Tamoxifen activity against Plasmodium in vitro Aktivitas Tamoxifen terhadap Plasmodium secara in vitro
and in mice
ABSTRACT
Background: Tamoxifen is an oestrogen receptor
modulator that is widely used for the treatment of
early stage breast cancer and reduction of
recurrences. Tamoxifen is also used as a powerful
research tool for controlling gene expression in the
context of the Cre/loxP site‑specifc recombination
system in conditional mutant mice.
Methods: To determine whether the administration of
tamoxifen afects Plasmodium growth and/or disease
out‑come in malaria, in vitro studies assessing the
efect of tamoxifen and its active metabolite
4‑hydroxytamoxifen on Plasmodium falciparum blood
stages were performed. Tamoxifen efects were also
evaluated in vivo treating C57/B6 mice infected with
Plasmodium berghei (ANKA strain), which is the
standard animal model for the study of cerebral
malaria.
Results: Tamoxifen and its active metabolite,
4‑hydroxytamoxifen, show activity in vitro against P.
falciparum (16.7 to 5.8 µM IC50, respectively). This
activity was also confrmed in tamoxifen‑treated mice
infected with P. berghei, which show lower levels of
parasitaemia and do not develop signs of cerebral
malaria, compared to control mice. Mice treated with
tamoxifen for 1 week and left untreated for an
additional week before infection showed similar
parasitaemia levels and signs of cerebral malaria as
control untreated mice.
Conclusions: Tamoxifen and its active metabolite,
4‑hydroxytamoxifen, have signifcant activity against
the human parasite P. falciparum in vitro and the
rodent parasite P. berghei in vivo. This activity may
be useful for prevention of malaria in patients taking
this drug chronically, but also represents a major
problem for scientists using the conditional mutagenic
Cre/LoxP system in the setting of rodent malaria.
Allowing mice to clear tamoxifen before starting a
Plasmodium infection allows the use the Cre/LoxP
conditional mutagenic system to investigate gene
function in specifc tissues.
Keywords: Tamoxifen, 4‑Hydroxytamoxifen, Cerebral Kata kunci: Tamoxifen, 4-Hydroxytamoxifen, Malaria
malaria, Plasmodium berghei, Plasmodium serebral, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Cre /
falciparum, Cre/LoxP LoxP
dan pada tikus
ABSTRAK
Latar Belakang: Tamoxifen adalah modulator reseptor
estrogen yang banyak digunakan untuk pengobatan kanker
payudara tahap awal dan pengurangan kekambuhan.
Tamoxifen juga digunakan sebagai alat penelitian yang kuat
untuk mengendalikan ekspresi gen dalam konteks sistem
rekombinasi spesifik situs Cre / loxP pada tikus mutan
bersyarat.
Metode: Untuk menentukan apakah administrasi tamoxifen
menginfeksi pertumbuhan Plasmodium dan / atau penyakit
yang datang pada malaria, studi in vitro menilai efek
tamoxifen dan metabolit aktifnya 4-hydroxytamoxifen pada
tahap darah Plasmodium falciparum dilakukan. Efek
Tamoxifen juga dievaluasi secara in vivo untuk mengobati
tikus C57 / B6 yang terinfeksi Plasmodium berghei (strain
ANKA), yang merupakan model hewan standar untuk
penelitian malaria serebral.
Hasil: Tamoxifen dan metabolit aktifnya, 4-
hydroxytamoxifen, menunjukkan aktivitas in vitro terhadap P.
falciparum (masing-masing 16,7 hingga 5,8 μM IC50).
Kegiatan ini juga dikonfirmasi pada tikus yang diobati
dengan tamoxifen yang terinfeksi P. berghei, yang
menunjukkan tingkat parasitaemia yang lebih rendah dan
tidak mengembangkan tanda-tanda malaria serebral,
dibandingkan dengan tikus kontrol. Tikus yang diobati
dengan tamoxifen selama 1 minggu dan tidak diobati selama
seminggu tambahan sebelum infeksi menunjukkan tingkat
parasitemia dan tanda-tanda malaria serebral yang sama
dengan tikus kontrol yang tidak diobati.
Kesimpulan: Tamoxifen dan metabolit aktifnya, 4-
hydroxytamoxifen, memiliki aktivitas signifikan terhadap
parasit manusia P. falciparum in vitro dan parasit hewan
pengerat P. berghei in vivo. Kegiatan ini mungkin berguna
untuk pencegahan malaria pada pasien yang menggunakan
obat ini secara kronis, tetapi juga merupakan masalah besar
bagi para ilmuwan menggunakan sistem Cre / LoxP
mutagenik bersyarat dalam pengaturan malaria hewan
pengerat. Mengizinkan tikus untuk membersihkan tamoxifen
sebelum memulai infeksi Plasmodium memungkinkan
penggunaan sistem mutagenik bersyarat Cre / LoxP untuk
menyelidiki fungsi gen dalam jaringan tertentu.
BACKGROUND LATAR BELAKANG

Tamoxifen is the most used selective oestrogen-
receptor modulator to prevent and treat oestrogen
receptor positive breast cancer. More than 40 years
after tamoxifen discovery, it still remains as one of the
most efective therapies for cancer treatment [1]. Due
to its low cost and safety profle, its use is now
generalized worldwide [2].
Tamoxifen adalah modulator reseptor estrogen selektif yang
paling banyak digunakan untuk mencegah dan mengobati
kanker payudara positif reseptor estrogen. Lebih dari 40
tahun setelah penemuan tamoxifen, masih tetap sebagai
salah satu terapi yang paling efektif untuk pengobatan
kanker [1]. Karena biayanya yang murah dan keamanan,
penggunaannya sekarang digeneralisasi di seluruh dunia [2].

Tamoxifen is also well known by the scientifc Tamoxifen juga dikenal oleh komunitas scientif, tidak hanya
community, not only for its outstanding anticancer karena sifat antikankernya yang luar biasa, tetapi juga
properties, but also for its role as exogenous ligand karena perannya sebagai ligan eksogen untuk sistem
for the inducible Cre/loxP site-specifc recombination rekombinasi spesifik situs Cre / loxP yang dapat diinduksi
system. The Cre/loxP site-specifc recombination situs. Sistem rekombinasi situs-spesifik Cre / loxP adalah
system is a powerful and extensively used tool for alat yang kuat dan digunakan secara luas untuk
controlling gene expression. The Cre/LoxP system mengendalikan ekspresi gen. Sistem Cre / LoxP
allows researchers to tightly control gene expression memungkinkan para peneliti untuk mengontrol ekspresi gen
in a tissue and time specifc manner. These secara ketat dalam suatu jaringan dan cara waktu tertentu.
conditional mutagenic systems consist of the gene for Sistem mutagenik kondisional ini terdiri dari gen Cre-
Cre-recombinase fused to mutated hormone-binding recombinase yang menyatu dengan domain pengikat
domains of the oestrogen receptor that can be hormon mutasi dari reseptor estrogen yang dapat diaktifkan
activated by administration of tamoxifen to the animal dengan pemberian tamoxifen pada hewan [3]. Kekuatan dan
[3]. The power and versatility of this resource has keserbagunaan sumber daya ini telah menjadi alat penting
become an essential tool for gene targeting untuk eksperimen penargetan gen di hampir setiap bidang
experiments in almost every medical research feld. penelitian medis. Anehnya, penelitian yang diterbitkan
Surprisingly, published studies using this conditional menggunakan teknologi mutagenik bersyarat ini dalam
mutagenic technology in the setting of experimental pengaturan malaria eksperimental, di mana infeksi tikus
malaria, where rodent infections are the most adalah model yang paling umum digunakan untuk penelitian
common model used for research in this disease, penyakit ini, tidak ditemukan.
were not found.
Laporan malaria Organisasi Kesehatan Dunia (WHO)
The last World Health Organization (WHO) malaria terakhir mengkonfirmasi sekitar 219 juta kasus malaria baru
report confrms an estimated 219 million new cases of dan lebih dari 400.000 kematian, kira-kira jumlah yang sama
malaria and more than 400,000 deaths, diamati selama 2 tahun sebelumnya [4]. Kemandekan dalam
approximately the same number observed during the pengurangan kasus dan kematian, menjadikan malaria
previous 2 years [4]. The stagnation in the reduction sebagai salah satu dari 5 penyebab utama kematian pada
of cases and deaths, keeps malaria as one of the top anak-anak di seluruh dunia, merenggut nyawa seorang anak
5 causes of death in children worldwide, claiming a setiap 2 menit [5]. Kombinasi model eksperimental malaria
child’s life every 2 min [5]. The combination of dan sistem mutagenik bersyarat Cre / loxP akan menjadi
experimental models of malaria and Cre/loxP strategi yang kuat untuk lebih memahami mekanisme yang
conditional mutagenic system would be a powerful mengatur kerentanan terhadap malaria. Namun, sistem ini
strategy to further understand the mechanisms membutuhkan penggunaan tamoxifen untuk menginduksi
regulating susceptibility to malaria. However, this rekombinasi Cre / loxP pada tikus.
system requires the use of tamoxifen to induce
Cre/loxP recombination in mice. Tamoxifen telah menunjukkan aktivitas tambahan selain
antikanker termasuk efek antibakteri, antivirus dan bahkan
Tamoxifen has shown additional activities other than antiparasit (anti-echinococcus dan anti-leishmania) [1].
anticancer including antibacterial, antiviral and even Selain itu, tamoxifen mengganggu in vitro dengan kadar
antiparasitic (anti-echinococcus and anti-leishmania) glucosylceramidesynthase dan sphingomyelin synthase dari
efects [1]. Moreover, tamoxifen interferes in vitro with Plasmodium falciparum yang mempengaruhi jalur
the glucosylceramidesynthase and sphingomyelin sphingolipid bioaktif [6]. Meskipun telah dilaporkan bahwa
synthase levels of Plasmodium falciparum afecting tamoxifen tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan P.
the bioactive sphingolipid pathway [6]. Although it has falciparum pada konsentrasi lebih rendah dari 10 μM [7],
been reported that tamoxifen has no efect over P. tidak ada penelitian tentang efek obat ini pada konsentrasi in
falciparum growth at concentrations lower than 10 µM vitro yang lebih tinggi atau pada Plasmodium spp in vivo
[7], there are no studies about the efect of this drug at lainnya.
higher concentrations in vitro or on other Plasmodium
spp in vivo. Dalam karya ini, aktivitas tamoxifen dan metabolit aktifnya 4-
hydroxytamoxifen secara in vitro terhadap P. falciparum
In this work, the activity of tamoxifen and its active dievaluasi. Dampak tamoxifen pada infeksi Plasmodium
metabolite 4-hydroxytamoxifen in vitro against P. berghei pada tikus juga dianalisis, termasuk tingkat
falciparum was evaluated. The impact of tamoxifen in parasitaemia dan pengembangan tanda-tanda neurologis
Plasmodium berghei infections in mice was also dalam model tikus percobaan malaria otak. Akhirnya,
analysed, including parasitaemia levels and the protokol alternatif yang memungkinkan penggunaan sistem
development of neurological signs in the experimental mutagenik kondisional Cre / loxP untuk studi infeksi
cerebral malaria mouse model. Finally, an alternative Plasmodium dan pengembangan malaria serebral pada
protocol that allows the use of Cre/loxP conditional model tikus disediakan.
mutagenic system for the study of Plasmodium
infections and development of cerebral malaria in
mouse models is provided.

METHODS METODE

This study strictly followed the recommendations in
the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals
of the National Institutes of Health. The protocol was
reviewed and approved by the Institutional Animal
Care and Use Committee of New York University
School of Medicine, which is fully accredited by the
Association for Assessment and Accreditation Of
Laboratory Animal Care International (AAALAC).
Studi ini secara ketat mengikuti rekomendasi dalam
Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan
Laboratorium dari Institut Kesehatan Nasional. Protokol ini
ditinjau dan disetujui oleh Komite Perawatan dan
Penggunaan Hewan Institusional Fakultas Kedokteran
Universitas New York, yang diakreditasi penuh oleh Asosiasi
untuk Penilaian dan Akreditasi Laboratorium Perawatan
Hewan Internasional (AAALAC).

Determination of IC50 against Plasmodium Penentuan IC50 terhadap Plasmodium falciparum in

falciparum in vitro
Using 96-well plates, 100 µl of P. falciparum growth
medium (RPMI 1640, 25 mM HEPES, 0.1 mg/ml gen-
tamicin, 0.05 mg/l hypoxanthine [pH 6.75]),
supplemented with 0.25% sodium bicarbonate and
0.5% Albumax II (Invitrogen), were added to each
well.
Compounds from a DMSO stock at 10 mM were then
serially diluted in triplicate. DMSO at the highest
concentration used (0.5%) was tested in parallel,
showing no diferences from the control samples.
Plasmodium falciparum infected erythrocytes (RBCs)
were incubated at 0.25% parasitaemia and 5%
haematocrit and treated with increasing doses of
tamoxifen, its bioactive metabolite 4-
hydroxytamoxifen, and chloroquine as positive control
(IC50 < 0.78 µM), for 96 h in a gas chamber
containing 90% nitrogen, 5% carbon dioxide and 5%
oxygen. After incubation, the parasite was frozen for
24 h at − 80 °C, then thawed for 4 h and transferred
to a new 96-well plate. 0.01% SYBR Green I nucleic
acid staining dye (Molecular Probes) mixed with lysis
bufer (20 mM Tris at pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.008%
saponin, and 0.08% Triton X-100) was added to each
well and incubated at room temperature on a shaker
for 1 h. Fluorescence was measured using excitation
vitro
Menggunakan lempeng 96-sumur, 100 μl media
pertumbuhan P. falciparum (RPMI 1640, HEPES 25 mM, 0,1
mg / ml gen-tamicin, 0,05 mg / l hipoksantin [pH 6,75]),
ditambah dengan 0,25% natrium bikarbonat dan 0,5%
Albumax II (Invitrogen), ditambahkan ke masing-masing
sumur.
Senyawa dari stok DMSO pada 10 mM kemudian
diencerkan secara seri dalam rangkap tiga. DMSO pada
konsentrasi tertinggi yang digunakan (0,5%) diuji secara
paralel, tidak menunjukkan perbedaan dari sampel kontrol.
Erythrocytes (RBCs) yang terinfeksi Plasmodium falciparum
diinkubasi pada 0,25% parasitaemia dan 5% hematokrit dan
diobati dengan peningkatan dosis tamoxifen, metabolit
bioaktif 4-hidroksi-kotoksifen, dan klorokuin sebagai kontrol
positif (IC50 <0,78 μM), selama 96 jam dalam gas ruang
yang mengandung 90% nitrogen, 5% karbon dioksida dan
5% oksigen. Setelah inkubasi, parasit dibekukan selama 24
jam pada - 80 ° C, kemudian dicairkan selama 4 jam dan
dipindahkan ke piring baru 96-sumur. 0,01% SYBR Green I
pewarnaan asam nukleat (Probe Molekuler) dicampur
dengan lisis bufer (20 mM Tris pada pH 7,5, 5 mM EDTA,
0,008% saponin, dan 0,08% Triton X-100) ditambahkan ke
masing-masing sumur dan diinkubasi di kamar suhu pada
shaker selama 1 jam. Fluoresensi diukur menggunakan
panjang gelombang eksitasi dan emisi masing-masing 485
and emission wavelengths of 485 and 530 nm, dan 530 nm.
respectively.
Aktivitas tamoxifen terhadap stadium darah P.
Activity of tamoxifen against P. falciparum blood falciparum in vitro
stage in vitro Kultur Plasmodium falciparum disinkronkan menggunakan
Plasmodium falciparum cultures were synchronized sorbitol 5%. Kultur yang disinkronkan pada tahap cincin /
using sorbitol 5%. Synchronized cultures at trofozoit atau schizont / cincin diinkubasi dengan 4-
ring/trophozoite or schizont/ring stages were hydroxytamoxifen pada 25 μM atau DMSO 0,5% sebagai
incubated with 4-hydroxytamoxifen at 25 μM or kontrol selama 24 atau 18 jam dan kepadatan parasit
DMSO 0.5% as a control for 24 or 18 h and parasite dikuantifikasi.
densities were quantifed.
Infeksi P. berghei eksperimental
Experimental P. berghei infections Tikus C57 / B6 jantan dan betina berumur 5 minggu dibeli
Both males and females 5 weeks old C57/B6 mice dari Taconic Farms Inc. Hewan-hewan terinfeksi oleh i.p.
were purchased from Taconic Farms Inc. Animals inokulasi 200 μl PBS steril yang mengandung konsentrasi P.
were infected by i.p. inoculation of 200 µl of sterile berghei (strain ANKA) yang berbeda menginfeksi sel darah
PBS containing diferent concentrations of P. berghei merah (1 × 106, 5 × 106 atau 20 × 106). Parasitaemia
(ANKA strain) infected RBCs (1 × 106, 5 × 106 or 20 × ditentukan pada apusan darah tipis Giemsa dengan
106). Parasitaemia was determined in Giemsa-stained mikroskop. Penentuan dan tingkat keparahan malaria
thin blood smears by microscopy. Determination and serebral eksperimental dinilai seperti yang dijelaskan
severity of experimental cerebral malaria was scored sebelumnya [8] berdasarkan penampilan (Normal = 0;
as previously described [8] based on appearance Lambang rufed = 1; Lambang menatap / terengah-engah =
(Normal = 0; Coat rufed = 1; Coat staring/panting = 2) 2) dan perilaku (Normal = 0; Membungkuk = 1; Kelumpuhan
and behaviour (Normal = 0; Hunched = 1; Partial parsial = 3 ; Kejang = 4). Tamoxifen diberikan dalam diet
paralysis = 3; Convulsions = 4). Tamoxifen was (Envigo) pada 40 mg / kg per hari.
administered in the diet (Envigo) at 40 mg/kg per day.
Analisis statistik
Statistical analyses Signifikansi untuk pertumbuhan P. falciparum intra-eritrosit
Signifcance for intra-erythrocytic P. falciparum growth dihitung menggunakan ANOVA 2 arah. Signifikansi untuk
was calculated using 2-way ANOVA. Signifcance for parasitemia dihitung untuk setiap hari secara individual,
parasitaemia was calculated for each day individually, menggunakan uji t tidak berpasangan untuk percobaan
using unpaired t test for experiments with 2 groups dengan 2 kelompok dan ANOVA 1 arah untuk percobaan
and 1-way ANOVA for experiments with more than 2 dengan lebih dari 2 kelompok. Area di bawah kurva dihitung
groups. The area under the curve was calculated for untuk skor penyakit dan analisis statistik dilakukan dengan
disease score and statistical analysis was performed menggunakan uji t tidak berpasangan. Kurva survival
using an unpaired t test. Survival curves were dibandingkan dengan menggunakan uji Log-rank (Mantel-
compared using Log-rank (Mantel–Cox) test. p ≤ 0.05 Cox). p ≤ 0,05 dianggap signifikan. Data dianalisis
was considered signifcant. Data was analysed using menggunakan Graph-Pad Prism 7.05.
Graph-Pad Prism 7.05.

RESULTS HASIL

Tamoxifen inhibits P. falciparum growth in vitro Tamoxifen menghambat pertumbuhan in vitro P.

To test whether tamoxifen has any direct efects on P.
falciparum growth, an in vitro growth assay was
performed. The parasite was treated with increasing
doses of tamoxifen, or its bioactive metabolite 4-
hydroxytamoxifen [9]. Parasite viability was measured
after 96 h.
These results show that tamoxifen and 4-hydroxyta-
moxifen have IC50s against P. falciparum of 16.7 µM
and 5.8 µM, respectively (Fig. 1). These results
indicate that the tamoxifen bioactive metabolite is
more efective than the original compound, predicting
a signifcant in vivo anti-Plasmodium activity.
falciparum
Untuk menguji apakah tamoxifen memiliki efek langsung
pada pertumbuhan P. falciparum, dilakukan uji pertumbuhan
in vitro. Parasit diobati dengan dosis tamoxifen yang
meningkat, atau metabolit bioaktifnya 4-hydroxytamoxifen
[9]. Viabilitas parasit diukur setelah 96 jam.
Hasil ini menunjukkan bahwa tamoxifen dan 4-hydroxyta-
moxifen memiliki IC50 terhadap P. falciparum masing-
masing 16,7 µM dan 5,8 µM (Gambar 1). Hasil ini
menunjukkan bahwa metabolit bioaktif tamoxifen lebih efektif
daripada senyawa asli, yang memprediksi aktivitas anti-
Plasmodium in vivo yang signifikan.
To characterize in more detail the efect of 4-hydroxy-
tamoxifen on P. falciparum-infected RBCs, this
compound was added to in vitro-synchronized
cultures of the parasite and followed their
development. When 4-hydroxytamoxifen was added
to cultures of ring/trophozoite stages for 24 h, an
almost complete arrest of parasite growth was
observed (Fig. 2a), indicating that 4-hydroxytamoxifen
afects early intra-erythrocytic parasite development.
The addition of 4-hydroxytamoxifen to cultures in the
schizont stage for 18 h did not afect the progression
from schizonts into rings (Fig. 2b), indicating that
merozoite release and reinvasion of new RBCs was
not afected.
Tamoxifen inhibits P. berghei growth
and the development of cerebral malaria in mice
Since tamoxifen and its bioactive form impair parasite
growth in vitro, the tamoxifen efect on infected mice
was examined. For this purpose, C57/B6 mice were
treated with tamoxifen for 1 week prior to infection
with 106 P. berghei infected RBCs. Tamoxifen
treatment continued throughout the course of
infection. At day 3 post infection, parasitaemia was
signifcantly higher in the control group (1.56% ± 0.39)
compared with the tamoxifen treated mice (0.64% ±
0.1). The diferences in parasitaemia increased over
time with a 2.7-fold diference between control and
treated mice at day 5 post infection that continued at
day 7 (Fig. 3a).
Mice were closely monitored for the development of
neurological signs of cerebral malaria. Interestingly,
mice treated with tamoxifen did not develop cerebral
malaria. At day 6 post infection 100% of the control
mice (− Tam), compared to 10% of tamoxifen-treated
mice (+ Tam), presented typical neurological signs
associated with cerebral malaria (Fig. 3b).
Additionally, the severity of the disease was much
greater in the control mice, as indicated by the
disease score (Fig. 3b). Accordingly, the control
group presented signifcantly higher mortality. At day
7.5 post infection, all of the tamoxifen treated mice
had survived while all of the control animals had died
(Fig. 3c). The tamoxifen treated group was monitored
for additional 2 weeks, in which none of the mice
showed signs of cerebral malaria. Taken together,
these data demonstrate that tamoxifen treatment
inhibits parasite growth and prevents the
development of cerebral malaria.
Alternative strategies to study cerebral malaria
in genetic mouse models that require tamoxifen
Finding that tamoxifen inhibits the development of
cerebral malaria in mice indicates that the use of the
Cre/LoxP recombination system in mice cannot be
Untuk mengkarakterisasi secara lebih rinci efek 4-hidroksi-
tamoksifen pada sel darah merah yang terinfeksi P.
falciparum, senyawa ini ditambahkan pada kultur parasit
yang disinkronkan secara in vitro dan mengikuti
perkembangannya. Ketika 4-hydroxytamoxifen ditambahkan
ke kultur tahap cincin / trofozoit selama 24 jam,
penangkapan pertumbuhan parasit yang hampir lengkap
diamati (Gambar 2a), menunjukkan bahwa 4-
hydroxytamoxifen menginfeksi perkembangan awal parasit
intra-erythrocytic. Penambahan 4-hydroxytamoxifen ke kultur
dalam tahap schizont selama 18 jam tidak mempengaruhi
perkembangan dari schizonts menjadi cincin (Gbr. 2b),
menunjukkan bahwa pelepasan merozoit dan reinvasion dari
sel darah merah baru tidak terpengaruh.
Tamoxifen menghambat pertumbuhan P. berghei dan
perkembangan malaria serebral pada tikus
Karena tamoxifen dan bentuk bioaktifnya merusak
pertumbuhan parasit secara in vitro, efek tamoxifen pada
tikus yang terinfeksi diperiksa. Untuk tujuan ini, tikus C57 /
B6 diobati dengan tamoxifen selama 1 minggu sebelum
infeksi dengan sel darah merah yang terinfeksi 10 6 P.
berghei. Pengobatan Tamoxifen berlanjut selama infeksi.
Pada hari ke 3 pasca infeksi, parasitaemia secara signifikan
lebih tinggi pada kelompok kontrol (1,56% ± 0,39)
dibandingkan dengan tikus yang diberi tamoxifen (0,64% ±
0,1). Perbedaan pada parasitemia meningkat seiring waktu
dengan perbedaan 2,7 kali lipat antara kontrol dan tikus
yang diobati pada hari ke 5 pasca infeksi yang berlanjut
pada hari ke 7 (Gbr. 3a).
Tikus dimonitor untuk pengembangan tanda-tanda
neurologis malaria serebral. Menariknya, tikus yang diobati
dengan tamoxifen tidak mengembangkan malaria otak. Pada
hari ke 6 pasca infeksi, 100% tikus kontrol (- Tam),
dibandingkan dengan 10% tikus yang diobati dengan
tamoxifen (+ Tam), menunjukkan tanda-tanda neurologis
khas yang terkait dengan malaria serebral (Gambar 3b).
Selain itu, tingkat keparahan penyakit jauh lebih besar pada
tikus kontrol, seperti yang ditunjukkan oleh skor penyakit
(Gambar 3b). Dengan demikian, kelompok kontrol
menunjukkan angka kematian yang jauh lebih tinggi. Pada
hari ke 7,5 pasca infeksi, semua tikus yang diberi tamoxifen
bertahan hidup sementara semua hewan kontrol mati (Gbr.
3c). Kelompok yang diberi tamoxifen dipantau selama 2
minggu, di mana tidak ada tikus yang menunjukkan tanda-
tanda malaria otak. Secara keseluruhan, data ini
menunjukkan bahwa pengobatan tamoxifen menghambat
pertumbuhan parasit dan mencegah perkembangan malaria
serebral.
Strategi alternatif untuk mempelajari malaria serebral
dalam model tikus genetik yang membutuhkan
tamoxifen
Temuan bahwa tamoxifen menghambat perkembangan
malaria serebral pada tikus menunjukkan bahwa
used for the study of cerebral malaria. To overcome
this limitation, an attempt was made to find the
conditions to induce cerebral malaria in mice treated
with tamoxifen to induce Cre/LoxP recombination.
Since the induction of cerebral malaria in mice is
dependent on the amount of inoculum used for
infection [10], we tested whether the inhibition of
cerebral malarial development by tamoxifen could be
overcome by increasing the inoculum dose. Tree
groups of mice were subjected to tamoxifen treatment
for 1 week prior to infection with 1, 5 or 20 million P.
berghei infected RBCs. Parasite growth and signs of
cerebral malaria were monitored thereafter, with the
mice subjected to continuous tamoxifen treatment.
Results show that all the groups had similar parasite
levels throughout the experiment (Fig. 4a) and none
of the mice in any of the treated groups developed
signs of cerebral malaria.
The next step was to investigated whether an
alternative approach where tamoxifen would be used
prior to infection to induce the required Cre activity,
followed by a period without treatment to allow the
drug to be eliminated from the mice, would result in
normal growth of the parasite and the development of
cerebral malaria.
To test this hypothesis, mice were treated with
tamoxifen for 1 week and then rested, without any
further tamoxifen treatment, for 1 or 2 weeks.
Tereafter, mice were injected with 106 P. berghei
infected RBCs and carefully monitored for
parasitaemia, disease signs and survival. These
results show that resting for either 1 or 2 weeks post
tamoxifen treatment enables parasite growth to levels
similar to control untreated mice (Fig. 4b). Signs of
cerebral malaria also increased similarly in all groups
(Fig. 4c). Signs started to appear in all groups at day
5.5 post infection and the severity of the disease was
comparable at all times. Survival was also similar
between the groups (Fig. 4d), with all mice dying by
day 6.5 post infection. Hence, these data
demonstrate that tamoxifen directly afects the survival
of P. berghei, however, pretreatment with tamoxifen
does not signifcantly infuence parasitaemia and the
course of cerebral malaria when administered at least
1 week before infection.
penggunaan sistem rekombinasi Cre / LoxP pada tikus tidak
dapat digunakan untuk studi malaria serebral. Untuk
mengatasi keterbatasan ini, upaya dilakukan untuk
menemukan kondisi untuk menginduksi malaria otak pada
tikus yang diobati dengan tamoxifen untuk menginduksi
rekombinasi Cre / LoxP.
Karena induksi malaria serebral pada tikus tergantung pada
jumlah inokulum yang digunakan untuk infeksi [10], kami
menguji apakah penghambatan perkembangan malaria
serebral oleh tamoxifen dapat diatasi dengan meningkatkan
dosis inokulum. Kelompok pohon tikus menjadi sasaran
perawatan tamoxifen selama 1 minggu sebelum infeksi
dengan 1, 5 atau 20 juta sel darah merah yang terinfeksi P.
berghei. Pertumbuhan parasit dan tanda-tanda malaria
serebral dipantau setelahnya, dengan tikus-tikus tersebut
menjalani pengobatan tamoxifen terus menerus. Hasil
menunjukkan bahwa semua kelompok memiliki tingkat
parasit yang sama selama percobaan (Gambar 4a) dan tidak
ada tikus pada kelompok perlakuan yang mengalami tanda-
tanda malaria serebral.
Langkah selanjutnya adalah menyelidiki apakah pendekatan
alternatif di mana tamoxifen akan digunakan sebelum infeksi
untuk menginduksi aktivitas Cre yang diperlukan, diikuti oleh
periode tanpa pengobatan untuk memungkinkan obat
dihilangkan dari tikus, akan menghasilkan pertumbuhan
normal parasit. dan perkembangan malaria serebral.
Untuk menguji hipotesis ini, tikus diobati dengan tamoxifen
selama 1 minggu dan kemudian diistirahatkan, tanpa
perawatan tamoxifen lebih lanjut, selama 1 atau 2 minggu.
Selanjutnya, tikus disuntik dengan sel darah merah yang
terinfeksi 106 P. berghei dan dipantau secara hati-hati untuk
parasitemia, tanda-tanda penyakit, dan kelangsungan hidup.
Hasil ini menunjukkan bahwa istirahat selama 1 atau 2
minggu pasca perawatan tamoxifen memungkinkan
pertumbuhan parasit ke tingkat yang sama dengan
mengendalikan tikus yang tidak diobati (Gbr. 4b). Tanda-
tanda malaria serebral juga meningkat secara serupa pada
semua kelompok (Gbr. 4c). Tanda-tanda mulai muncul di
semua kelompok pada hari 5,5 pasca infeksi dan tingkat
keparahan penyakit itu sebanding setiap saat.
Kelangsungan hidup juga serupa antara kelompok (Gambar
4d), dengan semua tikus mati pada hari 6,5 pasca infeksi.
Oleh karena itu, data ini menunjukkan bahwa tamoxifen
secara langsung mempengaruhi kelangsungan hidup P.
berghei, namun, pretreatment dengan tamoxifen tidak
secara signifikan mempengaruhi parasitemia dan perjalanan
malaria serebral ketika diberikan setidaknya 1 minggu
sebelum infeksi.
DISCUSSION
Regardless of the constant eforts to reduce the
burden of the disease, malaria was responsible for
more than 260,000 deaths in children under 5 years
in 2017 alone [4]. Emergence of new resistant strains
of Plasmodium parasites to classical anti-malarial
drugs, but in particular to artemisinin-based
combination therapy [11, 12], are jeopardizing the
international eforts to combat malaria and increase
the need for the development of new therapies
against this infection. Here we report the anti-malarial
efects of tamoxifen, a drug that has been used
worldwide for the treatment of breast cancer for over
30 years. Our observation that tamoxifen has potent
activity against P. falciparum in vitro and induces a
signifcant decrease of P. berghei growth in mice,
positions this drug as a possible candidate for
development as an anti-malarial. These data also
suggest that patients taking tamoxifen for extended
periods of time, as it is frequent when prescribed for
prevention of recurrences or in genetically identified
high-risk patients, may present increased protection
against malaria.
Tamoxifen is also active against another protozoan
parasite, Leishmania, with an IC50 of 11 µM in vitro
[13], which is similar to these findings for Plasmodium
(16 µM). Tamoxifen has been proposed as a partner
in drug-combination therapies anti-Leishmania, since
it increased the efectivity of classical agents against
this parasite in mice with leishmaniasis [14, 15].
Additionally, it was shown that Leishmania is not
prone to develop resistance to tamoxifen, which is an
important feature for diseases such as malaria and
leishmaniasis where drug resistance is frequently
found in the field [16].
Of all malaria cases, only 1% of the patients develop
severe malaria, a life-threatening disease [17]. The
most common complications of severe malaria are
cerebral malaria, acute respiratory distress, severe
anaemia and acute kidney injury [18]. Patients of
severe malaria can rapidly deteriorate, and mortality
rate can exceed 50% even when anti-malarial
treatment is provided [19]. Advancing the
understanding of severe malaria pathogenesis is
essential to develop new adjunctive therapies to treat
these deadly complications of malaria. In that sense,
rodent malaria models of human severe malaria are
key to basic discovery, drug testing and pathogenesis
research [20]. Rodent malaria models have raised
some criticisms in the scientifc community due to their
limitations in reproducing the human disease;
however, they have provided critical insights into the
DISKUSI
Terlepas dari upaya konstan untuk mengurangi beban
penyakit, malaria bertanggung jawab atas lebih dari 260.000
kematian pada anak di bawah 5 tahun pada tahun 2017 saja
[4]. Munculnya strain baru yang resisten dari parasit
Plasmodium terhadap obat anti-malaria klasik, tetapi
khususnya terapi kombinasi berbasis artemisinin [11, 12],
membahayakan upaya internasional untuk memerangi
malaria dan meningkatkan kebutuhan akan pengembangan
terapi baru untuk mengatasi hal ini. infeksi. Di sini kami
melaporkan efek anti-malaria dari tamoxifen, obat yang telah
digunakan di seluruh dunia untuk pengobatan kanker
payudara selama lebih dari 30 tahun. Pengamatan kami
bahwa tamoxifen memiliki aktivitas yang kuat terhadap P.
falciparum in vitro dan menginduksi penurunan yang
signifikan dari pertumbuhan P. berghei pada tikus,
memposisikan obat ini sebagai kandidat yang
memungkinkan untuk pengembangan sebagai anti-malaria.
Data ini juga menunjukkan bahwa pasien yang memakai
tamoxifen untuk waktu yang lama, seperti yang sering
diresepkan untuk pencegahan kekambuhan atau pada
pasien berisiko tinggi yang diidentifikasi secara genetik,
dapat memberikan peningkatan perlindungan terhadap
malaria.
Tamoxifen juga aktif terhadap parasit protozoa lain,
Leishmania, dengan IC50 11 μM in vitro [13], yang mirip
dengan temuan ini untuk Plasmodium (16 μM). Tamoxifen
telah diusulkan sebagai mitra dalam terapi kombinasi obat
anti-Leishmania, karena meningkatkan efektivitas agen
klasik terhadap parasit ini pada tikus dengan leishmaniasis
[14, 15]. Selain itu, ditunjukkan bahwa Leishmania tidak
rentan untuk mengembangkan resistensi terhadap
tamoxifen, yang merupakan fitur penting untuk penyakit
seperti malaria dan leishmaniasis di mana resistensi obat
sering ditemukan di lapangan [16].
Dari semua kasus malaria, hanya 1% pasien yang menderita
malaria berat, penyakit yang mengancam jiwa [17].
Komplikasi yang paling umum dari malaria berat adalah
malaria serebral, gangguan pernapasan akut, anemia berat
dan cedera ginjal akut [18]. Pasien malaria berat dapat
dengan cepat memburuk, dan angka kematian dapat
melebihi 50% bahkan ketika pengobatan anti-malaria
diberikan [19]. Memajukan pemahaman patogenesis malaria
yang parah sangat penting untuk mengembangkan terapi
tambahan baru untuk mengobati komplikasi malaria yang
mematikan ini. Dalam pengertian itu, model malaria hewan
dari malaria berat manusia adalah kunci untuk penemuan
dasar, pengujian obat dan penelitian patogenesis [20].
Model malaria hewan pengerat telah menimbulkan beberapa
kritik di komunitas ilmuwan karena keterbatasan mereka
dalam mereproduksi penyakit manusia; Namun, mereka
telah memberikan wawasan kritis ke dalam mekanisme
pathophysiological mechanisms involved in severe
malaria [21]. This study shows that the susceptibility
of Plasmodium to tamoxifen would interfere with the
use of the Cre/loxP site-specifc recombination system
for the study of malaria since it interferes with the
levels of infection and prevents the development of
experimental cerebral malaria. Here is presented an
alternative protocol that can overcome this problem
by allowing the mice to clear tamoxifen levels during a
week after treatment. Since only 0.3% of tamoxifen
administered orally reaches the circulation, and blood
tamoxifen concentration decreases by ~ 90% at 7
days post administration in mice [22], it is expected
that the levels after 1 week would be negligible. It is
important to note that this protocol may not be
adequate when Cre recombination needs to occurs in
tissues with high turnover rates, such as epithelial
cells, since recombinant cells would reach the end of
their life span and be replaced before the end of the
week resting period.
Plasmodium blood-stage infection is confined to the
circulation and associated immune organs, which are
mostly constituted by cell types with low turnover
rates, such as endothelial [23], and leukocytes [24],
therefore, recombinant cells are expected to remain
functional in the tissues for sufcient amount of time to
complete a Plasmodium infection.
CONCLUSION
Tamoxifen and its active metabolite, 4-
hydroxytamoxifen, have antiplasmodial activity in vitro
and in vivo. Since tamoxifen is an inexpensive, well-
tolerated drug with an adequate safety profile,
development of this drug for use in anti-malarial
therapies may be warranted.
However, this anti-Plasmodiuma activity may also
jeopardize the use of the conditional mutagenic
Cre/LoxP system in the setting of rodent experimental
models of malaria.
As an alternative strategy, we propose administrating
tamoxifen for 1 week and keeping mice free of
tamoxifen for another week prior to infection and
after. With this approach, parasitaemia and cerebral
malaria signs can be restored to control levels. This
alternative strategy would be appropriate to
investigate specific gene function in tissues with a low
turnover, such as endothelium or glia.
patofisiologis yang terlibat dalam malaria parah [21]. Studi ini
menunjukkan bahwa kerentanan Plasmodium terhadap
tamoxifen akan mengganggu penggunaan sistem
rekombinasi situs Cre / loxP untuk studi malaria karena
mengganggu tingkat infeksi dan mencegah perkembangan
malaria serebral eksperimental. Berikut ini disajikan protokol
alternatif yang dapat mengatasi masalah ini dengan
memungkinkan tikus untuk membersihkan kadar tamoxifen
selama seminggu setelah perawatan. Karena hanya 0,3%
dari tamoxifen yang diberikan secara oral mencapai
sirkulasi, dan konsentrasi tamoxifen darah menurun ~ 90%
pada 7 hari setelah pemberian pada tikus [22], diharapkan
kadar setelah 1 minggu dapat diabaikan. Penting untuk
dicatat bahwa protokol ini mungkin tidak memadai ketika
rekombinasi Cre perlu terjadi pada jaringan dengan tingkat
turnover yang tinggi, seperti sel epitel, karena sel
rekombinan akan mencapai akhir rentang hidupnya dan
digantikan sebelum akhir minggu masa istirahat.
Infeksi tahap darah Plasmodium terbatas pada sirkulasi dan
organ-organ kekebalan tubuh yang terkait, yang sebagian
besar didasari oleh tipe sel dengan tingkat turnover rendah,
seperti endotel [23], dan leukosit [24], oleh karena itu, sel
rekombinan diharapkan tetap berfungsi dalam jaringan untuk
jumlah waktu yang cukup untuk menyelesaikan infeksi
Plasmodium.
KESIMPULAN
Tamoxifen dan metabolit aktifnya, 4-hydroxytamoxifen,
memiliki aktivitas antiplasmodial in vitro dan in vivo. Karena
tamoxifen adalah obat yang murah, dapat ditoleransi dengan
baik dengan profil keamanan yang memadai,
pengembangan obat ini untuk digunakan dalam terapi anti-
malaria mungkin diperlukan.
Namun, aktivitas anti-Plasmodiuma ini juga dapat
membahayakan penggunaan sistem Cre / LoxP mutagenik
bersyarat dalam pengaturan model eksperimental malaria
tikus.
Sebagai strategi alternatif, kami mengusulkan pemberian
tamoxifen selama 1 minggu dan menjaga tikus bebas dari
tamoxifen selama satu minggu sebelum infeksi dan
sesudahnya. Dengan pendekatan ini, tanda-tanda
parasitemia dan malaria serebral dapat dikembalikan ke
tingkat kontrol. Strategi alternatif ini akan sesuai untuk
menyelidiki fungsi gen spesifik dalam jaringan dengan
turnover rendah, seperti endotelium atau glia.
Fig. 1 Fig. 1
Determination of Tamoxifen antiplasmodial activity in Penentuan aktivitas antiplasmodial Tamoxifen in vitro.
vitro. Plasmodium falciparumcultures were incubated Plasmodium falciparumcultures diinkubasi dengan
with increasing doses of tamoxifen (a) or meningkatnya dosis tamoxifen (a) atau 4-hydroxytamoxifen
4‑hydroxytamoxifen (b) for 96 h. Parasite viability was (b) selama 96 jam. Viabilitas parasit diukur menggunakan
measured using SYBR Green fuorescence and the SYBR Green fuorescence dan konsentrasi penghambatan
half‑maximal inhibitory concentration (IC50) was setengah maksimal (IC50) dihitung untuk setiap obat. Hasil
calculated for each drug. Results show the average menunjukkan rata-rata dan standar deviasi dari penentuan
and standard deviation of triplicated determinations rangkap tiga untuk setiap konsentrasi
for each concentration
Fig. 2
Fig. 2 Metabolit aktif Tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen, menghambat
Tamoxifen active metabolite, 4‑hydroxytamoxifen, pertumbuhan P. falciparum intra-erythrocytic. Kultur
inhibits intra‑erythrocytic P. falciparum growth. Plasmodium falciparum disinkronkan pada tahap cincin /
Plasmodium falciparum cultures synchronized at trofozoit (a) atau schizont (b) pada awal percobaan
ring/trophozoite (a) or schizont (b) stages at the diinkubasi dengan kendaraan (DMSO 0,5%) sebagai kontrol
beginning of the experiment were incubated with (c), atau 4-hydroxytamoxifen (4-OH Tam) di 25 μM selama
vehicle (DMSO 0.5%) as a control (c), or 24 jam (a) atau 18 jam (b). Hasil kuantifikasi untuk tahap
4‑hydroxytamoxifen (4‑OH Tam) at 25 μM for 24 h (a) parasit pada 24 jam (a) atau 18 jam (b) setelah penambahan
or 18 h (b). Quantifcation results for parasite stages at tamoxifen menunjukkan rata-rata dan standar deviasi dari
24 h (a) or 18 h (b) after addition of tamoxifen show penentuan empat kali lipat untuk cincin / trofozoit (batang
average and standard deviation of quadruplicated putih), dan schizonts (batang abu-abu). Signifikansi statistik
determinations for rings/trophozoites (white bars), and dihitung menggunakan ANOVA 2 arah (**** p <0,0001), ns
schizonts (gray bars). Statistical signifcance was (tidak signifikan). Panel menunjukkan gambar parasit yang
calculated using 2‑way ANOVA (****p < 0.0001), ns representatif pada titik waktu yang ditunjukkan
(not signifcant). The panels show representative
images of parasites at the indicated time points Fig. 3
Tamoxifen memiliki aktivitas antiplasmodial in vivo dan
Fig. 3 menghambat eksperimental malaria serebral pada tikus.
Tamoxifen has antiplasmodial activity in vivo and Tikus CB57 / B6 diobati dengan tamoxifen 40 mg / kg per
inhibits experimental cerebral malaria in mice. hari 1 minggu sebelum infeksi P. bergheiANKA dan selama
CB57/B6 mice were treated with tamoxifen 40 mg/kg infeksi (kuadrat) versus kelompok kontrol yang tidak diobati
per day 1 week prior infection with P. bergheiANKA (lingkaran). Hewan yang diobati dengan tamoxifen
and during the course of the infection (squares) menunjukkan tingkat parasitaemia yang lebih rendah (a),
versus untreated control group (circles). Animals tanda-tanda neurologis malaria serebral yang lebih rendah
treated with tamoxifen exhibited lower parasitaemia (b) dan rasio kelangsungan hidup 100% setelah 7 hari pasca
levels (a), lower neurological signs of cerebral malaria infeksi (c) dibandingkan dengan kelompok kontrol.
(b) and a 100% survival ratio after 7 days Signifikansi statistik dihitung menggunakan uji t tidak
post‑infection (c) compared with control group. berpasangan (a, b) atau Log-rank
Statistical signifcance was calculated using an (Mantel – Cox) tes (c) (* p <0,05; *** p <0,01; **** p <0,0001)
unpaired t test (a, b) or Log‑rank
(Mantel–Cox) test (c) (*p < 0.05; ***p < 0.01; ****p < Fig. 4
0.0001) Strategi alternatif untuk mempelajari malaria serebral pada
model tikus yang memerlukan tamoxifen. Tikus CB57 / B6
Fig. 4 diobati dengan tamoxifen 40 mg / kg per hari satu minggu
Alternative strategy to study cerebral malaria in sebelum infeksi dengan 1 juta (lingkaran), 5 juta (kotak) atau
mouse models that require tamoxifen. CB57/B6 mice 20 juta (segitiga) sel darah merah yang terinfeksi P.
were treated with tamoxifen 40 mg/kg per day one bergheiANKA yang terinfeksi sel darah merah. Selama masa
week prior infection with 1 million (circles), 5 millions infeksi, hewan terus dirawat dengan tamoxifen dan tingkat
(squares) or 20 millions (triangles) P. bergheiANKA parasitaemia dipantau yang menunjukkan tidak ada
infected RBCs. During the course of the infection perbedaan di antara kelompok (a). Sebagai pendekatan
animals continued being treated with tamoxifen and alternatif untuk mempelajari malaria serebral pada model
parasitaemia levels were monitored showing no tikus yang memerlukan penggunaan tamoxifen, tikus CB57 /
diferences between groups (a). As an alternative B6 diacak menjadi 3 kelompok: kelompok kontrol tanpa
approach to study cerebral malaria in mouse models tamoxifen (lingkaran), diobati dengan tamoxifen selama 1
that require the use of tamoxifen, CB57/B6 mice were
randomized into 3 groups: control group without
tamoxifen (circles), treated with tamoxifen for 1 week
and then rested, without any further tamoxifen
treatment, for 1 week (squares) or 2 weeks (triangles)
before infection with 1 million P. bergheiinfected
RBCs. All groups developed comparable levels of
parasitaemia (b), developed neurological signs of
cerebral malaria (c) and did not difer in survival (d).
minggu dan kemudian beristirahat, tanpa tamoxifen lebih
lanjut pengobatan, selama 1 minggu (kotak) atau 2 minggu
(segitiga) sebelum infeksi dengan 1 juta sel darah merah
yang terinfeksi P. berghei. Semua kelompok
mengembangkan tingkat parasitaemia yang sebanding (b),
mengembangkan tanda-tanda neurologis malaria serebral
(c) dan tidak berbeda dalam kelangsungan hidup (d).