TUGAS TEKNOLOGI EVALUASI BIOAKTIVITAS

TENTANG

TURUNAN ASAM URSOLAT SEBAGAI AGEN ANTIDIABETIK POTENSIAL: IN

VITRO, IN VIVO, DAN IN SILICO

OLEH :
NAMA : SILVIA INDRIYATI
NO. BP : 1701155
KELAS : VII D

DOSEN PENGAMPU : FITRAH FAUZIAH, M. Farm, Apt

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI

(STIFARM)
PADANG TAHUN 2019
 TURUNAN ASAM URSOLAT SEBAGAI AGEN ANTIDIABETIK
POTENSIAL: IN VITRO, IN VIVO, DAN IN SILICO

Abstrak
Protein tirosin fosfatase 1B (PTP-1B) telah menarik minat sebagai target baru untuk

pengobatan diabetes tipe 2, ini karena perannya dalam jalur pensinyalan insulin sebagai

regulator negatif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan tujuh turunan asam

ursolat sebagai agen antidiabetik potensial dengan penghambatan PTP-1B sebagai

mekanisme aksi utama. Selanjutnya, derivatif 1-7 diajukan in vitro untuk menghambat PTP-

1B enzimatik menjadi 3, 5, dan 7 senyawa yang paling aktif (IC50 5 5,6, 4,7, dan 4,6 lM,

masing-masing). Selain itu, hasilnya dikuatkan dengan studi docking silico dengan PTP-1B

situs ortosterik A dan situs ikat diperpanjang B, menunjukkan bahwa 3 memiliki kutub dan

Van der Waals interaksi di kedua situs dengan Lys120, Tyr46, Ser216, Ala217, Ile219,

Asp181, Phe182, Gln262, Val49, Met258, dan Gly259, menunjukkan nilai skor docking

27,48 Kkal / mol, menjadi lebih spesifik untuk situs A. Selain itu, senyawa 7 menunjukkan

interaksi kutub dengan interaksi Gln262 dan Van der Waals dengan Ala217, Phe182, Ile219,

Arg45, Tyr46, Arg47, Asp48, dan Val49 dengan docking prediktif skor 26,43 kkal / mol,

menunjukkan bahwa situs pengikatan potensial dapat dilokalisasi di situs B berdekatan

dengan situs katalitik A. Akhirnya, turunan 2 dan 7 (50 mg / kg) dipilih untuk dibuat efek

antidiabetik in vivo mereka menggunakan model tikus diabetes yang tidak tergantung insulin,

menunjukkan penurunan glukosa darah yang signifikan dibandingkan dengan kelompok

kontrol (p <0,05).
 PENDAHULUAN

Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, penyakit degeneratif kronis merupakan

penyebab utama kematian di dunia. Diabetes adalah penyakit metabolik, yang ditandai

dengan gangguan regulasi glukosa, dan tambahannya, lipid dan protein (Mahapatra,

Asati, & Bharti, 2015). Ini dikarenakan insulin tidak mampu menjalankan fungsinya

sebagai pengatur metabolisme utama dalam jaringan perifer, karena kurangnya insulin

(diabetes tipe 1) atau karena resistensi terhadap aksi insulin dan / atau gangguan sekresi

insulin (diabetes tipe 2). Diabetes meningkatkan risiko untuk mengembangkan

komplikasi mikro dan makrovaskuler seperti neuropati, nefropati dan retinopati, yang

memicu konsekuensi seperti penyakit kardiovaskular (infark miokard, stroke, antara

lain), kebutaan, amputasi ekstremitas, dan penyakit ginjal stadium akhir. Selain itu,

diabetes telah dikaitkan dengan penyakit sistem saraf pusat seperti gangguan depresi dan

kognisi.

Meskipun ketersediaan obat untuk pengobatan diabetes banyak dari mereka gagal

karena dua alasan yaitu :

(a) Banyak obat menyebabkan beragam efek samping, yaitu: hipoglikemia, edema,

penambahan berat badan, peningkatan risiko kardiovaskular, yang dapat

membatasi penggunaannya untuk pasien;

(b) Perbaikan dalam kontrol glikemia tidak terus menerus, karena fitur degeneratif

terkait dengan penyakit tersebut, dengan demikian perlu dilakukan peningkatan

dosis obat yang digunakan atau terapi kombinatorial diperlukan untuk

meningkatkan kontrol.

Dengan demikian, saat ini perlu untuk mengembangkan obat baru atau

mendapatkan obat baru yang bertindak pada target baru. Dalam konteks ini, protein tirosin
fosfatase 1B (PTP-1B) baru-baru ini menunjukkan pengaruh penting terhadap sensitivitas

insulin, karena itu terlibat dalam memodulasi transduksi sinyal insulin menjadi kunci

regulator aktivitas reseptor insulin, dan jalur pensinyalan hilir. Ini terkait dengan

adefosforilasi reseptor insulin aktif (IR). Juga, PTP-1B terlibat dalam regulasi reseptor leptin,

yang terlibat dalam asupan makanan peraturan oleh CNS. PTP-1B adalah sebuah enzim yang

terbentuk oleh 435 residu asam amino, yang berlabuh ke wajah sitoplasma retikulum

endoplasma dan menyajikan dua wilayah penting, situs A (katalitik) dan B (diperpanjang

mengikat volume). Situs A dibentuk oleh residu 214–221 dan mengkatalisis defosforilasi

residu tirosin arilfosfat. Wilayah kedua (situs B), adalah situs pengikatan yang diperluas

tetapi wilayah tidak aktif di sebelah situs A, yang hanya mengikat pada gugus arilfosfat.

Kemudian, penghambatan PTP-1B bisa menjadi target yang sangat penting untuk

mengembangkan obat antidiabetik baru. Ada beberapa senyawa sintetis dan turunan alami

yang digambarkan sebagai PTP-1B inhibitor.

Produk alami merupakan sumber yang bagus untuk dipelajari dan dikembangkan

kandidat obat baru untuk pengobatan diabetes. Asam ursolat (UA) adalah triterpen yang

telah ditunjukkan pada metabolisme, kardiovaskular, antibakteri, antijamur, sitotoksik,

antidepresan, efek antioksidan dan antiaterogenik. Saat ini, diketahui bahwa efek antidiabetik

asam ursolat dimediasi oleh interaksinya dengan target yang berbeda. UA bertindak sebagai

insulinomimetic, meningkatkan autofosforilasi dan aktivasi reseptor insulin, dan juga

menghasilkan insulin sensitizer karena mampu menghambat enzim PTP-1B . Laporan terbaru

menunjukkan bahwa UA menambah GLUT4 sebagai hasil dari peningkatan konsentrasi Ca21

intraseluler, yang menambah pergerakan dan translokasi transporter GLUT4 ke membran.

UA langsung lainnya dan mekanisme antidiabetes tidak langsung adalah penghambatan

enzim: 11bHSD1 , glikogen fosforilase, alfa-glucosidase dan aldose reductase. Dengan

demikian, tujuan dari penelitian saat ini adalah untuk mensintesis turunan UA baru secara
berurutan untuk menemukan senyawa bioaktif antidiabetes yang lebih kuat, spesifik dan

efektif.

1. Uji Antidiabetes dengan Mekanisme Inhibisi PTP-1B secara in vivo

 Hewan Percobaan : Tikus CD1 jantan dengan berat 30-40 g ditempatkan di kondisi
laboratorium standar dan diberi pakan pelet tikus dan air ad libitum. Mereka

dipertahankan pada suhu kamar dan fotoperiode siklus 12 jam sehari / malam. Hewan

yang dipuasakan makan dan dibiarkan selama 16 jam tetapi dibiarkan minum.

Prosedur semua hewan dilakukan sesuai dengan Peraturan Federal untuk Hewan

Eksperimen dan Perawatan (SAGARPA, NOM-062-ZOO-1999 .

Tikus diabetes puasa dibagi menjadi kelompok 6 hewan masing-masing. Tiap

kelompok diberikan secara oral suspensi senyawa 2 dan 7 disiapkan dalam Tween 80

10% (50 mg / kg). Glibenclamide digunakan sebagai obat referensi hipoglikemik (3

mg / kg). Kelompok kontrol diberikan Tween 80 10%. Konsentrasi glukosa

ditentukan dari tikus ekor pada 0, 1, 3, 5, dan 7 jam setelah pemberian dengan

glukometer. Persentase glikemia dihitung dengan membandingkan glikemia waktu

yang dipilih (Gx) dengan nilai awal (G0) menggunakan rumus:

% Variasi glikemia 5 [(Gx - G0) / G0]

3 100.
Semua nilai dinyatakan sebagai rata-rata 6 SEM. Signifikansi statistik diperkirakan

dengan analisis varians (ANOVA), p <0,05 dan p <0,01 menyatakan signifikansi.

 Induksi : Induksi model NIDDM

Streptozotocin (STZ) dilarutkan dalam buffer sitrat (pH 4,5), dan nikotinamid
(NAD) dilarutkan secara normal larutan garam fisiologis. NIDDM diinduksi pada
tikus yang berpuasa semalaman dengan injeksi STZ intraperitoneal tunggal (100
mg / kg), 15 menit setelah i.p. pemberian NAD (40 mg / kg). Setelah 10 hari
setelah diberikan STZ , kadar glukosa darah pada masing-masing tikus ditentukan.
Tikus dengan glikemia > 140 mg / dL dianggap diabetes.

 Hasil
Berdasarkan nilai ICP PTP-1B dan pola penghambatan, senyawa 2 dan 7
dipilih untuk dievaluasi melalui evaluasi akut, pada model tikus diabetes
noninsulin eksperimental. Senyawa 7 dipilih karena nilai LC50 yang kuat dan
pola penghambat PTP-1B nya lengkap, sementara senyawa 2 diuji sampai
penghambatan PTP-1B dimoderasi, untuk membuktikan potensi korelasi
antara percobaan in vitro dan in vivo.
Pemberian akut 50 mg / kg senyawa7 menunjukkan signifikan penurunan
variasi glikemia (p <0,05) dari jam pertama, dan efek ini dipertahankan hingga
akhir pengujian (7 jam). Efek hipoglikemik lebih dari 70% ini mirip dengan
obat kontrol glibenclamide, dan lebih baik dari senyawa induk UA. Sementara
itu, senyawa 2 tidak menunjukkan efek signifikan dalam 3 jam pertama
pengujian kadar logam. Namun, efek hipoglikemik yang penting telah
ditentukan setelah jam kelima dan sampai akhir percobaan, mencapai nilai
efek hipoglikemik sekitar 55%.

Dari hasil ini, kami menyimpulkan bahwa derivatif senyawa 7 menunjukkan

efek hipoglikemik akut secara in vivo yang lebih baik dibandingkan dengan
senyawa 2. Pengamatan ini dapat dijelaskan oleh dua poin:

(1) Nilai LC50 senyawa7 adalah lebih rendah dari 2, yang berarti potensi dan
penghambatan PTP-1B yang lebih baik oleh senyawa 7, dan karena itu
sensibilitas yang lebih baik terhadap aksi insulin dalam hewan yang
diperlakukan sesuai
(2) Diusulkan bahwa senyawa 2 adalah prodrug, itu sebabnya kami
menyebutkan bahwa efek yang tertunda (mis., setelah 3 jam pemberian
efek diamati) dapat disebabkan jika 2 bertindak sebagai seorang prodrug,
ini karena setelah metabolisme itu dapat diubah menjadi UA, dan
kemudian UA memberikan aksi antidiabetiknya; Namun, kami belum
 mengeksplorasi kemungkinan itu. Pendekatan serupa telah dilaporkan
dengan senyawa yang berbeda . ini Penting untuk menunjukkan bahwa
kedua senyawa memiliki pola yang lebih baik senyawa induk UA, dan
efek hipoglikemik yang buruk ini Model NIDDM bisa jadi disebabkan
oleh penyerapan usus yang buruk.

2. Uji Antidiabetes dengan Mekanisme Inhibisi PTP-1B secara in vitro

Pengujian dilakukan pada suhu 378oC. Substrat (pNPP) dilarutkan dalam

0,075 M dari b, b-dimetil glutarat pH 7,0 buffer yang mengandung 1 mM EDTA

dan 1 mM dithiothreitol. Volume akhir adalah 1 mL. Reaksi dimulai dengan

menambahkan alikuot enzim dan dengan KOH 0,1M (4 mL) pada saat terakhir.

P-nitrophenolate diukur absorbansi nya pada 400 nm. Untuk memverifikasi

apakah senyawa adalah inhibitor reversibel, alikuot PTP-1B diinkubasi

sedikitnya 25 kali lipat molar inhibitor selama 1 jam pada suhu 378oC.

Percobaan kontrol dilakukan dengan menambahkan DMSO tanpa inhibitor.

Setelah waktu interval ini, larutan enzim diencerkan 400 kali lipat dan aktivitas

enzim residu bisa diuji.

Enzim PTP-1B manusia dimurnikan sebagai protein fusi dari garis sel

bakteri. Urutan lengkap PTP-1B dikloning di pGEX-2T vektor ekspresi bakteri

hilir urutan GST, dan vektor ini digunakan untuk mengubah E. coli menjadi

strain TB1. Protein fusi rekombinan dimurnikan dari lisat bakteri menggunakan

alat kromatografi afinitas pada glutathione-agarose. Larutan dengan protein fusi

diperlakukan dengan trombin selama 3 jam pada suhu 378oC. Kemudian

fosfatase aktif dimurnikan dari GST dan trombin oleh filtrasi gel pada kolom

Superdex G75. Kemurnian enzim ditentukan oleh SDS-PAGE.

 3. Uji Antidiabetes dengan Mekanisme Inhibisi PTP-1B secara in silico

Untuk mengetahui cara mengikat senyawa 1-7 dengan PTP-1B, dapat diamati dari

struktur mereka merapat dengan kristalografi struktur PTP-1B manusia, yang diperoleh dari

Data Protein Bank (kode akses 1C83). Sebelum memasang derivatif UA, protokol divalidasi

dengan memprediksi mode pengikatan asam 6- (oxalylamino) -1H-indole-5-karboksilat,

inhibitor kompetitif PTP-1B.

Gambar 4 menunjukkan perbandingan antara mode pengikatan ligan kristalografi

dan mode yang diprediksi oleh AutoDock. Angka ini jelas menunjukkan bahwa AutoDock

berhasil memprediksi mode pengikatan ligan kristalografi dengan root-mean square deviation

(RMSD) dari 0,33 Å. Energi Binding yang Diprediksi, Ki, dan situs yang mengikat

ditentukan oleh AutoDock untuk tujuh senyawa dirangkum dalam Tabel 3. Dapat dilihat,

senyawa 3 dan 5 menunjukkan D8G dan KIyang lebih baik dihitung, yang jelas berkorelasi

dengan lokasi pengikatannya yang merupakan situs katalitik. Selain itu, baik 3 dan 5 adalah

dua dari tiga yang paling in vitro senyawa aktif dari seluruh rangkaian. Karena itu, ada

korelasi penting antara interaksi prediksi docking dengan di aktivitas penghambatan vitro

pada PTP-1B. Dalam konteks ini, senyawa yang tersisa berinteraksi dengan situs pengikatan

B yang diperluas, dan D8G dan KI dihitung kurang dari senyawa paling aktif 3 dan 5,

selanjutnya, aktivitas penghambatan in vitro ditunjukkan oleh 1, 2, 4, dan 6 yaitu lebih lemah

atau tidak aktif.

Senyawa 1-7 merapat dengan struktur kristalografi PTP-1B diperoleh dari resolusi Protein

Data Bank (PDB kode 1C83) GUZMAN- AVILA ET AL. | 73 dari 1.8, dan terkristalisasi

bersama dengan 6- (oxalylamino) -1H-indole-5-karboksilat AC id. Studi docking

dikembangkan dengan memilih situs A dan B, digambarkan sebagai daerah penting untuk

penghambatan PTP-1B (Ramirez-Espinosa et al., 2011). Situs A atau situs katalitik sesuai
dengan Asp181, Cys215, dan Arg221, juga Lys120, Ser216, Phe182, Gly220, semuanya

adalah residu penting untuk interaksi; sementara itu wilayah B atau

situs pengikatan diperpanjang terdiri dari Arg24, Arg254, Gln262, Tyr46, Asp48, Val49,

Ile219, dan Met258 dan Gly259, menunjukkan nilai skor docking 27,48 kkal / mol, lebih

spesifik untuk situs B, menjelaskan penghambatan irreversible dari PTP-1B.

 KESIMPULAN

Dari tujuh turunan semisintetik asam ursolat, enam senyawa disiapkan dengan
metode sintesis dengan bantuan gelombang mikro, yang diharapkan untuk
meningkatkan waktu reaksi meskipun hasil bervariasi. Senyawa 3, 5, dan 7
menunjukkan aktivitas penghambatan yang signifikan pada enzim PTP-1B secara
reversibel. Senyawa yang paling aktif adalah 7 menunjukkan efek penting pada in
vitro dan in vivo. Selanjutnya, asetil dan ester crotonyl adalah turunan paling aktif
melalui studi in vitro. Namun, percobaan lebih lanjut diperlukan untuk menentukan
efek in vivo untuk senyawa ini. Studi docking molekuler menunjukkan bahwa turunan
asetil dan crotonyl memiliki skor pengikatan yang lebih baik dibandingkan dengan
senyawa induk, asam ursolat.