NAMA : Nadiah Atikah Della Putri

NIM : 15-01-01-066

Kelas : S1 B

Metode Uji Kadar Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi untuk Penentuan Lidokain pada Human Serum

Lidocaine (juga dikenal sebagai 2- (diethylamino) -N- (2,6-dimethylphenyl)

acetamide) umumnya digunakan sebagai obat anestesi lokal dan antiaritmia. Lidocaine
bukanlah obat baru, dan karenanya banyak metode tersedia untuk kuantitasi dalam spesimen
biologi. Metode yang tersedia luas, seperti GC-MS, UV, LC-MS/MS, FLURORESCENCE
OF DERIVATIVE. Pendekatan yang paling umum digunakan adalah dengan menggunakan
kromatografi cair kinerja tinggi fase balik untuk pemisahan, dan ultraviolet (UV) absorbansi
sebagai metode pendeteksian. Hal ini tidak mengherankan mengingat bahwa lidokain dengan
sendirinya memiliki sifat fluoresensi yang buruk, dan detektor UV umumnya Intraday,
akurasi dan ketepatan dari penetapan ditentukan dengan menggunakan berbagai konsentrasi
lidocaineHCl. Bahan yang digunakan adalah Lidocaine HCl (0,4% dalam dekstrosa 5% untuk
injeksi), Etil eter, asetonitril, air (semua HPLC grade), trietilamina, kalium fosfat (monobasic) dan
asam sulfat.
Uji ini divalidasi, umumnya menggunakan pedoman yang diterbitkan oleh EMA.
Kurva kalibrasi dihitung dengan menggunakan rasio tinggi puncak lidocaine HCl (rentang
konsentrasi dari 50 hingga 5000 ng / mL) untuk IS versus konsentrasi lidokain nominal.
Validasi intra-hari dinilai pada empat konsentrasi lidokain HCl berbeda (50, 250, 500 dan
2000 ng / mL) per hari dalam lima kali ulangan. Langkah ini diulang pada tiga hari terpisah
untuk penentuan validasi antar-hari. Untuk setiap operasi harian, satu set sampel kalibrasi
kurva independen disiapkan. Keakuratan dan ketepatan dinilai dengan menggunakan rata-rata
persentase kesalahan intra-dan antar-hari dan koefisien persen variasi (CV%), masing-
masing. Kurva kalibrasi tertimbang oleh faktor konsentrasi − 2 karena berbagai konsentrasi
(50-5000) yang digunakan dalam kurva kalibrasi.
Intraday, akurasi dan ketepatan dari penetapan ditentukan dengan menggunakan
berbagai konsentrasi lidocaine HCl. Konsentrasi yang dipilih adalah 50, 250, 500 dan 2000
ng / mL lidokain HCl dalam serum manusia. Setiap konsentrasi memiliki lima ulangan.
Untuk memungkinkan penilaian akurasi dan ketepatan interday dalam serum manusia,
pengujian diulang pada tiga hari yang terpisah. Untuk setiap operasi harian, satu set sampel
kalibrasi terpisah dari sampel validasi disiapkan untuk memungkinkan kuantifikasi puncak
rasio ketinggian lidokain menjadi IS. Presisi dinilai dengan koefisien persentase variasi
(CV%), sementara akurasi diwakili dengan menentukan kesalahan persentase intra-atau
antar-hari rata-rata.
Untuk kurva standar dan sampel validasi, serum diperoleh dari dua individu yang
sehat pada dua kesempatan terpisah. Untuk dua sampel, setiap individu diminta untuk tidak
mengkonsumsi makanan atau minuman yang mengandung kafein selama 24 jam sebelum
pengambilan sampel. Metode ini digunakan untuk menentukan konsentrasi lidocaine dalam
serum manusia dari satu pasien bedah setelah injeksi lidocaine sebagai reservoir di dalam
rektus selubung (200 mg dosis tunggal). Pasien diberikan persetujuan tertulis, dan penelitian
ini disetujui oleh Dewan Etika Penelitian Kesehatan Universitas Alberta. Setelah injeksi
dosis, sampel darah diambil secara seri.
Rata-rata pemulihan adalah 97,7 ± 21% dan 81,0 ± 2,4% untuk 50 dan 1000 ng / mL
lidocaine HCl dalam serum, masing-masing. Pengambilan ekstraksi rata-rata untuk IS pada
konsentrasi yang digunakan dalam pengujian adalah 55,4 ± 4,1%. Ada hubungan linier yang
sangat baik (> 0,9995) yang tercatat antara rasio tinggi puncak dan konsentrasi HCl lidokain
pada kisaran 50–5000 ng / mL serum. Dari analisis regresi konsentrasi vs rasio tinggi puncak
lidokain menjadi IS, rata-rata lereng dan intersepsi yang diamati adalah 0,00024 dan 0,0011,
masing-masing. Koefisien korelasi rata-rata regresi (r2) untuk kurva standar serum adalah
0,9995. CV penilaian intra dan inter-day kurang dari 15% . Kesalahan antar-hari rata-rata
dalam serum manusia kurang dari 9%.
Waktu retensi kromatografi adalah ~ 10 menit untuk lidokain dan 2,5 menit untuk IS.
Kromatografi menampilkan bentuk puncak simetris dan spesifisitas tinggi, dengan resolusi
dasar IS dan lidokain. Untuk kedua analit, ada tidak adanya gangguan dari komponen
endogen dalam serum. Perlu dicatat bahwa kromatogram dari serum sukarelawan sehat yang
digunakan dalam pengembangan uji memiliki presentasi puncak yang signifikan yang terelusi
sekitar 6,4 menit, yang tidak terlihat pada sampel serum pasien yang diperoleh pada 10 menit.
Namun, ini tidak mengganggu analisis lidokain, atau standar internal.
Dalam hal komposisi fase gerak, larutan asetonitril dan fosfat adalah komponen yang
paling umum di sebagian besar studi yang dilaporkan. Hanya Tam et al. dan Qin dkk.
melengkapi fase gerak dengan 0,15% dan 0,16% dari trietilamina (TEA), masing-masing
[7,9], sementara Chen et al. memasok fase gerak dengan 1% dietilamina. Dalam metode saat
ini, 0,15% dari trietilamina ditambahkan karena meningkatkan simetri puncak dan
mengurangi tailing puncak dari senyawa yang menarik, seperti yang telah dicatat untuk
senyawa lain [19,20]. Dari literatur, waktu retensi untuk senyawa bunga berkisar dari 3,6
hingga kurang dari 13 menit. Kehadiran puncak pada 6,4 menit terlihat pada kromatogram
HPLC-UV serum manusia kosong (bebas obat). Sayangnya, penampilan puncak ini dalam
serum kosong.
Sistem kromatografi terdiri dari pompa air sistem pengiriman multi-pelarut Waters
(Milford, MA, USA) 600 E, autosampler dengan katup injeksi variabel (Waters 717), dan
detektor absorbansi merable UV-visible (Waters 486). Kromatogram direkam menggunakan
perangkat lunak EZStart (Perangkat Lunak Ilmiah, Pleasanton, CA, USA) dalam sistem
komputer berbasis Windows untuk pengumpulan dan pemrosesan data. Pemisahan
kromatografi lidocaine dan procainamide (standar internal) dicapai menggunakan 150 × 4,6
mm id, ukuran partikel 3,5 μm Alltima C18-kolom (Alltech, Deerfield, IL, USA) yang
melekat pada kolom pra-penjaga (Grace Alltech All-GuardTM Guard Cartridges, 7,5 mm 5
μm, Deerfield, IL, USA). Fase gerak terdiri dari campuran larutan asetonitril dan fosfat (25
mM KH2PO4-3 mM asam sulfat-3,6 mM trietilamina) dalam rasio 12:88 (v / v). Fase gerak
direduksi sebelum digunakan dengan menyaringnya di bawah tekanan vakum melalui 0,45
μm filter nilon ukuran pori, kemudian dipompa pada laju alir 0,9 mL / menit pada suhu
kamar. Segera setelah injeksi, panjang gelombang deteksi UV ditetapkan pada 277 nm (UV
Maksimum untuk procainamide). Pada 4 menit setelah injeksi, detektor UV diprogram untuk
beralih ke panjang gelombang 210 nm (UV maksimum untuk lidokain). Total waktu proses
analitis adalah <13 menit.