PENUNTUN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI TANAMAN OBAT

Disusun Oleh:

Tim Kultur Jaringan

Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
 TATA TERTIB PRAKTIKUM
BIOTEKNOLOGI TANAMAN OBAT

1. Praktikan wajib mengenakan pakaian rapi dan sopan

2. Praktikan wajib mengenakan jas laboratorium selama praktikum berlangsung
3. Praktikan wajib datang tepat waktu, apabila terlambat lebih dari 10 menit maka akan
dikenakan sanksi
4. Praktikan wajib menandatangani daftar hadir praktikum
5. Praktikan selalu mempersiapkan diri untuk mengikuti quis atau post test yang
diselenggarakan oleh masing-masing asisten praktikum
6. Praktikan wajib menjaga ketertiban selama praktikum berlangsung, tidak mengobrol
dan mengganggu aktivitas praktikan lain
7. Praktikan tidak diperkenankan untuk makan dan minum selama praktikum
berlangsung
8. Selama praktikum berlangsung tidak diperkenankan menggunakan alat komunikasi,
dan wajib dinonaktifkan/mode diam (silent)
9. Praktikan hanya diperkenankan membawa alat tulis, buku catatan dan hand out ke
meja praktikum
10. Praktikan yang tidak hadir dalam praktikum wajib memberitahukan
ketidakhadirannya pada asisten masing-masing baik secara lisan maupun tulisan, dan
tetap menyerahkan laporan praktikum sesuai waktu yang telah ditentukan
11. Praktikan wajib menyerahkan laporan praktikum 3 hari setelah pelaksanaan
praktikum berlangsung
12. Praktikan wajib ikut memelihara peralatan yang digunakan selama praktikum, serta
bertanggung jawab atas kerusakan dan kehilangan peralatan praktikum yang
disebabkan oleh kelalaian praktikan
13. Kelompok praktikan yang ditentukan wajib melaksanakan piket setelah praktikum
berlangsung
 BAB I
PENGENALAT ALAT DAN BAHAN
LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

Tujuan : Praktikum bertujuan agar mahasiswa mampu memahami fungsi alat dan bahan
serta mengetahui prinsip kerja alat tersebut, mahasiswa juga mampu mengetahui
tatak letak laboratorium kultur jaringan.

Latar Belakang :
Kultur jaringan adalah teknik memperbanyak tanaman dengan cara mengisolasi
bagian tanaman seperti pucuk, batang, daun dan akar yang kemudian di tumbuhkan dalam
media yang kaya akan nutrisi dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Teknik kultur jaringan harus
didukung dengan ketersediaan alat dan bahan, serta laboratorium yang didesain khusus serta
dan dapat dijamin kesterilannya guna meningkatkan tingkat keberhasilan.

Alat :
Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, oven, timbangan analitik, pH meter, spatula,
panci, rak kultur, sprayer, botol kultur, gelas ukur, gelas piala, gunting, scalpel, blade, hot
plate, magnetic stirrer, spuid, syringe filter dan bunsen.

Bahan :
Eksplan yang akan digunakan, media Murashige and Skoog (MS), zat pengatur
tumbuh (ZPT), alkohol 70% dan alkohol 95%, aquades, korek api, plastik, plastik wrap,
clorox, spidol, tisu, sarung tangan, masker, gula dan agar.

Cara Kerja :
1. Praktikan masuk ke dalam laboratorium kultur jaringan secara tertib.
2. Praktikan diperkenalkan ruang-ruang yang berada di dalam laboratorium kultur
jaringan.
3. Praktikan diperkenalkan alat-alat dan bahan yang digunakan untuk kultur jaringan.
Tata Letak Laboratorium :
Tata letak laboratorium perlu di setting sedemikian rupa untuk menjaga sterilisasi dan
mengurangi tingkat kontaminasi pada saat proses persiapan media maupun inisiasi. Biasanya
tiap-tiap ruang disekat dengan kaca. Contoh tata letak laboratorium kutur jaringan dapat
dilihat pada (gambar 1.1).

Gambar 1.1. Contoh tata letak laboratorium kultur jaringan

 BAB II
STERILISASI ALAT DAN BAHAN

Tujuan : Praktikum bertujuan agar mahasiswa mampu mengetahui alat-alat yang digunakan
untuk mensterilkan alat dan bahan yang akan digunakan untuk kultur jaringan.
Praktikkan juga diharapkan mampu mengetahui cara mengoperasikan alat-alat
tersebut.

Latar Belakang :

Kondisi steril merupakan syarat utama keberhasilan praktik teknik kultur jaringan
baik untuk tujuan perbanyakan tanaman maupun tujuan lainnya seperti transformasi genetik.
Kondisi steril berarti bebas mikroorganisme. Dengan demikian, semua alat, bahan, maupun
eksplan yang akan digunakan dalam proses kultur harus dalam kondisi steril. Oleh karena
itu, diperlukan sterilisasi terhadap semua alat, bahan, dan ekspalan.

Alat dan Bahan :

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah autoklaf, oven, dan alat-alat atau
bahan yang akan disterilkan (botol kultur, pinset, scalpel, Petri dan air). Sedangkan bahan
yang digunakan dalam praktikum ini adalah plastik, kertas bekas dan alkohol 95%.

Cara Kerja :
1. Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet)
Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus dan alkohol 70%. Permukaan laminar
sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu cara disemprotkan alkohol 70% dan
kemudian di lap dengan menggunakan tisu kesemua permukaan bagian dalam LAF. Laminar
yang telah bersih kemudian ditutup kembali dan dihnyalakan lampu UV yang berada dalam
LAF selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar. Hal
serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi. Laminar harus
tetap dijaga kebersihannya.
2. Sterilisasi Alat dan Media
 Sterilisasi basah
Sterilisasi basah adalah sterilisasi yang menggunakan uap air dan tekanan, alat yang
digunakan adalah autoklaf. Biasanya yang di sterilkan dalam autoklaf adalah air, media, botol
kultu, Petri dan scalpel. Alat seperti Petri, scalpel dan pinset dibungkus dengan kertas dan
dibungkus lagi dengan pisau. Sedangkan bahan seperti air dimasukkan dalam scott botol dan
media langsung dimasukkan dalam botol kultur.
Alat dan bahan yang telah disiapkan kemudian dimasukkan autoklaf dan diatur pada
suhu 121 oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit. Adapun cara untuk mengoperasika autoklaf
adalah srebagai berikut :
1. Klik tombol on pada bagian kanan sebelah bawah autoklaf
2. Klik power, dan dibuka autoklaf dari lock ke unlock
3. Dipastikan keadaan air mencapai batas minimum
4. Alat ataupun bahan dimasukkan kedalam autoklaf
5. Autoklaf ditutup dari unlock ke lock
6. Klik mode, kemudian klik set dan diatur suhunya 121 oC, klik set dan next atur
waktunya selama 30 menit kemudian klik start. (mode 1 untuk bahan seperti agar,
mode 2 untuk bahan lisquid, mode 3 untuk benda solid).

 Sterilisasi kering
Sterilisasi kering adalah sterilisasi yang menggunakan suhu panas dan tidak
menggunakan air. Biasanya yang disterilkan dalam oven adalah tutup botol. Tutup botol
dimasukkan dalam amplop dan dimasukkan dalam oven.
Tutup botol dimasukkan dalam oven dan oven diatur suhu 170 oC selama 1-2 jam.
Adapun cara unruk mengoperasikan oven adalah sebagai berikut:
1. Klik tombol on pada sebelah kanan bawah oven
2. Klik on/power
3. Kemudian atur suhu dan waktu yang diinginkan
4. Klik start
Pengenceran alkohol 95% menjadi alkohol 70% dalam 1 Liter:
V1.M1 = V2.M2
V1 × 96% = 1000 mL × 70%
(1000 × 70%)
V1 =
96%
V1 = 730 mL

Jadi, alkohol 96% sebanyak 730 ml, kemudian ditambahkan air steril hingga volumenya
mencapai 1000 ml (air yang ditambah sebanyak 270ml).
 BAB III
PEMBUATAN MEDIA

Tujuan : - Mahasiswa memiliki keterampilan dalam membuat media tanam pada kultur
jaringan tanaman

Latar Belakang
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan
secara umum sangat tergantung pada jenis media. Adapun macam-macam jenis media yang
dipakai, yaitu Murashige dan Skoog(MS), Gamborg (B5), Nitsch, Woody Plant Medium
(WPM), Vacint Went (VW) dan Schenk & Hildebrandt. Elemen-elemen mineral sangat
penting bagi kehidupan tanaman. Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikultur
secara in vitro, meliputi hara makro (Macronutrient) dan hara mikro (Micronutrient).
Salah satu komponen media yang menentukan keberhasilan kultur jaringan adalah
jenis dan konsetrasi ZPT yang digunakan. Zat pengatur tumbuh (ZPT) adalah kelompok
hormon yang digunakan dalam kultur jaringan, ZPT dapat ditemukan dalam bentuk organik
maupun sintetis. ZPT untuk menumbuhkan dan menggandakan tunas aksilar atau tunas
adventif adalah dengan mengkombinasikan sitokinin dan auksin dalam konsentrasi yang
rendah. Sedangkan untuk menginduksi akar dan tunas, konsentrasi auksin yang lebih tinggi
dibandingkan sitokinin. Apabila tujuannya untuk menginduksi kalus maka ZPT auksin dan
sitokinin yang digunakan adalah 1:1.

Alat : Bahan :
1. Gelas Beaker 1000 mL 1. Media Murashige & Skoog (MS)
2. Botol kultur 2. Gula
3. Spatula 3. Agar powder
4. Magnetic stirrer 4. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
5. Timbangan analitik 5. NaOH
6. Panci 6. HCl
7. pH meter 7. Aquades / Air RO
Cara kerja :
1. Siapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan dalam proses pembuatan
media kultur
2. Timbang media Murashige Skoog (MS) sebanyak 4,6 gram, gula 40 gram dan
agar powder 8 gram
3. Larutkan MS, gula dan ZPT kedalam gelas beaker kemudian tambahkan aquades
/ air RO sampai batas 1000 mL
4. Ukur pH larutan media hingga mencapai pH 5,8
5. Masukan larutan agar kedalam paci dan masak hingga mendidih
6. Setelah larutan masak, masukkan larutan agar kedalam botol kultur yang telah
steril kemudian ditutup dengan rapat
7. Masukan botol kultur yang berisi media ke dalam autoklaf, dan sterilisasi pada
121oC selama 30 menit
8. Setelah siap sterilisasi, simpan botol kultur berisi media di tempat steril, dan amati
selama 3 hari apakah media terkontaminasi atau tidak
 BAB IV
STERILISASI EKSPLAN DAN INISIASI

Tujuan : - Mahasiswa mengetahui cara sterilisasi eksplan dan

Latar Belakang

Sterilisasi eksplan yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang

sangat penting, karena tanaman yang dari lapang mengandung debu, kotoran-
kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup
dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora-spora.
Bila sumber kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang me-
ngandung gula, vitamin dan mineral akan ditumbuhi oleh jamur dan bakteri.
Apabila eksplan terkontaminasi, maka akan mati oleh persenyawaan beracun yang
di produksi dan dikeluarkan oleh bakteri atau jamur.
Inisiasi merupakan salah satu aspek dari tumbuh pada tanaman dengan
menghasilkan bagian-bagian atau organ baru. Inisiasi adalah tahap pengambilan
eksplan dari tanaman induk yangakan diperbanyak secara kultur jaringan. Sebelum
melakukan inisiasi sebaiknya terlebih dahulu melakukan sterilisasi. Tujuan utama
tahap ini adalah mengusahakan kultur yang aseptic atau aksenik. Aseptik berarti
bebas darimikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme
yang tidak diinginkan.

Alat dan Bahan

- Eksplan (Tanaman yang akan dikultur)
- Beaker glass
- Spatula
- Erlemeyer
- Scalpel
- Pinset
- Blade (mata pisau)
- Media Agar
- Tissue
- Alkohol 96%
- Alkohol 70%
- Bunsen
- Cawan Petri
- Detergen
- Tween-80
- Bayclin
- Air Steril

Cara Kerja
a. Sterilisasi Eksplan
1. Pilihlah eksplan yang unggul dan bebas penyakit
2. Eksplan yang akan ditanam dicuci dengan air mengalir
3. Buatlah larutan detergen dan larutan fungisida
4. Rendam eksplan selama 15 menit ke larutan detergen dan 15 menit ke dalam
larutan fungisida
5. Bilas eksplan dengan air steril

b. Inisiasi
1. Sterilkan LAF dengan alkohol 70% . Alkohol disemprot ke seluruh bagian
LAF. Kemudian diseka dengan tissue hingga mengering.
2. Atur letak bunsen, alat scalpel dan cawan petri.
3. Eksplan direndam ke dalam larutan bayclin yang telah ditambah 5 tetes tween-
80
4. Eksplan dicuci dengan air steril.
5. Sterilkan cawan, scalpel, pinset dengan cara dipanaskan dengan api bunsen
secara berulang.
6. Eksplan dipotong-potong dan dipisahkan bagian yang akan ditanam.
Selanjutnya eksplan ditanam ke dalam media agar
7. Panaskan mulut botol dengan ai bunsen sebelum ditutup rapat.
 BAB V
MULTIPLIKASI DAN PENGAKARAN

Tujuan : - Mahasiswa mengetahui teknik multiplikasi dan pengakaran tanaman secara in

vitro

Latar Belakang

Proses subkultur dalam kultur jaringan adalah pemindahan eksplan ataupun tanaman
hasil kultur yang mengalami kontaminasi maupun kurangnya nutrisi dari media lama ke
media yang baru untuk memenuhi kebutuhan nutrisi sehingga pertumbuhan eskplan atau
tanaman hasil kultur dapat terpenuhi. Subkultur sangat penting dilakukan agar tanaman dapat
terus tumbuh dan berkembang dengan baik, apabila tanaman tidak segera disubkulturkan
maka tanaman tersebut akan mengalami kematian. Dengan demikian tanaman dalam media
kultur yang baru akan mendapatkan nutrisi yang cukup, sehingga akan memberi energi bagi
tanaman untuk tumbuh dan berkembang secara maksimal dan plantlet yang sudah tumbuh
dalam keadaan sehat, maka selanjutnya dapat dilakukan tahap multiplikasi.
Multiplikasi merupakan kegiatan memperbanyakan tanaman dengan cara memotong
plantlet dan ditumbuhkan pada media kultur baru. Tujuan dilakukan multiplikasi adalah
untuk menghasilkan tanmaan dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat.
Secara teknis proses subkultur ataupun multiplikasi dilakukan dengan cara yang sa,a.
Kegiatan ini dilakukan di dalam laminar air flow cabinet (LAFC) untuk menghindari adanya
kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Multiplikasi dapat dilakukan
sebanyak 6 kali pemotongan. Terlalu banyak multiplikasi maka akan menurunkan mutu
tunas, seperti terjadinya vitrifikasi (suatu gejala ketidaknormalan fisiologis) dan aberasi
(penyimpangan genetik).

Alat: Bahan:
1. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) 1. Plantlet
2. Cawan petri 2. Media kultur
3. Bunsen 3. Spirtus
4. Scalpel dan Blade 4. Alkohol 70%
5. Pinset 5. Alkohol 96
 6. Korek 6. Air steril
7. Plasik wrap 7. Zat pengatur tumbuh (ZPT)
8. Masker 8. Arang aktif
9. Sarung tangan

Cara kerja :
A. Pembuatan Larutan Stok Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
1. Siapkan ZPT auksin dan sitokinin yang akan digunakan
2. Larutan auksin dan sitokinin dibuat sebanyak 100 ml
3. Timbang 10 gram ZPT auksin/sitokinin
4. Larutkan dalam 50 ml menggunakan air steril
5. Tambahkan 5 tetes atau lebih NaOH sambil larutan di aduk diatas magnetic stirrer
6. Apabila telah larut tambahkan air steril hingga batas 100 ml
7. Sisa ZPT yang tidak digunakan ditutup menggunakan alumunium foil atau plastik
wrap dan disimpan di lemari pendingin

B. Multiplikasi
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses multiplikasi
2. Nyalakan lampu dan blower pada LAFC, kemudian semprot alkohol 70% kemudian
dilap
3. Nyalakan lampu bunsen
4. Rendam scalpel & blade dan pinset ke dalam alkohol 96%, apabila hendak dipakai
bakar diatas lampu bunsen dari pangkal hingga ujung. Lakukan beberapa kali, untuk
menghilangkan jamur atau bakteri yang menempel
5. Ambil plantlet tanaman pad botol kultur yang akan dimultiplikasi
6. Letakan plantlet didalam cawan petri dan dipotong-potong menggunakan scalpel
sesuai kebutuhan
7. Eksplan yang telah dipotong ditanam kembali pada media kultur baik yang berisi ZPT
atau arang aktif sebagai media perakaran. Isi 1 botol kultur dengan 3-5 eksplan
(disesuaikan)
8. Tutup rapat dan lilit menggunakan plastik wrap
9. Beri label tanggal, nama tanaman dan nama pemindah plantlet multiplikasi/subkultur
 BAB IV
AKLIMATISASI

A. Alat

B. Pendahuluan
Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian planlet dari kondisi mikro dalam
botol (heterotrof) ke kondisi lingkungan luar (autotrof). Planlet yang dipelihara
dalam keadaan steril dalam lingkungan (suhu dan kelembaban) optimal, sangat
rentan terhadap lingkungan luar (lapang). Mengingat sifat-sifat tersebut, sebelum
ditanam di lapang, planlet memerlukan aklimatisasi. Aklimatisasi dapat dilakukan
di rumah kaca atau pesemaian, baik di rumah kaca atau pesemaian. Dalam
aklimatisasi, lingkungan tumbuh (terutama kelembaban) berangsur-aengsur
disesuaikan dengan kondisi lapang (Rahardja 1989).

C. Tujuan
1. Mengetahui cara mempersiapkan tanaman untuk diaklimatisasikan
2. Mengetahui cara mengaklimatisasikan tanaman hasil kultur jaringan
dalam media aklimatisasi
3. Bak kecambah
4. Sungkup plastik
5. Pinset
6. Ember
7. Sprayer

D. Cara Kerja
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses aklimatisasi
2. Keluarkan planlet dari botol kultur kemudian dicuci di air mengalir sampai
media kultur yang menempel di akar bersih
3. Siapkan media di dalam bak kecambah
4. Tanam planlet yang sudah bersih di bak kecambah tersebut dengan jarak
terrentu
5. Atur kelembaban dengan menggunakan sungkup dan menyiramnya dengan
mengguakan sprayer