Cloning and in situ hybridization analysis of the expression of

polysialyltransferase mRNA in the developing and adult rat brain

LATAR BELAKANG
Penambahan asam polisialat, (PSA, polimer linier dari asam N-asetilneuramin dalam α-2,8-
linkage) pada domain ekstraseluler dari Molekul adhesi sel neural (NCAM), juga disebut CD56,
adalah glikoprotein pengikat homofilik yang diekspresikan pada permukaan neuron, glia, dan otot
rangka. Meskipun CD56 sering dianggap sebagai penanda komitmen garis keturunan saraf karena
situs penemuannya. Interaksi sel-sel NCAM atteneus polysialylated, sementara memfasilitasi
migrasi neuron, defasikulasi aksonal dan percabangan aksonal selama embriogenesis. Oleh karena
itu, polisialilasi ncam adalah proses yang diatur secara perkembangan, dengan level tertinggi PSA-
NCAM yang terjadi di otak embriogenik.
Beberapa penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa, selain memainkan peran dalam
pengembangan saraf awal, PSA-NCAM sangat penting dalam plastisitas struktural otak orang
dewasa di mana ia terus diekspresikan oleh pemrosesan informasi sensorik dan plastisitas neuron.
Meskipun sangat penting dari polisialilasasi NCAM, mekanisme tepatnya tidak dipahami dengan
baik. Baru-baru ini, dua gen berbeda yang mengkode enzim α-2,8-sialat aktivitas polimerisasi
asam in vitro dan sintesis PSA-NCAM in vivo telah dikloning. Para anggota family gen
polysialyltransferase pertama , yang disebut STX atau ST8Sia II yang 99% homolog telah
dikloning, masing-masing, dari otak tikus dan tubuh tikus itu sendiri, telah dilaporkan hanya
diekspresikan dalam otak tikus yang baru lahir. CDNA dari enzim lain yang mampu
menambahkan PSA ke NCAM pertama kali dikloning dari sel-sel ovarium hamster Cina yang
disebut polysialyltransferase-1 atau PST-1, dan kemudian dari otak manusia disebut PST dan paru-
paru tikus disebut ST8Sia IV. Enzim ini tampaknya menjadi spesies homolog yang identitasnya
97-98% pada kadar asam amino dan merupakan family polisialiltransferase berbeda dari
STXrST8Sia II. Transkrip hamster PST-1 dan PST manusia diekspresikan dalam otak bayi baru
lahir dan juga pada jaringan perifer baru lahir dan dewasa, dan studi fungsional dari kedua enzim
telah mengungkapkan bahwa keduanya mampu memulai dan mempolimerisasi dengan langkah-
langkah sintesis PSA. Namun, hasil yang diperoleh untuk tikus ST8Sia IV, yang berasal dari
family PST, menunjukkan bahwa ia lebih kuat diekspresikan dalam jaringan perifer daripada di
otak, dan bahwa ekspresinya adalah tidak diatur secara regular dalam perkembangan.
Untuk memahami ekspresi perkembangan PST, pemain kunci potensial dalam regulasi level PSA-
NCAM, kami telah menyelidiki ekspresi spasial dan temporal dari mRNA PST di otak tikus.
Memanfaatkan tingkat tinggi konservasi spesies dalam urutan cDNA kloning PST, kami
menggunakan we terbalik transcription-polymerase chain reaction RT-PCR strategi untuk
mengkloning cDNA dari otak tikus PST untuk merancang probe untuk mempelajari ekspresi
mRNA. Dengan Northern blot, PCR dan histokimia hibridisasi in situ, kami menyajikan bukti
bahwa transkrip PST tikus lebih banyak diekspresikan dalam embrionik daripada otak orang
dewasa, dan bahwa mRNA PST diatur secara perkembangan dengan cara spesifik regional.
TUJUAN
Polysialyltransferase PST adalah enzim yang mengkatalisis penambahan asam polisialat PSA,
suatu homopolimer darisialic α-2,8-linked. residu asam, ke molekul adhesi sel saraf NCAM.
Ekspresi PSA-NCAM di otak diatur secara regular dan berkembang dan sangat penting; Namun,
ekspresi perkembangan temporal dan spasial PST otak, pemain kunci potensial dalam kontrol level
PSA-NCAM, masih belum jelas. Dalam penelitian ini, peneliti telah mengkloning wilayah
pengkodean cDNA PST tikus dengan reaksi berantai transkripsi-polimerase terbalik,
menggunakan primer berdasarkan urutan cDNA hamster PST-1. Sebuah oligonukleotida 39-mer
komplementer untuk tikus PST cDNA disintesis untuk menyelidiki distribusi mRNA-nya di otak
tikus dewasa dan berkembang oleh Northern blot/bercak Northern dan hibridisasi in situ.

MATERIAL DAN METODE

Hewan-hewan dan persiapan jaringan
Tikus yang dipakai dalam penelitian adalah Sprague-Dawley hamil dan tikus Sprague Dawley
jantan dewasa. Hewan-hewan ini dikondisikan atau du tempatkan secara individual (hewan yang
hamil) atau ditempatkan 3 tikus per kandang dalam sebuah suhu dan kelembapan yang terkontrol,
pada ruangan dengan lingkup terpapar cahaya selama 12 jam dan terpapar gelap selama 12 jam
juga dengan akses mendapat makanan dan minum secara bebas. Periode perkembangan yang
dipilih untuk penelitian ini adalah hari embrionik ke-15 (E15), hari embrionik ke-18 (E18), hari
ke-1 pascakelahiran (PD1), hari ke-14 pascakelahiran (PD14), hari ke-21 pascakelahiran (PD21)
dan dewasa (berusia 3 bulan). Semua prosedur hewan yang dijelaskan dalam penelitian ini
sebelumnya telah disetujui oleh McGill University Animal Care Committee in accordance with
the guidelines of the Canadian Council for Animal Care.
Tikus dikorbankan dengan pemenggalan kepala yang cepat, otak dengan cepat diangkat,
dibekukan dalam bak es isopentana atau kering dan disimpan pada suhu 80ᵒ C sampai dipotong.
Untuk mempersiapkan RNA total, hippocampi dibedah dan disimpan pada 80ᵒ C. Embrio
dikeluarkan satu per satu dan dibedah bebas dari membran ketuban dan disimpan pada suhu 80ᵒC.

Riset/Pemeriksaan/ Penyelidikan
Untuk Northern blotting dan uji hibidrisasi in situ, sebuah 39-mer oligonukleotida yang sesuai
dengan 379-X nukleotida tikus PST cDNA 5 -ATC TCC GAT GAG GG TTG CGT. CTC TTG
GTG CTC CTC AGT TCT disintesis dan dimurnikan. Oligonukleotida komplementer dengan
urutan yang sama juga disintesis sebagai kontrol. Oligonucleotides diberi label dengan α-S dATP
atau α-P dATP pada 3-end menggunakan terminal dan dimurnikan oleh NACS. Primer PCR yang
digunakan untuk memperkuat tikus PST cDNA dipilih dari hamster PST-1 dengan urutan: 5-ACC
CAA GAT GCG CTC CAT TAG (pangkal) dan 5 -TTA TTG CTT CAT GCA CTT CCC (ujung).
Primer pangkal dan ujung mengapit inisiasi ATG dan kodon terminasi TAA, masing-masing, dan
dirancang untuk memperkuat urutan pengkodean lengkap PST tikus. Akhirnya, primer reseptor
dopamin D2 adalah yang digunakan.
RT-PCR
RNA yangberasal dari Embrio ke-15 (E15) dan otak tikus dewasa yang diisolasi dan mendapat
obat dengan DNA (Promega) sebelum digunakan dalam reaksi reverse transcriptase 1 µg dari RNA
total adalah Produk reverse-transkrip diamplifikasi dalam pengendara sepeda suhu menggunakan
0,4 µg primer PCR yang disebutkan sebelumnya dan 2,5 U dari Taq DNA polimerase (Promega).
Setelah pemberian denaturasi inisial pada suhu 92ᵒC selama 5 menit, amplifikasi dilakukan sealam
35 siklus pada suhu-suhu berikut: 92ᵒC selama 1 menit denaturasi, 56ᵒC selama 1 menit (annealing)
dan 72ᵒC selama 1 menit apmlifikasi. Produk PCR kemudian dielektroforesis pada gel agarosa
1,5% selama 1,3 jam pada 100 V. Gel diwarnai dalam etidium bromida 1 µg/ml selama sepuluh
menit dan kemudian dicuci dalam air selama 2 jam. Pada langkah terakhir, gel itu difoto
menggunakan kamera Polaroid.

Southern blotting/bercak southern

Gel dengan DNA yang diperkuat RT-PCR adalah Southern blotted dalam membrane Nytran
menurut prosedur dari Sambrook et al. Singkatnya, DNA didenaturasi dengan merendam gel
dalam 1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH selama 15 menit, yang dinetralkan dengan 1 M Tris, 1,5 M NaCl
selama 30 menit. Kemudian menggunakan aksi kapiler, DNA dipindahkan ke membran Nytran
dan kemudian difiksasi dengan di panggang pada suhu 80ᵒC selama 1 jam. Blot/ bercak kemudian
diinkubasi dalam pra-hibridisasi buffer (5 X SSC, 2 X Denhardt’s, 1,0% SDS, 100 µg/ml. DNA
sperma salmon (Promega) dan 50 µg/ml ragi tRNA (Promega). Kemudian 100 Ldari probe PST
berlabel P (0,5 10 6 cpm/µl) ditambahkan ke buffer pra-hibridisasi. Blot/Bercak diinkubasi pada
42ᵒC semalaman, diikuti oleh pencucian dan eksposur ke X-Omat film.

Kloning
Fragmen PCR yang diekstraksi diikat ke pGEM-T vektor (Promega) dalam kondisi yang
ditentukan oleh peneliti. Sel-sel DH5-alpha yang kompeten ditransformasikan oleh plasmid
rekombinan menggunakan elektroporasi dan sel-sel tersebut dipilih pada pelat 2YT-agar-
ampisilin. 100 µg/ml. Koloni yang terisolasi diambil secara acak dan disaring untuk dimasukkan
dengan polymerase chain reaction. Penyisipan dalam plasmid rekombinan diurutkan secara
keseluruhan menggunakan T7 DNA polymerase Sequencing Kit (Pharmacia).
Northern blot/Bercak Northern
Total RNA dari hippocampus diisolasi menggunakan reagen Trizol. 7 µg dari total RNA yang
dielektroforesis pada gel agarose formaldehida 1,2% dan dipindahkan dengan pembekuan kapiler
selama semalaman pada membran Nytran dalam 20 X SSC. Blot atau bercak dibakar pada suhu
80ᵒC selama 3 jam. Setelah pra-hibridisasi selama 3 jam pada suhu 42ᵒC dalam 5 X SSC, 2 X
Solusi Denhardt (Promega), 10% dekstran sulfat, 0.1% SDS, 100 µg/ml DNA sperma salmon
(Promega). Dan 50 µg/ml ragi tRNA Promega, blots/bercak-bercak hibridisasi semalaman pada
suhu 42ᵒC dalam larutan hibridisasi. dengan P-probe berlabel P dATP 1X10 cpm/ml. Lalu bercak
dicuci 4 X 30 menit pada suhu kamar dengan 2 X SSC, 0,1% SDS diikuti oleh 2X30 menit dengan
0,1 X SSC, 0,1% SDS pada suhu 42ᵒC dan terpapar film Kodak XAR di suhu -80ᵒC dengan layar
yang diperkuat.

In situ Hibridisasi
Bagian sagital 16 µm dipotong pada Micron cryostat pada suhu -22ᵒC, dicairkan pada poly lysine
slide dan disimpan pada suhu 80ᵒC sampai digunakan. Hibridisasi in situ dilakukan pada dasarnya
sesuai dengan yang telah dibahas dan dijelaskan oleh peneliti sebelumnya. Singkatnya, bagian ini
diperbaiki dalam 4% paraformaldehyde. Kemudian, setelah asetilasi trietanolamin dan asetat.
anhidrida dan defatting (memindahkan lemak dari makanan), bagian diinkubasi dengan 100 µl
campuran hibridisasi yang mengandung α-35S probe oligonukleotida berlabel 3X105 cpm, 5 X
SSC, 50% formamida, 2 X larutan Denhardt, 10 % dekstran sulfat, 100 µg/ml DNA sperma salmon
dan 50 µg/ml ragi tRNA pada suhu 42ᵒC selama 16-18 jam dalam kotak yang lembab. Lalu
semuanya dicuci selama 4 X 30 menit dalam 2 X SSC pada suhu kamar, selama 2 X 30 menit
dalam 0,1 X SSC pada 45ᵒC dan akhirnya 1 X 15 menit dalam 0,1 X SSC pada suhu kamar. Setelah
pembilasan singkat dalam etanol yang mengandung 0,3 amonium asetat pH 7.0, bagian-bagian
tersebut dikeringkan dengan udara dan ditambahkan ke Hyperfilm β-max selama 4 minggu pada
suhu kamar. Autoradiogram dianalisis untuk mengukur kepadatan optik pada penganalisa gambar.
Duplikat dari bagian hibridisasi dicelupkan ke dalam emulsi Hypercoat. Emulsi dikembangkan
setelah 9 minggu di Kodak D-19 dan bagian yang diwarnai dengan Cresyl violet. Lokalisasi seluler
mRNA PST dan tingkat ekspresinya dievaluasi dengan memeriksa lokasi butir perak di bawah
mikroskop lapang gelap.

Hasil
Elektroforesis gel produk RT-PCR yang dihasilkan dari otak tikus embrionik serta hippocampus,
bohlam penciuman, korteks frontal, striatum dan otak kecil tikus dewasa, menggunakan probe
yang dibangun, menghasilkan pita tunggal pada f1100 bp, yang hampir identik untuk ukuran
wilayah pengkodean hamster PST-1. Lebih jauh lagi, Southern blotting dari produk PCR
mengungkapkan bahwa setiap band adalah cDNA PST tikus karena diberi label dengan probe PST.
Subkloning dan pengurutan pita DNA PST RT-PCR yang diamplifikasi mengungkapkan kerangka
bacaan terbuka 1077 nukleotida yang masing-masing 98, 97 dan 98% homolog dengan cDNA
hamster, manusia dan tikus PST. PST tikus dengan demikian nampaknya merupakan spesies
homolog dari PST yang dikloning sebelumnya, yang mengandung 359 asam amino, yang
mencakup motif S dan L sialyl serta domain penahan signalrmembran dari keluarga sialyl
transferase.
Northern blots/bercak Northern menggunakan RNA dari E18 hippocampus, PD1 hippocampus
dan hippocampus tikus dewasa menunjukkan transkrip utama dari 5 kb, pada beberapa bercak pita
yang sangat lemah dari 3 kb, bagaimanapun, kadang-kadang. terlihat. Pita 5-kb utama tampaknya
adalah mRNA PST tikus karena juga dapat dibandingkan dengan ukuran transkrip PST hamster
dan tikus yang berkisar antara 5 hingga 5,2 kb. Di antara tahap perkembangan, hippocampus tikus
E18 menunjukkan jumlah tertinggi mRNA PST, sedangkan hippocampus dewasa menunjukkan
jumlah terendah.
Distribusi mRNA PST di otak tikus diperiksa dengan hibridisasi in situ di bagian sagital hewan
berkembang dan dewasa. Autoradiogram in situ dari tikus E15 menunjukkan ekspresi mRNA PST
pada level tinggi di amygdaloid, neokortikal, hippocampal, serebelum, bohlam olfaktorius dan
neuroepithelium subkhusus serta rinenfefalon anterior, semuanya yang merupakan matriks
germinal primer. Area ekspresi moderat termasuk rhinencephalon posterior dan bidang diferensiasi
neokorteks, subiculum, hippocampus, striatum, pallidum dan amygdala, area di mana neuron
bermigrasi dan berdiferensiasi.
Pemeriksaan butir perak dalam slide emulsi menegaskan ekspresi PST mRNA di seluruh
neuroepithelia dari daerah yang disebutkan di atas. Pada perbesaran tinggi, sel-sel padat dalam
neuroepithelia dapat dilihat dengan kepadatan tinggi butir perak dibandingkan dengan tingkat
moderat butir perak terlihat dalam rhinencephalon.
Pada gambar dibawah menunjukkan PST mRNA di otak tikus E15: hibridisasi in situ,yaitu:
(A) Neuroepithelium neokortikal dan
(B) Neuroepithelium striatal. keduanya mengandung kadar PST yang tinggi mRNA
(C) Autoradiogram mengungkapkan ekspresi PST yang kuat di seluruh neuroepithelia
ventrikel, seperti HIPP-N hippocampal, CTX-N kortikal, striatal. STR-N dan
rhinencephalon RE-N neuroepithelium serta mengurangi ekspresi dalam membedakan
bidang rhinencephalon (RE).

Ekspresi mRNA PST pada E18 sebagian besar terlokalisasi pada neuroepithelium amigdala,
neokorteks, hipokampus, otak kecil, bulb olfaktorius dan subkulum. Ada ekspresi mRNA PST
yang tinggi di seluruh pelat kortikal, ganglia trigeminal, dan hippocampus punggung. Bidang
pembeda dari neokorteks, striatum, pallidum dan rhinencephalon secara khusus mengurangi
ekspresi PST mRNA dibandingkan dengan E15, sedangkan bidang pembeda subikular dan
hippocampal telah mempertahankan tingkat ekspresi moderat mereka. Daerah-daerah penting dari
ekspresi mRNA PST rendah termasuk kapsul eksternal dan internal serta zona menengah
neokorteks, daerah-daerah yang mengandung serat-serat bagian tetapi sedikit neuron.
Ekspresi PST mRNA yang paling menonjol adalah di olfactory bulb, neocortex, dan
rhinencephalon neuroePithelia. Tingkat ekspresi mRNA PST yang cukup tinggi juga dapat dilihat
pada talamus hippocampus intermediate yang tepat, dentate gyrus granule cell layer (GCL).
Secara keseluruhan, ekspresi mRNA PST dalam otak tikus tampaknya berkurang oleh PD14.
Namun, tingkat ekspresi yang tinggi masih diamati pada bulbus olfaktorius, zona subependymal,
hippocampus, dan otak kecil. Tingkat ekspresi moderat tetap dalam neokorteks, colliculus inferior
dan nukleus ventral anterior thalamus (AVNT).
Dalam slide yang dicelupkan ke emulsi, ekspresi di dalam otak kecil dapat dilokalisasi ke GCL
dan juga EGL. Sehubungan dengan ekspresi dalam pembentukan hippocampal, dentate gyrus GCL
mengungkapkan ekspresi tertinggi mRNA PST, sedangkan gradien penurunan level mRNA PST
diamati dalam sel piramidal. Tanduk Ammon dari CA1 ke CA4. Juga, sel-sel hilar yang
mengekspresikan PST mRNA dapat terlihat diselingi di daerah hilus. Ekspresi kortikal dari PST
mRNA dapat dilokalisasi ke lamina II, di sebagian besar korteks dengan peningkatan yang
signifikan pada korteks oksipital dan retrospinal. Saluran sel berlabel dari zona subependymal ke
bulbus olfaktorius yang mengalir di sepanjang tepi forceps minor corpus callosum dapat dilihat di
sepanjang rute migrasi yang baru terbentuk neuron di zona subependymal. Akhirnya, dalam bulbus
olfaktori, pelabelan padat dapat dilihat dalam nukleus anterior lateral.
Ekspresi PST mRNA di PD21 berbeda dari ekspresi PD14 di sejumlah daerah. Ekspresi serebelar
dari PST mRNA terlokalisasi ke GCL sementara sel-sel EGL tidak lagi positif. Di dalam korteks
serebral, ekspresi mRNA PST menurun dibandingkan dengan PD14. Namun, tingkat ekspresi yang
tinggi dalam lamina II, terutama korteks oksipital dan retrospinal tetap ada. Gradien ekspresi dalam
formasi hippocampal tetap, dengan pengurangan ekspresi mRNA PST dari CA1 ke CA4.
Ekspresi mRNA PST otak tikus dewasa agak mirip dengan tikus PD21. Hippocampus
mengungkapkan gradien ekspresi dari yang tertinggi di dentate gyrus ke CA1, CA2, CA3 dan
terendah di CA4. Pada perbesaran yang lebih tinggi, pelabelan dapat dilihat pada GCL gyrus
dentate, sel-sel hilus dan sel-sel piramidal dari tanduk Ammon. Bulbus olfaktori mempertahankan
ekspresinya dalam nukleus anterior lateral dan dorsal seperti halnya AVNT. Ekspresi kortikal PST
mRNA tetap tinggi di lamina II di seluruh korteks, terutama tingkat tinggi di korteks oksipital.
Ekspresi di dalam zona subependymal tampak berkurang dibandingkan dengan PD14, namun,
traktat dari zona subependymal ke bohlam olfaktori mempertahankan ekspresi tinggi mRNA PST.
Akhirnya, otak kecil masih mempertahankan ekspresi mRNA PST yang tinggi dalam GCL dengan
mRNA PST di otak tikus dewasa: hibridisasi in situ:
(A) Seperti pada PD21, gradien ekspresi dalam hippocampus dapat dilihat dengan DG-GCL
dan CA1 yang mengekspresikan level tinggi PST mRNA dan penurunan ekspresi progresif
dari CA1 ke CA4.
(B) Autoradiogram mengungkapkan ekspresi mRNA PST di bagian lateral dan dorsal dari
nukleus penciuman anterior AOL dan AOD, SEZ, CTX, CE, hippocampus HIPP dan
nukleus ventral anterior AVNT thalamus.
(C) Autoradiogram kendali indera menunjukkan pengikatan oligoprobe rendah yang tidak
spesifik.

Diskusi
Pada artikel ini didapati temuan utama yaitu bahwa ekspresi mRNA PST tikus diatur dengan cara
spesifik pada regional di otak selama perkembangan sebelum dan sesudah kelahiran. Ekspresi luas
mRNA PST dalam otak embriogenik menimbulkan lokalisasi yang semakin diskrit sampai PD21,
ketika ekspresinya stabil. Selain itu, area di mana PST mRNA tampaknya terlokalisasi ke otak
tikus dewasa adalah daerah di mana dalam kebanyakan kasus PSA-NCAM terbukti bertahan.
Sejauh pengetahuan peneliti, ini adalah pemeriksaan hibridisasi in situ pertama terhadap ekspresi
PST di otak.
Urutan wilayah pengkodean tikus klon PST cDNA mengungkapkan tingkat tinggi urutan homolog
asam amino dengan PST yang dikloning sebelumnya, mulai dari 97% untuk manusia hingga 98%
untuk hamster dan tikus. Selain itu, perbedaan asam amino dalam sinyal / membran anchoring
domain atau S dan L sialyl adalah perubahan konservatif di semua spesies, dengan satu
pengecualian terjadi pada motif L PST manusia - glisin yang ada pada tikus, hamster, dan tikus
digantikan oleh glutamat pada PST manusia. Tingginya tingkat homologi menunjukkan bahwa
PST tikus yang telah kami kloning adalah homologi khusus menunjukkan bahwa sangat dilindungi
di antara spesies.
Selama masa perkembangan awal embriogenik atau dapat disingkat E15, hasil Hibridisasi in situ
adalah mengungkapkan ekspresi yang berlimpah dari PST mRNA di kortikal, hippocampal,
serebellar, amygdaloid, bulb olfaktorius dan neuroepithelium tertentu. Dalam konteks
perkembangan saraf, ekspresi neuroepithrlial ventrikel dari mRNA PST bisa menjadi hasil dari
ekspresi pada neuron sebelum atau sesudah mitosis atau sel glial radial. Namun, karena selama
tahap embriogenik awal (E15) neuroepithelium mengekspresikan mRNA PST sebelum
dimulainya migrasi saraf skala besar, pada usia ini, sel-sel pra-mitosis kemungkinan besar yang
mengekspresikan mRNA PST.
Melanjutkan ke tahap perkembangan embrionik selanjutnya. E18, neuroepithelium terus
mengekspresikan PST seperti halnya lempengan kortikal yang baru terbentuk, dengan ekspresi
moderat dalam zona menengah. Pada usia ini proliferasi sel di neuroepithelium telah melambat
sementara migrasi saraf ke plat kortikal meningkat. Sementara ekspresi mRNA PST dalam epitel
bisa pada neuron pra-mitosis yang ditemukan di lempeng kortikal dan zona antara harus dalam
neuron post-mitosis karena area ini tidak mengandung neuroblas pembagi. Oleh karena itu,
ekspresi mRNA PST di daerah-daerah ini dapat pada migrasi neuron, sedangkan penurunan kadar
mRNA PST di zona menengah dapat disebabkan oleh kepadatan sel yang lebih rendah di daerah
ini. Penjelasan alternatif adalah bahwa neuron migrasi tidak mengekspresikan level signifikan dari
PST mRNA tetapi hanya neuron yang telah mencapai tujuan akhir di dalam plat kortikal yang
mengekspresikan PST mRNA. Namun, karena neuron pra-mitosis dalam neuroepithelium dan
neuron pasca-mitosis yang telah bermigrasi ke plat kortikal mengekspresikan PST, akan
mengejutkan bagi neuron untuk secara selektif mematikan produksi mRNA PST selama migrasi.
Setelah lahir, ekspresi PST mRNA di otak tikus perlahan-lahan disempurnakan menjadi yang
terlihat pada tikus dewasa: ekspresi dalam tanduk Ammon dari hippocampus, dentate gyrus, zona
subependymal, otak kecil, AVNT, bohlam olfaktori dan lapisan II dari korteks . Salah satu area
ekspresi mRNA PST yang menonjol pada tikus neonatal adalah EGL otak kecil, yang merupakan
salah satu matriks germinal otak kecil. Ketika proliferasi sel-sel dalam lapisan ini melemahkan,
yang terjadi selama minggu kedua setelah kelahiran, demikian juga ekspresi mRNA PST. Dua area
di mana ekspresi mRNA PST bertahan hingga dewasa patut dicatat karena mereka tetap
merupakan area proliferasi dan migrasi neuron aktif, yaitu. gyrus dentate dari hippocampus dan
zona subenpedymal.
Namun, aturan umum tidak dapat diterapkan yang menghubungkan ekspresi mRNA PST dengan
proliferasi saraf dan migrasi sejak lapisan kortikal II, tanduk hippocampus Ammon dan GCL dari
otak kecil belum disarankan sebagai daerah di mana peristiwa ini berlanjut di masa dewasa.
Co-ekspresi mRNA PST tikus dan PSA-NCAM tikus selama berbagai periode perkembangan
terbukti ketika membandingkan studi imunohistokimia PSA-NCAM sebelumnya dengan ekspresi
mRNA PST. Peneliti dalan artikel ini telah menunjukkan bahwa mRNA PST diekspresikan secara
melimpah di korteks tikus E15, tetap kuat sampai minggu ke-2 pascakelahiran dan hampir tidak
ada pada neokorteks dewasa, dengan pengecualian pada lamina II. Profil perkembangan PST
mRNA dan PSA-NCAM juga konsisten dalam pembentukan hippocampal di mana keduanya
menunjukkan ekspresi embrionik difus berbeda dengan ekspresi yang lebih bijaksana dalam
lapisan sel granula dentate dewasa dan tanduk Ammon (Ammon’s Horn). Namun, ekspresi
bersama PST mRNA dan PSA-NCAM tidak mutlak. Bola penciuman yang berkembang
menunjukkan beberapa perbedaan dalam ekspresi PST dan PSA-NCAM. PSANCAM ditemukan
terutama di dalam zona marginal dan lemah di zona ventrikel bulb olfaktorius, sedangkan PST
mRNA diekspresikan pada level tinggi di zona ventrikel dengan ekspresi difus yang lebih rendah
di seluruh sisa bulb olfaktorius. Demikian pula, level PST dan PSA-NCAM dalam otak kecil yang
sedang berkembang berhubungan dengan GCL tetapi tidak dengan EGL, yang mengekspresikan
PST tetapi bukan PSA-NCAM. Selain itu, perbedaan cytoarchitectural terlihat dalam neokorteks
sebagai PSA-NCAM terutama tidak ada dari lempeng kortikal area ekspresi mRNA PST yang
kuat.
Pada otak orang dewasa, PST diekspresikan terutama dalam pembentukan hippocampal, bohlam
penciuman, AVNT, serebelum dan lamina II dari korteks. Oleh karena itu, dengan beberapa
pengecualian, ekspresi mRNA dan PSANCAM PST juga dapat dilokalisasi di otak tikus dewasa.
Ekspresi mRNA PST dalam hippocampus dewasa konsisten dengan PSA-NCAM di mana
keduanya terlihat di lapisan sel granat dentate, suatu daerah, yang mampu melanjutkan pengaturan
ulang sinaptik. Jika PST adalah enzim utama yang bertanggung jawab untuk PSA-NCAM, maka
ekspresi PST dalam seluruh tanduk Ammon dari hippocampus kemungkinan besar mencerminkan
ekspresi PSA-NCAM yang dilaporkan dalam fimbria, sedangkan ekspresi di dalam hilus bisa
disebabkan oleh salah satu dari keduanya. sel granul yang baru dihasilkan atau neuron hilar yang
keduanya mengekspresikan PSA-NCAM.
Ketidakcocokan potensial dalam ekspresi PSA-NCAM dengan PST mRNA juga dicatat. Ekspresi
mRNA PST sangat tinggi di dalam otak kecil dewasa. Meskipun PSA-NCAM sangat hadir dalam
otak kecil pada berbagai tahap perkembangan, diekspresikan baik dalam neuroepithelium dan
GCL, biasanya tidak terlihat pada otak kecil tikus dewasa. Satu pengecualian penting dilaporkan
oleh Zuber et al, yang menemukan PSA-NCAM dalam lapisan molekul otak kecil baik oleh
Western blot dan imunohistokimia. Oleh karena itu, ekspresi mRNA PST dalam GCL dapat
mencerminkan PSA-NCAM yang diekspresikan pada proyeksi sel granul ke lapisan molekul.
Ketidakcocokan lebih lanjut terjadi di dalam korteks, di mana mRNA PST diekspresikan dalam
tingkat sedang dalam lamina II, di seluruh wilayah kortikal. Namun, secara imunohistologis satu-
satunya temuan positif PSA-NCAM di korteks, terlokalisasi pada cingulate gyrus. Ketidakcocokan
dalam ekspresi PST mRNA dan PSA-NCAM dapat dihasilkan oleh regulasi terjemahan mRNA
PST atau regulasi aktivitas enzim PST. Dengan demikian, telah ditunjukkan pada ganglia ciliary
bahwa ekspresi mRNA PST selama sinaptogenesis mungkin tidak sejajar dengan ekspresi PSA-
NCAM, mungkin karena aktivitas enzim yang diatur oleh simpanan kalsium intraseluler. Namun,
penjelasan alternatif untuk beberapa ketidaksesuaian semu yang terlihat antara ekspresi PSA-
NCAM dan mRNA PST, juga harus mencakup kemungkinan bahwa PST dapat melakukan
polisialilasi protein selain NCAM.
Namun, sampai saat ini hanya sedikit yang diketahui tentang mekanisme polisialilasi NCAM.
Metode yang tersedia untuk mempelajari fungsi PSA-NCAM dan mekanisme polysialylation
NCAM telah terbatas pada endoneuraminidase-N, enzim yang membelah residu asam sialat dari
antibodi PSA-NCAM khusus untuk PSA-NCAM dan KO dari ekspresi NCAM. Baru-baru ini,
kemajuan yang signifikan telah dibuat dengan kloning PST dan STX, dua polysialyltransferases
yang saat ini dianggap cukup untuk mengkatalisasi penambahan PSA ke NCAM, yang telah
menyediakan metode lebih lanjut untuk menganalisis regulasi pengembangan PSA-NCAM.
Kloning kedua gen ini juga menyebabkan pertanyaan mengenai kontribusi relatif mereka dalam
regulasi perkembangan ekspresi PSA-NCAM di otak. Sehubungan dengan keadaan penyakit,
seperti skizofrenia, di mana perubahan PSA-NCAM telah ditemukan, penting untuk sepenuhnya
memahami fungsi dan kontribusi dari dua sialyltransferase sehingga mekanisme yang mendasari
tingkat PSA-NCAM yang abnormal dapat dipahami. Kami telah menunjukkan bahwa mRNA PST
tikus diatur secara perkembangan dengan cara spesifik wilayah yang menempatkannya pada posisi
temporal dan spasial yang tepat untuk mengambil bagian dalam regulasi PSA-NCAM selama
perkembangan otak normal maupun abnormal. Namun, ekspresi mRNA dan PSA-NCAM PST
tidak dapat dikorelasikan dalam semua struktur yang menunjukkan fungsi alternatif enzim atau
metode kompleks untuk mengendalikannya.