasi virus yang mampu mengaglutinasi
eritrosit ayam. Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan
virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer
virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end
point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan
adanya agregat-agregat di dasar sumur (Swayne et al., 2006).
4.4 Uji Hemaglutination Inhibition (HI)

Pengujian HI menggunakan sampel pulmo yang menunjukan titer HA 23
dengan titer antibodi ND 25. Setelah mengetahui titer antigen, langkah selanjutnya
menentukan 4HA Unit. Sampel antigen pulmo titer 23 dilakukan perhitungan
suspensi virus dengan 4HA Unit, yaitu 23/4 = 2, artinya, 1 ml volume antigen ND
di dalam 1 ml larutan PZ (NaCl Fisiologis 0,9%).
Serum yang digunakan pada pengujian ini dari ayam. Serum merupakan
bagian dari komponen darah yang di dalamnya terdapat antibodi. Serum
berupa cairan tubuh (bagian dari plasma darah) yang memilki kekebalan terhadap
adanya penyakit yang masuk kedalam tubuh dan berwarna kuning jernih, Pada
serum ayam terkandung vaksin ND, sehingga dapat diketahui titer antibodi yang
dimiliki oleh ayam pedaging dapat diukur dengan pengujian HI. Serum disimpan
pada suhu -20°C atau -28°C, namun serum mampu bertahan selama 3-5 hari.
21
Gambar 4.9 Hasil uji HI sampel terduga ND
Pada hasil uji HI yaitu pada kontrol positif (well A1-A7) ditunjukkan dengan
terjadinya hambatan aglutinasi paada well A1-A3. Hal ini menunujukan bahwa
pada kontrol positif yang digunakan memiliki titer HI 23. Sedangkan pada sampel
gerusan pulmo ayam (well B1-B7) dittunjukan dengan hasil yang negatif atau tidak
terjadi hambatan aglutinasi. Uji HI dinyatakan positif jika terdapat endapan eritrosit
berbentuk titik ditengah lubang dan bila microplatenya dimiringkan akan
didapatkan eritrosit yang mengalir, sedangkan HI dinyatakan negatif jika
menunjukkan adanya suspensi agregat eritrosit yang berkeping-keping, apabila
mikroplate dimiringkan eritrosit tidak akan mengalir.
Tabel. 4.3 Gambaran skematis hasil uji HI
Pengenceran
Well nomor
1 2 3 4 5 6 7
Kontrol (+)
Sampel
Keterangan :
: Tidak aglutinasi
: Aglutinasi
Hasil uji HI dengan hasil kontrol positif menunjukan penurunan titer antibodi
menjadi 23, padahal sampel kontrol positif yang digunakan sebelumnya memiliki
titer 25 dan pada sampel cairan alantois menunjukan hasil negatif, hal ini bisa
diakibatkan oleh beberapa faktor yaitu; 1). Lama penyimpanan As-ND (Antiserum-
ND), antibodi yang sudah diencerkan bersifat lebih tidak stabil daripada yang
bersifat concentrated sehingga jika setelah mengalami pengenceran harus disimpan
22
pada suhu -20oC, jika antibodi mengalami kerusakan maka ketika dilakukan uji HI
maka titer antibodi akan menurun., 2). Pada sampel cairan alantois belum
menunjukkan angka pengenceran 4HA Unit, maka sebelum dilakukan uji HI perlu
dilakukan retritrasi dan dilakukan uji HA kembali. Apabila didapatkan perbedaan
hasil titer HA dari hasil sebelumnya yaitu 25 maka harus dilakukan pengulangan
pengujian atau pengenceran kembali 4HA Unit (retritasi)., 3). Adanya kesalahan
teknis dapat mempengaruhi hasil dari uji HA/HI (OIE, 2008).
Uji HI digunakan untuk mengetahui kemampuan antibodi dalam menghambat
reaksi aglutinasi eritrosit. Titer HI dinyatakan sebagai angka kebalikan pengenceran
serum tertinggi yang dapat menghambat hemaglutinasi 100%. Pada pengenceran
serum kelipatan dua titer HI pada umumnya dinyatakan sebagai logaritma berbaris
dua dan pada uji HI yang diulang beberapa kali untuk mendapatkan suatu nilai yang
lebih mendekati ketepatan, digunakan rata-rata titer geometrik atau Geometric
Mean Titer (GMT) yaitu rata-rata logaritma beberapa ulangan yang ada (Merchant
and Packer, 2004).
23
BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan serangkain pemeriksaan serologi atau mikrobiologi terhadap
sampel yang diperiksa menunjukkan bahwa sampel tersebut berasal dari ayam yang
terinfeksi penyakit Newcastle Disease (ND). Penyebab penyakit ND adalah virus
yang tergolong Paramyxovirus. Virus ini memiliki faktor hemaglutinin yang
mampu mengaglutinasi eritrosit ayam. Pemeriksaan serologi yang digunakan untuk
mengidentifikasi virus ini antara lain uji AGP, inokulasi virus pada telur ayam
berembrio dan uji HA-HI.
5.2 Saran
Dalam melakukan pemeriksaan mikrobiologi sangat perlu dilakukan dengan
penuh ketelitian dan kehati-hatian serta alat dan tempat yang sangat steril sehingga
hasil yang didapatkan akan lebih memuaskan.
24
DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B., A. Johnson, P. Walker, J. Lewis, M. Raff and K. Roberts. 2008. Molecular
Biology of The Cell. Garland Publishing Inc.
Alexander, D.J. 2001. Newcastle disease: The Gordon Memorial Lecture. Br. Poult. Sci.
42:5-22.
Alexander, D.J. and D.A. Senne. 2008. Newcastle Disease. Other Avian Paramyxovirus
and Pneumovirus Infections: Newcaste Disease. In Disease of Poultry. Saif, Y.
(Ed.). 12nd ed. Iowa State University Iowa, US.
Cattoli, G., L. Susta, C. Terregino, and C. Brown. 2011. Newcastle disease: A review of
field recognition and current methods of laboratory detection. J. Vet. Diag. Invest.
23(4):637-656.
Crowle, A.J. 2014. Immunodiffusion Second Edition. Academic Press, Inc. New York:
123-125.
Ernawati, R., A.P. Rahardjo, N. Sianita, F.A. Rantam, dan Suwarno. 2008. Buku
Penuntun Praktikum Penyakit Viral. Laboratorium Virologi dan Imunologi.
Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga. 13-30.
Fenner, F. 1993. Virology Veteriner Edisi kedua. New York: Academic Press Inc.
Ghiamirad, M., A. Pourbakhsh, H. Keyvanfar, Momayaz, S. Charkhkar, And A.

Ashtari. 2010. Isolation And Characterization Of Newcastle Disease Virus From
Ostriches In Iran. African J. Of Microbiology Research 4(23):2492-2497.
Hofstad, M.S. 2004. Disease of Poultry. Iowa State University. Ames, Iowa. USA. eight
edition. 452-467.
Kontermann, R. and S. Dubel. 2010. Antibody Engineering Vol. 1. Springer. Berlin.
Matson, R.S. 2009. Microarray Methods and Protocols. CRC Press. Florida.
Merchant, L and J. Packer. 2004. Veterinary Bacteriology and Virology. USA: Iowa
State University Press.
OIE. 2008. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. 4th ed. Paris.
Purchase, H. G., 1999. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of
Avian Phatogens, Third Edition. Amerika: Kendal/hint Publishing Company.
Rout, S.N. 2007. The role of Newcastle Disease Virus Internal Protein in Pathogenesis.
Desertation. University of Maryland. Maryland (US).
Swayne, D.E., and Suarez, D.L. 2006. Highly Pathogenic Avian Influenza. Rev Sci
Tech 19:463-482.
25
Syukron, M.U., Suartha, I.N., dan Dharmawan, N.S. 2013. Serodeteksi Penyakit Tetelo
Pada Ayam di Timor Leste. Indonesia Medicus Veterinus 2(3):360-368.
Tabbu, C.R. 2000. Penyakit ayam dan Penanggulangannya. Penyakit Bakterial, Mikal
dan Viral. Volume 1. Penerbit kanisius, Yogyakarta.
Thompson, M. 2010. Immunoanalysis Part 2: Basic Principles of ELISA. Royal Society

Chemistry.
Umali, D.V., H. Ito, T. Suzuki, K. Shirota, H. Katoh, and T. Ito. 2013. Molecular
epidemiology of Newcastle disease virus isolates from vaccinated commercial
poultry farms in non-epidemic areas of Japan. Virol. J. 10:330.
26
BAGIAN 1
PEMERIKSAAN BAKTERI
BAGIAN 2
PEMERIKSAAN VIRUS

Microbiology

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Microbiology

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

LAPORAN KEGIATAN PPDH

ROTASI DIAGNOSA LABORATORIK MIKROBIOLOGI

PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN

Mengingat keterbatasan dan kemampuan yang dimiliki, penulis menyadari

Malang, Desember 2017

LAPORAN KEGIATAN PPDH

Dr. Sri Murwani, drh., MP

drh. Dahliatul Qosimah, M.Kes drh. Indah Amalia Amri, M.Si

Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

Bagian 2. Pemeriksaan Virus

Bagian 2. Pemeriksaan Virus

1.1 Latar Belakang

2.1 Sistem Respirasi pada Ayam

Gambar 2.1 Sistem respirasi ayam

2.2 Penyakit Bakterial pada Sistem Pernafasan Ayam

2.2.3 Fowl Cholera

3.1 Tempat dan Waktu

3.2 Alat dan Bahan

3.3.2 Pembuatan Media

3.3.3 Isolasi dan Identifikasi

4.1 PEMERIKSAAN KLINIS

4.2 PEMERIKSAAN PATOLOGI

Gambar 4.1 Hasil nekropsi ayam

Tabel 4.1 Perubahan makroskopis patologi anatomi

4.3 PEMERIKSAAN MIKROBIOLOGI

Keterangan: BA : Blood Agar

4.3.1 Isolasi Primer

Gambar 4.2a Hasil isolasi pada Gambar 4.2b Hasil mikroskopis

Hasil pemeriksaan pada media MCA menunjukkan bahwa isolat

Gambar 4.3a Hasil isolasi pada Gambar 4.3b Hasil mikroskopis

Menurut Madigan dan Martinko (2005), beberapa jenis bakteri

Gambar 4.4a Hasil isolasi pada Gambar 4.4b Hasil mikroskopis

Hasil dari penanaman pada media TSA didapatkan koloni

Gambar 4.5a Hasil isolasi pada Gambar 4.5b Hasil mikroskopis

Penanaman sampel dari swab discharge nasal ayam kampung

4.3.2 Isolasi Sekunder atau Pemurnian

Gambar 4.6a Koloni hasil pemurnian pada media MCA

Hasil dari isolasi sekunder atau pemurnian pada media MCA

Gambar 4.6b Uji KOH Gambar 4.6c Hasil mikroskopis

Pemeriksaan menggunakan larutan KOH 3% berguna untuk

b. Uji Sulfat Indol Motility (SIM)

Gambar 4.8 Hasil (+) uji Sulfat Indol Motility (SIM)

c. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Gambar 4.9 Hasil (+) uji TSIA

Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukkan

Gambar 4.10 Hasil (-) uji Simmon Sitrat

Gambar 4.11 Hasil (-) uji pada media Urea Agar

4.4 HASIL DIAGNOSA

Anderson, C. 2013. Great Adventures in the Microbiology Laboratory 7th Ed.

Biberstein, E. L. and Yuan C.Z. 2004. Review of Veterinary Microbiology.

Brink, B. 2013. Urease Test Protocol. American society for microbiology.

Direktur Kesehatan Hewan, 2002. Manual Penyakit Hewan Unggas. Direktorat

Irmaeni, W. 2006. Fisiologi Hewan. Kanisius.Yogyakarta.

Kleven, S.H. 1998. Summary of Discussions of Avian Mycoplasma Team. Avian

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.

Lehman, L. 2005. Microbiology: a Laboratory Manual.Adison-Wesley. Publishing

Pelczar, M.J. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press.

Priadi, A dan L. Natalia. 2000. Gejala Klinis, Perubahan Patologis, Reisolasi,

Rohimat, S. 2002. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo: Jakarta.

Shankar, B.P. 2008. Common Respiratory Diseases of Poultry. Veterinary World,

Suprijatna, E. 2005. Ilmu Dasar Ternak Unggas. Penebar Swadaya. Bogor.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Tajima, M., T. Yagihashi and Y. Miki. 1982. Capsular Material of Mycoplasma